Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर का उपयोग करके पूर्व विवो ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क में मोनोकार्बोक्सिलेट्स और अन्य प्रासंगिक चयापचयों की कल्पना करना

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65846
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1,3
1Biomedical Neuroscience Institute, Universidad de Chile, 2Advanced Scientific Equipment Network (REDECA), Faculty of Medicine, Universidad de Chile, 3Department of Neuroscience, Faculty of Medicine, Universidad de Chile

Summary

यहाँ हम एक पूर्व विवो ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क की तैयारी में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फोर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण आधारित सेंसर का उपयोग कर ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में monocarboxylates, ग्लूकोज और एटीपी के परिवहन कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

विद्युत गतिविधि के कारण दिमाग की उच्च ऊर्जा आवश्यकताएं उनकी सबसे विशिष्ट विशेषताओं में से एक हैं। इन आवश्यकताओं को ग्लूकोज और इसके चयापचयों से एटीपी के उत्पादन से पूरा किया जाता है, जैसे कि मोनोकार्बोक्सिलेट्स लैक्टेट और पाइरूवेट। यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि इस प्रक्रिया को कैसे विनियमित किया जाता है या प्रमुख खिलाड़ी कौन हैं, खासकर ड्रोसोफिला में।

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फोर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण-आधारित सेंसर का उपयोग करते हुए, हम एक पूर्व-विवो ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क की तैयारी में ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में मोनोकार्बोक्सिलेट्स और ग्लूकोज के परिवहन को मापने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे काटना और एक ग्लास coverslip करने के लिए सेंसर में से एक व्यक्त एक लार्वा मस्तिष्क का पालन करने के लिए.

हम एक पूरे प्रयोग के परिणाम प्रस्तुत करते हैं जिसमें ग्लियल कोशिकाओं में पहले से पहचाने गए मोनोकारबॉक्साइलेट ट्रांसपोर्टरों को खटखटाकर लार्वा दिमाग में लैक्टेट परिवहन को मापा गया था। इसके अलावा, हम प्रदर्शित करते हैं कि न्यूरोनल गतिविधि को तेजी से कैसे बढ़ाया जाए और सक्रिय मस्तिष्क में मेटाबोलाइट परिवर्तनों को कैसे ट्रैक किया जाए। वर्णित विधि, जो सभी आवश्यक जानकारी प्रदान करती है, का उपयोग अन्य ड्रोसोफिला जीवित ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

मस्तिष्क न्यूरोनल इलेक्ट्रिक सिग्नल पीढ़ी और संचरण, साथ ही synaptic संचरण 1,2 की वजह से न्यूरॉन्स में आयन ढाल बहाल करने की उच्च लागत के कारण उच्च ऊर्जा आवश्यकताओं है. इस उच्च ऊर्जा की मांग को लंबे समय से एटीपी3 का उत्पादन करने के लिए ग्लूकोज के निरंतर ऑक्सीकरण द्वारा पूरा किया जाना माना जाता है। रक्त-मस्तिष्क बाधा पर विशिष्ट ट्रांसपोर्टर रक्त में ग्लूकोज को मस्तिष्क में स्थानांतरित करते हैं। लगातार ग्लाइसेमिक स्तर यह सुनिश्चित करते हैं कि मस्तिष्क को ग्लूकोज की स्थिर आपूर्ति प्राप्त होतीहै 4. दिलचस्प है, बढ़ते प्रयोगात्मक सबूत बताते हैं कि ग्लूकोज चयापचय से प्राप्त अणुओं, जैसे लैक्टेट और पाइरूवेट, मस्तिष्क कोशिकाओं के ऊर्जा उत्पादन 5,6 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, वहाँ अभी भी कैसे महत्वपूर्ण इन अणुओं ऊर्जा उत्पादन के लिए कर रहे हैं और मस्तिष्क में कौन सी कोशिकाओं का उत्पादन या उन्हें 7,8 का उपयोग के बारे में कुछ बहस है. इस कार्य के लिए आवश्यक उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ उपयुक्त आणविक उपकरणों की कमी एक महत्वपूर्ण मुद्दा है जिसने इस विवाद को पूरी तरह से हल होने से रोका है।

कई इंजीनियर फ्लोरोसेंट चयापचय सेंसर के विकास और अनुप्रयोग के परिणामस्वरूप हमारी समझ में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है कि मेटाबोलाइट्स का उत्पादन और उपयोग कैसे किया जाता है, साथ ही साथ बेसल और उच्च न्यूरोनल गतिविधि9 के दौरान चयापचय प्रवाह कैसे होता है। फॉरस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) माइक्रोस्कोपी, जैसे ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (ग्लूकोज), लैकोनिक (लैक्टेट), और पायरोनिक (पाइरूवेट) पर आधारित आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड चयापचय सेंसर ने मस्तिष्क ऊर्जा चयापचय 10,11,12,13की हमारी समझ में योगदान दिया है। हालांकि, जीवित जानवरों या ऊतकों पर प्रयोग करने के लिए आवश्यक उच्च लागत और परिष्कृत उपकरणों के कारण, कशेरुक मॉडल में परिणाम अभी भी मुख्य रूप से सेल संस्कृतियों (ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स) तक सीमित हैं।

इन सेंसरों को व्यक्त करने के लिए ड्रोसोफिला मॉडल के उभरते उपयोग से पता चला है कि प्रमुख चयापचय विशेषताओं को प्रजातियों में संरक्षित किया जाता है और उनके कार्य को इस उपकरण के साथ आसानी से संबोधित किया जा सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि ड्रोसोफिला मॉडल ने इस बात पर प्रकाश डाला है कि फ्लाई मस्तिष्क में ग्लूकोज और लैक्टेट / पाइरूवेट को कैसे ले जाया जाता है और चयापचय किया जाता है, मोनोकार्बोक्सिलेट खपत और स्मृति गठन के बीच की कड़ी, और तंत्रिका गतिविधि और चयापचय प्रवाह में वृद्धि कैसे होती है इसका उल्लेखनीय प्रदर्शन 14,15,16,17. विधि मोनोcarboxylate को मापने के लिए यहाँ प्रस्तुत, ग्लूकोज, और लार्वा मस्तिष्क में व्यक्त आनुवंशिक एन्कोडेड झल्लाहट सेंसर का उपयोग कर एटीपी स्तर शोधकर्ताओं कैसे ड्रोसोफिला के मस्तिष्क ऊर्जा का उपयोग करता है के बारे में अधिक जानने के लिए अनुमति देता है, जो अन्य जानवरों के दिमाग के लिए लागू किया जा सकता है.

हम दिखाते हैं कि यह विधि ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में लैक्टेट और ग्लूकोज का पता लगाने के लिए प्रभावी है, और यह कि एक मोनोकार्बोक्सिलेट ट्रांसपोर्टर (चास्की) ग्लियल कोशिकाओं में लैक्टेट आयात में शामिल है। हम बढ़ी हुई न्यूरोनल गतिविधि के दौरान मेटाबोलाइट परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक सरल विधि भी प्रदर्शित करते हैं, जिसे आसानी से गाबाए रिसेप्टर विरोधी के स्नान आवेदन से प्रेरित किया जा सकता है। अंत में, हम दिखाते हैं कि इस पद्धति का उपयोग वसा निकायों जैसे अन्य चयापचय रूप से महत्वपूर्ण ऊतकों में मोनोकार्बोक्सिलेट और ग्लूकोज परिवहन को मापने के लिए किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. फ्लाई स्ट्रेन रखरखाव और लार्वा सिंक्रनाइज़ेशन

  1. इन प्रयोगों को करने के लिए, 10% खमीर, 8% ग्लूकोज, 5% गेहूं का आटा, 1.1% अगर, 0.6% प्रोपियोनिक एसिड, और 1.5% मिथाइलपरबेन से बना मानक ड्रोसोफिला भोजन पर 25 डिग्री सेल्सियस पर उठाए गए फ्लाई संस्कृतियों का उपयोग करें।
  2. इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, निम्न पंक्तियों का उपयोग करें: w1118 (प्रायोगिक नियंत्रण पृष्ठभूमि), OK6-GAL4 (मोटर न्यूरॉन्स के लिए ड्राइवर), रेपो-GAL4 (सभी ग्लियल कोशिकाओं के लिए ड्राइवर), CG-GAL4 (वसा निकायों के लिए ड्राइवर), UAS-Pyronic (पाइरूवेट सेंसर), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (ग्लूकोज सेंसर), UAS-लैकोनिक (लैक्टेट सेंसर), UAS-GCaMP6f (कैल्शियम सेंसर), UAS-AT1.03NL (ATP सेंसर) और UAS-Chk RNAi GD1829। सेंसर या आरएनएआई व्यक्त करने वाली सभी लाइनें डब्ल्यू1118 आनुवंशिक पृष्ठभूमि में हैं।
  3. सिंक्रनाइज़ तीसरे इंस्टार भटकने लार्वा प्राप्त करने के लिए, अंडे देने वाले कक्ष में वांछित आनुवंशिक क्रॉस के 300 मक्खियों (3-5 दिन पुराने, 100 नर, 200 कुंवारी मादाओं) को रखें, जिसमें फॉस्फेट-बफर खारा समाधान (पीबीएस) में 1% एगरोज के साथ कवर 60 मिमी पेट्री डिश शामिल है। मक्खियों को अंडे देने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए पट्टिका के केंद्र में तरल/मलाईदार खमीर (1.5 सेमी व्यास) की एक बूंद रखें।
  4. मक्खियों को 3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें, अगारोज पेट्री डिश को एक ताजा और ताजा भंग खमीर के साथ दो बार दैनिक रूप से बदलें।
  5. मक्खियों पेट्री डिश बदलने से पहले चौथे दिन पर 4 घंटे के लिए अंडे देने के लिए अनुमति दें. इस पट्टिका को हटा दें। फिर, 3 घंटे के लिए, मक्खियों ताजा भंग खमीर के साथ एक नए agarose पट्टिका में अंडे देने के लिए अनुमति देते हैं. प्रयोगों में इन लार्वा का प्रयोग करें.
  6. 3 घंटे के बाद, अंडे युक्त पट्टिका को हटा दें और इसे 24 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  7. इस पट्टिका (लार्वा हैचिंग के बाद 0 घंटे) से 50 से 100 नव रचित लार्वा लीजिए और उन्हें मानक भोजन युक्त प्लास्टिक की शीशी में जगह है. लार्वा को ठीक से खिलाने की अनुमति देने के लिए, सुनिश्चित करें कि भोजन जमीन और नरम है। स्थानांतरण के बाद लार्वा 96 घंटे का प्रयोग करें।

2. पॉली-एल-लाइसिन के साथ ग्लास कवरस्लिप बनाएं

  1. लार्वा विच्छेदन से पहले इस चरण 1 घंटे करें। एक 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में, जगह 25 मिमी कांच coverslips (कवर का व्यास इस्तेमाल किया जा करने के लिए खुर्दबीन में उपलब्ध रिकॉर्डिंग कक्ष पर निर्भर करता है).
  2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र में पाली-एल-लाइसिन की एक बूंद (300 माइक्रोन) रखें।
  3. आसुत जल के साथ प्रत्येक coverslip 3x धो लें, तो सीए2 + से रहित एक खारा समाधान के साथ 2x (लार्वा काटना करने के लिए इस्तेमाल किया एक ही समाधान, 3.2 कदम देखें). रिकॉर्डिंग कक्ष में कवर स्थापित करें और इसे सीए2+-मुक्त खारा समाधान के साथ भरें।
    नोट: हालांकि लार्वा मस्तिष्क सीधे ग्लास कवरस्लिप का पालन कर सकता है, आसंजन कमजोर है, और मस्तिष्क कभी-कभी खारा समाधान के निरंतर प्रवाह के कारण प्रयोग के दौरान चलता है या विस्थापित करता है। पॉली-एल-लाइसिन कदम के अलावा धोने के परिणामस्वरूप आंदोलनों या यहां तक कि मस्तिष्क के नुकसान का खतरा कम हो जाता है।

3. उदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC) और वसा निकायों (FBs) काटना

  1. वांछित आनुवंशिक पार (चरण 1.7 से) से भटकते तीसरे-इंस्टार लार्वा को इकट्ठा करें और उन्हें आसुत जल के साथ 3x अच्छी तरह से धो लें।
  2. लार्वा को एक ग्लास विच्छेदन डिश में अच्छी तरह से रखें जिसमें नाममात्र शून्य सीए2+ बर्फ-ठंडा खारा समाधान 128 एमएम एनएसीएल, 2 एमएम केसीएल, 4 एमएम एमजीसीएल2, 5 एमएम ट्रेहलोज, 5 एमएम एचईपीईएस, और 35 एमएम सुक्रोज (पीएच = 6.7, पीएच मीटर के साथ मापा जाता है और 1 एम एनएओएच और एचसीएल 37% वी / वी के साथ समायोजित) से बना होता है।
    नोट: पीएच को 6.7 पर सेट करना महत्वपूर्ण है क्योंकि, जैसा कि पहले देखा गया है, मोनोकार्बोक्सिलेट परिवहन समाधान के पीएच पर अत्यधिक निर्भर है। इसके अलावा, 6.7 एक तिहाई इंस्टार लार्वा17,18 के हेमोलिम्फ में पीएच से मेल खाती है।
  3. एक stereomicroscope के तहत लार्वा प्लेस और संदंश की एक जोड़ी के साथ पेट के पीछे भर में एक अनुप्रस्थ कटौती करते हैं.
  4. बाहर अंदर लार्वा मोड़ जबकि संदंश के साथ जबड़े पुश.
  5. जबड़े के बगल में उदर तंत्रिका कॉर्ड (वीएनसी) का निरीक्षण करें। ध्यान से काल्पनिक डिस्क और शेष मस्तिष्क-दुम के ऊतकों को हटा दें।
  6. नसों को काटकर ऊतक के बाकी हिस्सों से केंद्रीय मस्तिष्क और ऑप्टिक लोब के साथ वीएनसी को अलग करें। वीएनसी को स्थानांतरित करें, इसे शेष नसों से संदंश के साथ उठाएं, और इसे सीए2+-मुक्त रिकॉर्डिंग समाधान (चरण 3.2 से एक ही समाधान) युक्त रिकॉर्डिंग कक्ष में रखें। वीएनसी तुरंत कवरस्लिप का पालन करेंगे।
  7. शेष नसों से हस्तक्षेप से बचने के लिए, उन्हें संदंश का उपयोग कर coverslip के तल पर संलग्न (नसों भी इस्तेमाल किया चालक लाइन के आधार पर फ्लोरोसेंट हो जाएगा)(चित्रा 2).
  8. प्रयोगों के एक और सेट में ग्लूकोज या मोनोकार्बोक्सिलेट परिवहन को मापने वाले वसा निकायों (एफबी) में प्रयोग करने के लिए, चरण 3.1-3.4 के बाद ऊतकों को अलग करने के लिए आगे बढ़ें। एक बार लार्वा अंदर बाहर हो जाने के बाद, ध्यान दें कि एफबी एक सफेद, द्विपक्षीय, सपाट ऊतक है।
  9. सीए2+ के बिना रिकॉर्डिंग समाधान युक्त रिकॉर्डिंग कक्ष में झल्लाहट सेंसर (उपयुक्त ड्राइवरों का उपयोग कर एक आनुवंशिक पार से प्राप्त) व्यक्त पृथक FBs रखें.
    नोट: एफबी अत्यधिक हाइड्रोफोबिक है (यह समाधान की सतह पर तैरने के लिए जाता है) और संदंश के साथ हेरफेर के लिए बेहद कमजोर है, इसे देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। इस ऊतक के किसी भी किसी न किसी हैंडलिंग मृत कोशिकाओं में बाद में (सेंसर की एक कम प्रतिदीप्ति के साथ) परिणाम होगा.
  10. माइक्रोस्कोप चरण पर वीएनसी/एफबी युक्त रिकॉर्डिंग कक्ष रखें।

4. लाइव सेल इमेजिंग

  1. सेंसर व्यक्त ऊतक की छवियों को प्राप्त करने के लिए, एक उत्सर्जन विभाजन प्रणाली और एक सीसीडी कैमरा के लिए युग्मित एक ईमानदार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. किसी भी प्रयोग शुरू करने से पहले माइक्रोस्कोप 30 मिनट की रोशनी प्रणाली चालू करें।
    नोट: यहां हम वीएनसी और एफबी दोनों का निरीक्षण करने के लिए 20x/0.5 जल विसर्जन उद्देश्य से लैस स्पिनिंग डिस्क प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं। चित्रा 2 भी 40x/0.8 जल विसर्जन उद्देश्य के उपयोग को दर्शाता है।
  2. GCaMP6f प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए, क्रमशः 488 एनएम और 540 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य सेट. लैकोनिक/पायरोनिक/एटीपी/ग्लूकोज सेंसर के लिए, उत्तेजना तरंग दैर्ध्य को 440 एनएम और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को 488 एनएम (एमटीएफपी, सीएफपी) और 540 एनएम (शुक्र, वाईएफपी) पर सेट करें।
  3. GCaMP512f के लिए प्रत्येक 2 s में 512 x 512 पिक्सेल आकार की छवियों को प्राप्त करें और लैकोनिक/पायरोनिक/ATP/ग्लूकोज सेंसर के लिए प्रत्येक 10-30 s की छवियों को प्राप्त करें। प्राप्त छवि की गुणवत्ता को देखते हुए प्रकाश स्रोत के लिए इष्टतम जोखिम निर्धारित करें। इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, सुनिश्चित करें कि छवियां लैकोनिक और पायरोनिक सेंसर के लिए 300 एमएस एक्सपोजर और ग्लूकोज और एटीपी सेंसर के लिए 100-150 एमएस की हैं।
    नोट: एक्सपोजर एक फोकल या सामान्य प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के उपयोग के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  4. एक बार रिकॉर्डिंग कक्ष खुर्दबीन के चरण में स्थापित किया गया है, ध्यान से पानी विसर्जन उद्देश्य जगह और उद्देश्य प्रयोग भर में जलमग्न रहता है कि सुनिश्चित करें. कमरे का तापमान 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  5. रिकॉर्डिंग कक्ष को एक छिड़काव प्रणाली से कनेक्ट करें और ऊतकों को 128 मिमी NaCl, 2 मिमी KCl, 1.5 मिमी CaCl2, 4 मिमी MgCl2, 5 मिमी ट्रेहलोज, 5 मिमी HEPES, और 35 मिमी सुक्रोज, पीएच 6.7 (पीएच मीटर के साथ मापा जाता है और NaOH और एचसीएल के साथ समायोजित) युक्त रिकॉर्डिंग समाधान में नहाया हुआ रखता है।
  6. गुरुत्वाकर्षण का उपयोग कर ऊतक के माध्यम से रिकॉर्डिंग समाधान के 3 एमएल/मिनट के एक निरंतर प्रवाह को बनाए रखें, एक कम प्रवाह क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए युग्मित मात्रा स्थिर रखते हुए चैम्बर से तरल निकालने के लिए. आवश्यक प्रवाह को प्राप्त करने के लिए, समाधान युक्त ट्यूबों (50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब) को माइक्रोस्कोप चरण से 25 सेमी ऊपर रखें।
    नोट: इस गुरुत्वाकर्षण-संचालित प्रवाह का उपयोग क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंपों के कारण ऊतक आंदोलन को रोकने के लिए किया जाता है, जिससे बाद में अधिक सटीक छवि विश्लेषण की अनुमति मिलती है।
  7. किसी भी उत्तेजना से पहले, सेंसर से प्रतिदीप्ति की एक स्थिर आधार रेखा प्राप्त करने के लिए 5-10 मिनट के लिए बहने रिकॉर्डिंग समाधान बनाए रखें. इस आधार रेखा को प्राप्त करने के लिए आवश्यक अवधि परिवर्तित करें।
  8. वीएनसी/एफबीएस को उत्तेजित करने के लिए 5 मिनट के लिए उत्तेजना समाधान के साथ बहने वाले समाधान को बदलें (खारा समाधान में भंग प्रत्येक प्रयोग के लिए वर्णित एकाग्रता पर ग्लूकोज, पाइरूवेट या लैक्टेट के साथ; प्रत्येक आंकड़ा देखें)।
    नोट: उत्तेजना की अवधि प्रयोग की जरूरतों के अनुसार भिन्न हो सकती है (उदाहरण के लिए, ग्लूकोज दालों को न्यूरॉन्स में एक पठार तक पहुंचने के लिए 10 मिनट तक बढ़ाया जा सकता है, जैसा कि पहले16 बताया गया था)।
  9. उत्तेजना समाधान में परासरण बनाए रखने के लिए, मोनोकार्बोक्सिलेट या ग्लूकोज की एकाग्रता के अनुसार सुक्रोज एकाग्रता ( ड्रोसोफिला मस्तिष्क द्वारा एक कार्बोहाइड्रेट गैर-चयापचय योग्य) को सुधारें।
  10. वाल्वों की एक सरल प्रणाली का उपयोग करके समाधान बदलें। खुर्दबीन चरण स्थानांतरित करने के लिए नहीं सावधान रहें.
  11. न्यूरोनल गतिविधि को उत्तेजित करने के लिए वीएनसी को 80 माइक्रोन पिक्रोटॉक्सिन (पीटीएक्स, लगातार बह रहा है) का पर्दाफाश करें। यह प्रक्रिया सीए2+ दोलनों की आवृत्ति को बढ़ाती है, जिससे चयापचय संबंधी प्रासंगिक अणुओं (जैसे, इंट्रासेल्युलर एटीपी) में परिवर्तन का निरीक्षण करना संभव हो जाता है।
  12. किसी भी प्रयोग के अंत में, अच्छी तरह से इस्तेमाल किया समाधान के किसी भी निशान को खत्म करने के लिए आसुत जल के साथ कम से कम 10 मिनट के लिए, ट्यूबों और रिकॉर्डिंग कक्ष सहित पूरा प्रवाह प्रणाली धो लें.

5. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण

  1. प्राप्त छवियों को संसाधित करने के लिए, चित्र 3 में दिखाए गए चरणों के साथ आगे बढ़ें।
  2. छवि (लैकोनिक) को ImageJ सॉफ़्टवेयर में आयात करें। छवि में नमूने के दो दृश्य हैं: बाईं ओर एक mTFP संकेत है और दाईं ओर एक शुक्र संकेत है। एक क्षेत्र है कि कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा करने के लिए शामिल हैं और एक नई विंडो में इन छवियों (mTFP और शुक्र) को अलग का चयन करें. सुनिश्चित करें कि इन छवियों में बिल्कुल समान क्षेत्र है।
  3. पंजीकरण प्लगइन खोलें और ऊतक के छोटे बहाव को सही करें जो सामान्य रूप से फ़ंक्शन कठोर शरीर के साथ प्रयोग में मनाया जाता है। इसे दोनों छवियों (mTFP और शुक्र) में करें।
  4. एमटीएफपी सिग्नल (488 एनएम) में संबंधित 10 कोशिकाओं के साइटोसोल में ब्याज के कम से कम 10 क्षेत्रों (आरओआई) का चयन करें और शुक्र (540 एनएम) छवि में चयन स्थानांतरित करें।
  5. विश्लेषण किया जा रहा कोशिकाओं के करीब दो या तीन आरओआई का चयन करें, लेकिन कोई स्पष्ट संकेत के साथ (हमेशा वीएनसी या ऊतक का विश्लेषण किया, चित्रा 3 देखें)। ये पृष्ठभूमि आरओआई हैं।
  6. दोनों छवियों में चयनित आरओआई के साथ, फ़ंक्शन माप का उपयोग करके प्रत्येक सिग्नल का औसत ग्रे मान प्राप्त करें। डेटा को डेटा शीट में स्थानांतरित करें और प्रत्येक सिग्नल के लिए औसत पृष्ठभूमि मान घटाएं।
  7. शुक्र पर mTFP प्रतिदीप्ति अनुपात (लैकोनिक और पायरोनिक के लिए) निर्धारित करें। इस मान की गणना यहां वर्णित अन्य झल्लाहट सेंसर की तुलना में अलग तरह से की जाती है (जहां अनुपात आमतौर पर YFP/CFP होता है) क्योंकि जब उनके संबंधित सब्सट्रेट से बंधे होते हैं, तो लैकोनिक और पायरोनिक दोनों अपनी झल्लाहट क्षमता को कम करते हैं।
  8. आधार रेखा द्वारा प्रत्येक रिकॉर्ड किए गए मूल्य को विभाजित करने वाले डेटा को सामान्य करें। एक अलग डाटा शीट में, उत्तेजना से पहले 2 मिनट के दौरान mTFP/शुक्र अनुपात का मतलब मूल्य लेने के द्वारा आधार रेखा की गणना.
  9. झल्लाहट आधारित सेंसर का उपयोग कर ग्लूकोज और एटीपी माप के लिए, YFP/CFP अनुपात की गणना, और चरण 5.8 में वर्णित के रूप में डेटा सामान्यीकरण.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1 घंटे तक, यह प्रक्रिया मोनोकारबॉक्साइलेट और ग्लूकोज सेंसर के प्रतिदीप्ति में इंट्रासेल्युलर परिवर्तनों के आसान माप की अनुमति देती है। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, ग्लियल कोशिकाओं और मोटर न्यूरॉन्स दोनों में लैकोनिक सेंसर नाड़ी की शुरुआत में एक समान दर पर 1 एमएम लैक्टेट का जवाब देते हैं, लेकिन मोटर न्यूरॉन्स 5 मिनट नाड़ी के दौरान बेसलाइन पर उच्च वृद्धि तक पहुंचते हैं, जैसा कि पहले17 दिखाया गया था। इस लैक्टेट एकाग्रता को चुना गया था क्योंकि यह तीसरे-इंस्टार लार्वा के हेमोलिम्फ में पाए जाने वाले स्तरों के बराबर है। इसी तरह, जब वीएनसी-व्यक्त ग्लूकोज सेंसर 5 एमएम ग्लूकोज (हमारे और अन्य19 द्वारा हेमोलिम्फ में मापा गया मूल्य के समान मूल्य) के संपर्क में थे, तो सेंसर का संकेत ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में समान दर से बढ़ गया। ग्लूकोज पल्स के दौरान, हालांकि, न्यूरॉन्स में संकेत ग्लियल कोशिकाओं की तुलना में अधिक बढ़ जाता है। यह इसी तरह झल्लाहट सेंसर व्यक्त तैयारी16 के पिछले अवलोकनों के अनुरूप है.

इस तैयारी का उपयोग ड्रोसोफिला ग्लियल कोशिकाओं या न्यूरॉन्स20 में व्यक्त अवर्णित मोनोकार्बोक्सिलेट और ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों पर प्रयोग करने के लिए किया जा सकता है। यहां हम यह दिखाने के लिए आरएनए-हस्तक्षेप के उपयोग का उदाहरण देते हैं कि चास्की (सीएचके), जो पहले विषम कोशिकाओं में मोनोकार्बोक्सिलेट्स के परिवहन के लिए जाना जाता था, ग्लियल कोशिकाओं (चित्रा 5) में लैक्टेट को स्थानांतरित करता है। पोषण प्रतिबंध शर्तों के तहत, इस ट्रांसपोर्टर पशु शरीर क्रिया विज्ञान और व्यवहार21 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा के रूप में वर्णित किया गया था. हमने पाया कि ग्लियल कोशिकाओं में, सीएचके को खटखटाने से 1 एमएम लैक्टेट(चित्रा 5)के संपर्क में आने वाले नियंत्रण वीएनसी की तुलना में लैक्टेट परिवहन कम हो गया। अन्य ख्यात ट्रांसपोर्टरों को यह देखने के लिए परीक्षण किया जा सकता है कि क्या वे शारीरिक और रोग स्थितियों में चयापचयों का परिवहन कर सकते हैं।

न्यूरोनल गतिविधि से जुड़े चयापचय परिवर्तनों के अध्ययन को संबोधित करने के लिए, हमने ऑप्टोजेनेटिक्स जैसी तकनीकी रूप से जटिल प्रक्रियाओं का उपयोग किए बिना न्यूरोनल गतिविधि को बढ़ाने के लिए एक सरल विधि विकसित की, जो झल्लाहट सेंसर माप(चित्रा 6)में हस्तक्षेप कर सकती है। पृथक VNC Picrotoxin के संपर्क में था (PTX), एक ज्ञात गाबाएक रिसेप्टर विरोधी पहले हमारे औरदूसरों 17,22 द्वारा इस्तेमाल किया. इस्तेमाल की एकाग्रता न्यूरॉन्स में कैल्शियम दोलनों की आवृत्ति बढ़ जाती है (GCaMP6f प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के रूप में मापा जाता है) के रूप में अच्छी तरह से ग्लूकोज की तरह चयापचय प्रासंगिक अणुओं में महत्वपूर्ण परिवर्तन, लैक्टेट, और पाइरूवेट17. इसके अलावा, न्यूरोनल गतिविधि में पीटीएक्स-प्रेरित वृद्धि के परिणामस्वरूप मोटर न्यूरॉन्स के सोमा में एटीपी के स्तर में क्षणभंगुर गिरावट आती है। इस घटना को पहले कशेरुक मॉडल में वर्णित किया गया है जिसमें न्यूरोनल गतिविधि विद्युत उत्तेजना के माध्यम से या गाबाए रिसेप्टर विरोधी 23,24का उपयोग करके बढ़ाई गई थी। नतीजतन, इस मॉडल का उपयोग न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट में चयापचय परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है, जो ऊर्जा से संबंधित ट्रांसपोर्टरों की आवश्यकता को संबोधित करते हैं जो उच्च न्यूरोनल गतिविधि के दौरान एटीपी उत्पादन में योगदान करते हैं।

ग्लूकोज और मोनोकार्बोक्सिलेट परिवहन मस्तिष्क के अलावा ऊतकों या कोशिकाओं में भी महत्वपूर्ण हैं। हम यहाँ मोनोcarboxylate के दृश्य दिखाने (लैक्टेट / pyruvate) और वसा निकायों में ग्लूकोज तेज, एक चयापचय प्रासंगिक लार्वा और वयस्क मक्खी है कि लिपिड भंडारण और चयापचय25 के रूप में कई महत्वपूर्ण कार्य करता है में मौजूद ऊतक. लैकोनिक सेंसर अच्छी तरह से चित्रा 7 में दिखाया गया है, जहां लिपिड बूंदों सेल के भीतर छोटे काले क्षेत्रों के रूप में देखा जा सकता है, एफबी में व्यक्त की है. यह पृथक ऊतक पॉली-एल-लाइसिन-लेपित कवरस्लिप का अच्छी तरह से पालन करता है, जो दीर्घकालिक सेल इमेजिंग प्रक्रिया की अनुमति देता है जो विश्लेषण करना भी आसान है। हमने ग्लूकोज सेंसर की प्रतिदीप्ति में उल्लेखनीय वृद्धि देखी जब एफबी ग्लूकोज सांद्रता (लगभग 5 मिमी) बढ़ाने के संपर्क में था, जो हेमोलिम्फ में पाए जाने वाले ग्लूकोज एकाग्रता के करीब है। ग्लूकोज (10 मिमी) की उच्च सांद्रता के आगे संपर्क में आने से सेंसर प्रतिदीप्ति में अपेक्षित वृद्धि नहीं होती है। अंत में, एफबी में, हम लैक्टेट और पाइरूवेट आयात (चित्रा 7 सी, डी) को मापने में सक्षम थे। इस मामले में, लैक्टेट और पाइरूवेट सांद्रता बढ़ाने से लैकोनिक और पायरोनिक प्रतिदीप्ति (0.1 से 1 मिमी तक) में आनुपातिक वृद्धि होती है। उच्च मोनोकार्बोक्सिलेट सांद्रता के परिणामस्वरूप कोशिकाओं के अंदर सिग्नल संतृप्ति होती है।

Figure 1
चित्रा 1: ड्रोसोफिला लार्वा का सिंक्रनाइज़ेशन। लार्वा सिंक्रनाइज़ेशन प्रक्रिया को रेखांकन रूप से दर्शाया गया है। प्रक्रिया शुरू होने से दो घंटे पहले, 1% agarose प्लेटों को तैयार किया जाना चाहिए और दिन 4 तक दैनिक दो बार बदलना चाहिए। हैचिंग लार्वा को देखभाल के साथ एकत्र किया जाना चाहिए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पृथक ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क लैक्टेट सेंसर लैकोनिक व्यक्त. (ए) एक पृथक ड्रोसोफिला तीसरे-इंस्टार लार्वा के अलग वीएनसी की एक प्रतिनिधि छवि एक पॉली-एल-लाइसिन-लेपित कवरस्लिप का पालन करती है और मोटर न्यूरॉन्स (ओके 6-जीएएल 4) में लैक्टेट सेंसर लैकोनिक व्यक्त करती है। छवियों VNC (बाएं) और सेंसर के mTFP प्रतिदीप्ति (मध्य पैनल) एक 20x पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ कब्जा कर लिया की एक brightfield छवि दिखा. निचले पैनल में छवियां उसी VNC की हैं जो 40x जल विसर्जन उद्देश्य के साथ ली गई हैं। (बी) एक वीएनसी से मोटर न्यूरॉन्स लैकोनिक लैक्टेट सेंसर (ओके 6>लैकोनिक) को शून्य-लैक्टेट खारा समाधान में रखा गया है। छवि mTFP प्रतिदीप्ति (बाएं), शुक्र प्रतिदीप्ति (केंद्र), और दो प्रतिदीप्ति (दाएं, ImageJ सॉफ्टवेयर के अनुपात प्लस प्लगइन का उपयोग कर उत्पादित) के बीच अनुपात दर्शाया गया है. स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन (ए, शीर्ष पैनल), 10 माइक्रोन (एक नीचे पैनल, बी). संक्षिप्ताक्षर: वीएनसी = उदर तंत्रिका कॉर्ड; mTFP = मोनोमेरिक चैती फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: छवियों के कदम से कदम विश्लेषण। छवि विश्लेषण के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रण, प्रक्रिया (पहला कॉलम), इमेजजे कमांड (दूसरा कॉलम), और इमेज प्रोसेसिंग परिणाम (तीसरा कॉलम) प्रदर्शित करता है। उदाहरण मोटर न्यूरॉन्स (OK6-GAL4) में लैकोनिक लैक्टेट सेंसर को व्यक्त करने वाले VNC से ली गई कच्ची छवि से शुरू होता है। संक्षिप्ताक्षर: वीएनसी = उदर तंत्रिका कॉर्ड; mTFP = मोनोमेरिक चैती फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क के न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं में मोनोकार्बोक्सिलेट और ग्लूकोज परिवहन। (ए)मोटर न्यूरॉन्स (ओके 6-गैल 4 >लैकोनिक) में लैक्टेट सेंसर लैकोनिक व्यक्त वीएनसी की प्रतिनिधि छवियां। मोटर न्यूरॉन्स में लैकोनिक प्रतिदीप्ति लैक्टेट के 1 मिमी के 5 मिनट नाड़ी के पहले, दौरान और बाद में देखी जाती है। ImageJ के अनुपात प्लस प्लगइन का उपयोग अनुपात छवियों (mTFP/Venus) को बनाने के लिए किया गया था। स्केल बार = 10 माइक्रोन। (बी) मोटर न्यूरॉन्स (ओके 6-जीएएल 4, ग्रे लाइनों) या ग्लियल कोशिकाओं (आरईपीओ-जीएएल 4, काली लाइनों) में लैकोनिक लैक्टेट सेंसर को व्यक्त करने वाले पृथक वीएनसी से झल्लाहट संकेतों की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग 5 मिन के लिए 1 एमएम लैक्टेट के संपर्क में है। निशान लैक्टेट एक्सपोजर से पहले 2 मिनट एकत्र किए गए औसत मूल्य के लिए समायोजित झल्लाहट संकेतों को दर्शाते हैं। (सी)मोटर न्यूरॉन्स (ओके 6-जीएएल 4, ग्रे लाइनों) या ग्लियल कोशिकाओं (आरईपीओ-जीएएल 4, काली लाइनों) में ग्लूकोज सेंसर एफएलआईआई12पीजीएल700μδ6 को व्यक्त करने वाले पृथक वीएनसी से झल्लाहट संकेतों की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग 5 मिन के लिए 5 एमएम ग्लूकोज के संपर्क में है। निशान ग्लूकोज एक्सपोजर से दो मिनट पहले एकत्र किए गए औसत मूल्य के लिए समायोजित झल्लाहट संकेतों को दर्शाते हैं। संक्षिप्ताक्षर: वीएनसी = उदर तंत्रिका कॉर्ड; mTFP = मोनोमेरिक चैती फ्लोरोसेंट प्रोटीन; झल्लाहट = फोस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क के ग्लियल कोशिकाओं में लैक्टेट परिवहन चास्की आरएनएआई व्यक्त करता है। (ए) लैक्टेट सेंसर लैकोनिक अकेले (आनुवंशिक नियंत्रण, डब्ल्यू1118, ब्लैक लाइन) को व्यक्त करने वाले पृथक वीएनसी या चास्की (सीएचके) अभिव्यक्ति (सीएचके-आरएनएआई, मैजेंटा) को खटखटाने के लिए आरएनएआई को सह-व्यक्त करना 5 मिनट के लिए 1 एमएम लैक्टेट के संपर्क में थे। प्रत्येक हालत के लिए, निशान सात अलग VNCs (हालत प्रति 70 कोशिकाओं, लैक्टेट के संपर्क में आने से पहले 2 मिनट प्राप्त मतलब मूल्य का उपयोग कर सामान्यीकृत) से प्राप्त मतलब झल्लाहट मूल्य का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) ए में वक्र के नीचे के क्षेत्र का उपयोग इंट्रासेल्युलर लैक्टेट संचय की गणना के लिए किया जाता है। प्रत्येक हालत के लिए, मान 70 कोशिकाओं और सात स्वतंत्र प्रयोगों (नियंत्रण या chk-RNAi) से मतलब एसई हैं। अयुग्मित छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण (* पी < 0.05) के लिए किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: वीएनसी = उदर तंत्रिका कॉर्ड; झल्लाहट = फोस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: पिक्रोटॉक्सिन एक्सपोजर द्वारा प्रेरित न्यूरोनल एटीपी स्तरों में परिवर्तन। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड (ए) कैल्शियम सेंसर GCaMP6f या (बी, प्रयोगों का एक अलग सेट) मोटर न्यूरॉन्स (OK6-GAL4) में एटीपी सेंसर AT1.03NL को व्यक्त करने वाले VNCs से कैप्चर की गई प्रतिदीप्ति की रिकॉर्डिंग जो लाइन द्वारा इंगित समय के दौरान GABAA रिसेप्टर प्रतिपक्षी Picrotoxin (80 μM) के संपर्क में थे। प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग एक वीएनसी ( ए में) से एकल मोटर न्यूरॉन से आती है या पीटीएक्स एक्सपोजर से 2 मिनट पहले प्राप्त औसत मूल्यों के लिए सामान्यीकृत एकल वीएनसी ( बी में) से 10 कोशिकाओं से एसई का ±मतलब है। संक्षिप्ताक्षर: वीएनसी = उदर तंत्रिका कॉर्ड; पीटीएक्स = पिक्रोटॉक्सिन; एसई = मानक त्रुटि; सीएफपी = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: ड्रोसोफिला वसा निकायों में मोनोकार्बोक्सिलेट और ग्लूकोज का परिवहन। (ए) लैक्टेट सेंसर लैकोनिक (एमटीएफपी प्रतिदीप्ति) व्यक्त करने वाले तीसरे इंस्टार लार्वा से पृथक वसा शरीर की छवि। स्केल बार = 10 माइक्रोन। (बी) ग्लूकोज सेंसर (FLII12Pglu700μδ6) ग्लूकोज (1, 5, और ग्लूकोज के 10 मिमी) के संपर्क में आने वाले एफबी में कैप्चर किए गए सामान्यीकृत सिग्नल के प्रतिनिधि निशान। डेटा ग्लूकोज एक्सपोजर से पहले पहले 2 मिनट के लिए सामान्यीकृत किया गया था। (सी, डी) लैक्टेट सेंसर (सी) या पाइरूवेट सेंसर (डी) को व्यक्त करने वाले एफबी से प्राप्त सामान्यीकृत सिग्नल के प्रतिनिधि निशान लैक्टेट या पाइरूवेट के 0.1-0.5-1 एमएम के संपर्क में हैं। डेटा लैक्टेट या पाइरूवेट एक्सपोजर से पहले पहले 2 मिनट के लिए सामान्यीकृत किया गया था। संक्षिप्ताक्षर: एफबी = वसा शरीर; mTFP = मोनोमेरिक चैती फ्लोरोसेंट प्रोटीन; YFP = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; सीएफपी = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

मस्तिष्क चयापचय के अध्ययन के लिए ड्रोसोफिला मॉडल का उपयोग अपेक्षाकृत नया26 है, और यह मुख्य रूप से प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियों या मस्तिष्क स्लाइस में इन विट्रो में अध्ययन किया गया है जो उम्मीद से स्तनधारी चयापचय के साथ अधिक विशेषताओं को साझा करने के लिए दिखाया गया है. ड्रोसोफिला विवो प्रयोगों में उत्कृष्टता प्राप्त करता है, आनुवंशिक उपकरणों और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर की बैटरी के लिए धन्यवाद, जो शोधकर्ताओं को वास्तविक समय में प्रेरित गतिविधि के कारण या यहां तक कि संवेदी उत्तेजना के जवाब में चयापचय परिवर्तनों की कल्पना करने की अनुमति देता है।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे ड्रोसोफिला वीएनसी ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स में मोनोकार्बोक्सिलेट और ग्लूकोज परिवहन को मापने के लिए एक पूर्व विवो तैयारी है कि झल्लाहट माइक्रोस्कोपी पर आधारित आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट चयापचय सेंसर के उपयोग की अनुमति देता है आराम और सक्रिय न्यूरॉन्स में चयापचय परिवर्तन के समय चूक वीडियो बनाने के लिए. इस प्रोटोकॉल को आसानी से घुड़सवार किया जा सकता है और जटिल मशीनरी के उपयोग के बिना ड्रोसोफिला मॉडल का उपयोग करके किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है, एक उत्सर्जन-विभाजन प्रणाली से लैस एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके। यह भी एक कताई डिस्क, लेजर confocal, या दो फोटॉन सूक्ष्मदर्शी (लेकिन प्रकाश उत्सर्जन को विभाजित करने के लिए एक फाड़नेवाला की आवश्यकता है) की तरह और अधिक उन्नत उपकरणों के लिए बढ़ाया जा सकता है और अधिक गहराई से मस्तिष्क में स्थित विशिष्ट कोशिकाओं रिकॉर्ड के रूप में वयस्क ड्रोसोफिला मस्तिष्क में होता है. चूंकि इस प्रकार के चयापचय संकेत अपेक्षाकृत धीमे होते हैं, इसलिए तेज या महंगे वीडियो कैमरे की आवश्यकता नहीं होती है।

इसके अतिरिक्त, पृथक वीएनसी या एफबी तैयारी को कभी-कभी विवो रिकॉर्डिंग में आवश्यक आंदोलन सुधार के लिए एक परिष्कृत विधि की आवश्यकता नहीं होती है। ImageJ प्लगइन्स प्रयोग के दौरान उत्पन्न होने वाले VNCs के अधिकांश आंदोलनों को संतोषजनक ढंग से ठीक कर सकते हैं। नतीजतन, पीटीएक्स के अलावा या प्रासंगिक चयापचयों के अलावा न्यूरोनल गतिविधि में वृद्धि प्राकृतिक शरीर की मांसपेशियों के संकुचन के कारण होने वाली समस्याओं के बिना समवर्ती रूप से किया जा सकता है, जैसा कि अन्य प्रोटोकॉल (जैसे पट्टिका की तैयारी)27में देखा गया है।

हम प्रतिनिधि प्रयोगों जिसमें लैक्टेट और ग्लूकोज परिवहन स्पष्ट रूप से इन चयापचयों (1 और 5 मिमी, क्रमशः) के शारीरिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता पर मनाया जाता है दिखा. यहां से, यह उम्मीद की जाती है कि किसी भी अनियंत्रित जीन या पहले से रिपोर्ट किए गए प्रोटीन को विभिन्न स्थितियों में परिवहन क्षमता के लिए परीक्षण किया जा सकता है, जैसे कि न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों या चयापचय अपमान (उच्च कैलोरी आहार या पोषक तत्व प्रतिबंध) के विभिन्न मॉडलों का उपयोग करना। इस संबंध में, हम दिखाते हैं कि एक ज्ञात मोनोकारबॉक्साइलेट ट्रांसपोर्टर के आरएनएआई-मध्यस्थता नॉकडाउन ग्लियल कोशिकाओं में लैक्टेट परिवहन को काफी कम कर देता है। दिलचस्प बात यह है कि लैकोनिक और पायरोनिक सेंसर से प्राप्त संकेत मीडिया में लैक्टेट या पाइरूवेट में परिवर्तन के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होते हैं, जिससे इन चयापचयों में इंट्रासेल्युलर परिवर्तनों का सटीक माप होता है। संकेत के इस पर्याप्त गतिशील रेंज स्तनधारी कोशिकाओं में अलग हो रहा है जहां सेंसर और intracellular लैक्टेट एकाग्रता के संकेत के बीच एक nonlinear संबंध28 मनाया गया है लगता है.

यह दृष्टिकोण बेसल और उच्च न्यूरोनल गतिविधि के दौरान मस्तिष्क में ऊर्जा उत्पन्न करने के लिए मोनोकार्बोक्सिलेट्स और ग्लूकोज को कहां और कब संसाधित या उपयोग किया जाता है, इसके बारे में महत्वपूर्ण पहलुओं के उत्तर प्रदान कर सकता है। पीटीएक्स की वजह से न्यूरोनल गतिविधि में वृद्धि ऊर्जा से संबंधित चयापचयों में काफी परिवर्तन पैदा कर सकती है, सेल संस्कृतियों, मस्तिष्क स्लाइड औरजीवित जीवों23,24में जो देखा गया है, उसी तरह से। विशेष रूप से, एटीपी उत्पादन में वृद्धि न्यूरोनल गतिविधि में वृद्धि के कुछ मिनट बाद होती है, सबसे अधिक संभावना ग्लूकोज चयापचय और ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच लैक्टेट और पाइरूवेट के आदान-प्रदान के कारण होती है, जैसा कि पहले17 बताया गया था। ग्लूकोज और मोनोकार्बोक्सिलेट्स की आपूर्ति के लिए विशिष्ट कोशिकाओं की जरूरतों का अध्ययन, साथ ही साथ उनके परिवहन या पीढ़ी के अंतर्निहित तंत्र, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर के उपयोग के साथ संयोजन के रूप में कुछ जीनों की अभिव्यक्ति में हेरफेर करके संभव बनाया जा सकता है।

अन्य चयापचय महत्वपूर्ण ऊतकों को आसानी से पाली-एल-लाइसिन-लेपित coverslips और metabolite परिवर्तन कई मिनट के लिए imaged किया जा करने के लिए बाध्य कर सकते हैं. विभिन्न ऊतकों में ग्लूकोज या लैक्टेट परिवहन की मध्यस्थता करने वाले उपन्यास ट्रांसपोर्टरों का अध्ययन किया जा सकता है। परिसंचारी ग्लूकोज को लार्वा वसा निकायों में डिसैकराइड ट्रेहलोस का उत्पादन करने के लिए उन तंत्रों के माध्यम से ले जाया जाता है जो पूरी तरह से समझ में नहीं आते हैं, ये विधियां इस मार्ग को बेहतर ढंग से समझने में मदद कर सकती हैं। इसके अलावा, पोषण संबंधी प्रतिबंध के तहत, फैटी एसिड को एफबी में कीटोन निकायों का उत्पादन करने के लिए चयापचय किया जा सकता है और उन्हें हेमोलिम्फ तक निकालने के लिए आवश्यक ट्रांसपोर्टर अभी भी अज्ञात हैं।

यह ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल समय के साथ एक चयापचय के संचय का अनुमान लगाने के लिए या शर्तों के बीच एक विशिष्ट सेंसर के प्रतिदीप्ति में वृद्धि की दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि महत्वपूर्ण है, लेकिन औपचारिक रूप से "एकाग्रता" में परिवर्तन पर विचार करने के लिए नहीं क्योंकि यह एक में सीटू सेंसर अंशांकन की आवश्यकता होगी. इस मामले में वीएनसी को शामिल करने वाली कई सेल परतें इस अंशांकन के लिए आवश्यक आयनोफोर जैसे अणुओं के प्रसार को सीमित करती हैं। हालांकि, हम छवि प्रसंस्करण दिशा निर्देशों है कि एक जानवर29,30 के भीतर विभिन्न अंगों या कोशिकाओं के बीच विपरीत लैक्टेट स्तर की अनुमति के बाद सलाह.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी या वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम सिएराल्टा लैब के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को FONDECYT-Iniciación 11200477 (AGG के लिए) और FONDECYT नियमित 1210586 (JS को) द्वारा समर्थित किया गया था। UAS-FLII12Pglu700μδ6 (ग्लूकोज सेंसर) कृपया पियरे-यवेस प्लाकैस और थॉमस प्रीट, CNRS-पेरिस द्वारा दान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma A9539
CaCl2 Sigma C3881
CCD Camera ORCA-R2 Hamamatsu -
Cell-R Software Olympus -
CG-GAL4 Bloomington Drosophila Stock Center 7011 Fat body driver
Dumont # 5 Forceps Fine Science Tools 11252-30
DV2-emission splitting system Photometrics -
Glass coverslips (25 mm diameter) Marienfeld 111650 Germany
Glucose Sigma G8270
GraphPad Prism GraphPad Software Version 8,0,2
HEPES Sigma H3375
ImageJ software National Institues of Health Version 1,53t
KCl Sigma P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective Olympus -
Methylparaben Sigma H5501
MgCl2 Sigma M1028
NaCl Sigma S7653
OK6-GAL4 Bloomington Drosophila Stock Center Motor neuron driver
Picrotoxin Sigma P1675S CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine Sigma P4707
Propionic Acid Sigma P1386
Repo-GAL4 Bloomington Drosophila Stock Center 7415 Glial cell driver (all)
Sodium Lactate Sigma 71718
Sodium pyruvate Sigma P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI Olympus -
Sucrose Sigma S0389
Trehalose US Biological T8270
UAS-AT1.03NL  Kyoto Drosophila Stock Center 117012 ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829 Vienna Drosophila Resource Center v37139 Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6  Bloomington Drosophila Stock Center 93452 Glucose sensor
UAS-GCaMP6f  Bloomington Drosophila Stock Center 42747 Calcium sensor
UAS-Laconic Sierralta Lab - Lactate sensor
UAS-Pyronic Pierre Yves Placais/Thomas Preat - CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective Olympus -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
  2. Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
  3. Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
  4. Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
  5. Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
  6. Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
  7. Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
  8. Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
  9. Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
  10. Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
  11. Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
  12. San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
  13. San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
  14. Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
  15. Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
  16. Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
  17. Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
  18. Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
  19. Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
  20. McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
  21. Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  22. Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
  23. Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
  24. Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
  25. Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
  26. De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
  27. Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
  28. Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
  29. Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
  30. Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).

Tags

इस महीने JoVE अंक 200 चयापचय पूर्व विवो ड्रोसोफिला लार्वा मस्तिष्क आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर एटीपी उत्पादन ग्लूकोज चयापचय लैक्टेट पाइरूवेट विनियमन प्रमुख खिलाड़ी Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण-आधारित सेंसर परिवहन माप ग्लियल कोशिकाएं न्यूरॉन्स लार्वा मस्तिष्क की तैयारी लैक्टेट ट्रांसपोर्ट मोनोकार्बोक्सिलेट ट्रांसपोर्टर्स न्यूरोनल गतिविधि मेटाबोलाइट परिवर्तन जीवित ऊतक
आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सेंसर का उपयोग करके <em>पूर्व विवो ड्रोसोफिला</em> लार्वा मस्तिष्क में मोनोकार्बोक्सिलेट्स और अन्य प्रासंगिक चयापचयों की कल्पना करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

González-Gutiérrez, A.,… More

González-Gutiérrez, A., Gaete, J., Esparza, A., Toledo, J., Köhler-Solis, A., Sierralta, J. Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors. J. Vis. Exp. (200), e65846, doi:10.3791/65846 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter