本文介绍了一种利用基因编码的基于 Förster 共振能量转移的传感器，在果蝇幼虫脑离体标本中可视化单羧酸盐、葡萄糖和 ATP 在胶质细胞和神经元中转运的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
由于电活动导致大脑具有高能量需求，这是大脑最显著的特征之一。这些能量需求通过葡萄糖及其代谢物（如单羧酸盐乳酸和丙酮酸）生成ATP来满足。目前尚不清楚这一过程是如何被调控的，以及其中的关键参与者有哪些，特别是在Drosophila中。
使用基于基因编码的福斯特共振能量转移传感器，我们介绍了一种简单的方法，用于测量单羧酸盐和葡萄糖在胶质细胞和神经元中的转运过程 离体果蝇 幼虫脑组织制备。该方案描述了如何将表达某种传感器的幼虫脑组织解剖并固定于玻璃盖玻片上。
我们展示了整个实验的结果，该实验通过在胶质细胞中敲低已鉴定的单羧酸转运蛋白，来测量幼虫大脑中的乳酸转运。此外，我们还演示了如何快速提高神经元活性，并追踪活跃大脑中代谢物的变化。所述方法提供了所有必要信息，可用于分析其他 Drosophila 活体组织。
引言
由于神经元在产生和传递电信号以及突触传递过程中需要消耗大量能量来恢复离子梯度，因此大脑具有很高的能量需求1,2。长期以来，人们认为这种高能量需求主要依赖于葡萄糖的持续氧化以生成ATP3。血脑屏障上的特异性转运蛋白将血液中的葡萄糖转运至大脑，稳定的血糖水平可确保大脑持续获得葡萄糖供应4。有趣的是，越来越多的实验证据表明，葡萄糖代谢产生的分子（如乳酸和丙酮酸）在脑细胞的能量生成过程中也发挥着重要作用5,6。然而，这些分子在能量生成中的具体重要性，以及大脑中哪些细胞负责产生或利用这些分子，目前仍存在争议7,8。由于缺乏具备足够高时空分辨率的合适分子工具，这一争议至今尚未得到彻底解决，这已成为该领域研究中的一个重大难题。
多种工程化荧光代谢传感器的开发与应用极大地加深了我们对代谢物产生与利用的部位及机制，以及基础状态和高神经元活动期间代谢通量变化的理解9。基于荧光共振能量转移（FRET）显微技术....
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方案
1. 果蝇品系的维持与幼虫同步化
- 进行这些实验时，使用在25 °C下于标准培养基中培养的果蝇品系 果蝇 由10%酵母、8%葡萄糖、5%小麦粉、1.1%琼脂、0.6%丙酸和1.5%对羟基苯甲酸甲酯组成的培养基。
- 按照本方案操作时，请使用以下品系： w1118 （实验对照背景），OK6-GAL4（运动神经元驱动子），repo-GAL4（所有胶质细胞驱动子），CG-GAL4（脂肪体驱动子），UAS-Pyronic（丙酮酸传感器），UAS-FLII12Pglu700µδ6（葡萄糖传感器）、UAS-Laconic（乳酸传感器）、UAS-GCaMP6f（钙离子传感器）、UAS-AT1.03NL（ATP传感器）和UAS-Chk RNAi GD1829。所有表达传感器或RNAi的品系均位于 w1118 遗传背景
- 为获得同步化的三龄游走期幼虫，将300只所需基因型的果蝇（3–5日龄，100只雄蝇，200只未交配雌蝇）放入产卵室中，产卵室内放置一个直径60 mm的培养皿，其中铺有含1%琼脂糖的磷酸盐缓冲液（PBS）。在培养皿中央加入一滴液体或奶油状酵母（直径1.5 cm），以促进果蝇产卵。图1).
- 将果蝇置于25 °C条件下培养3天，每天两次更换新的琼脂糖培....
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结果
该方法可在长达1小时的时间内，方便地检测单羧酸盐和葡萄糖传感器荧光信号的细胞内变化。如图4所示，胶质细胞和运动神经元中的Laconic传感器在脉冲开始时对1 mM乳酸的响应速率相似，但在5分钟脉冲期间，运动神经元的信号增幅高于基线水平，这与先前的研究结果一致17。选择该乳酸浓度是因为其水平与三龄幼虫血淋巴中检测到的浓度相当。类似地，当腹神经索中表达的葡萄糖传感器暴露于5 mM葡萄糖（该数值与我们及其他研究者在血淋巴中测得的浓度相近19）时，传感器在胶质细胞和神经元中的信号上升速率相似。然而，在葡萄糖脉冲期间，神经元中的信号增幅大于胶质细胞。这一结果与先前表达类似FRET传感器的实验体系中的观察结果一致16。
该制备物可用于对尚未描述的单羧酸盐和葡萄糖转运蛋白进行实验研究，这些转运蛋白表达于 果蝇 胶质细胞或神经元20.......
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讨论
利用 Drosophila 模型研究脑代谢相对较新26，研究表明其代谢特征与哺乳动物的相似性远超预期；而哺乳动物的代谢研究主要依赖体外（in vitro）的原代神经元培养或脑切片实验。Drosophila 在活体（in vivo）实验中具有显著优势，得益于一系列可用的遗传工具和基因编码的传感器，研究人员能够实时观察由诱导活动甚至感觉刺激所引发的代谢变化。
本文所述方案展示了如何测量单羧酸盐和葡萄糖的转运 果蝇 腹神经索胶质细胞和神经元在其中 离体 利用基于FRET显微技术的基因编码荧光代谢传感器，制备可拍摄静息与活跃神经元代谢变化延时视频的方案。该方案可便捷地在任何配备相应设备的实验室中实施 果蝇 使用配备发射光分光系统的落射荧光显微镜，可在不依赖复杂设备的情况下建立该模型。该方法也可扩展至更先进的设备，如转盘式共聚焦显微镜、激光共聚焦显微镜或双光子显微镜（但需配备分光装置以分离发射光），从而对位于脑组织更深层.......
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披露
作者声明不存在竞争性或经济利益。
致谢
感谢Sierralta实验室的所有成员。本工作由FONDECYT-启动项目11200477（资助AGG）和FONDECYT常规项目1210586（资助JS）提供支持。UAS-FLII12Pglu700µδ6（葡萄糖传感器）由巴黎国家科学研究中心（CNRS）的Pierre-Yves Plaçais和Thomas Preat慷慨捐赠。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD相机ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R软件 | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington果蝇品系中心 | 7011 | 脂肪体驱动子 |
| Dumont #5镊子 | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2发射分光系统 | Photometrics | - | |
| 玻璃盖玻片（25 mm直径） | Marienfeld | 111650 | 德国 |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 版本 8.0.2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ软件 | 美国国立卫生研究院 | 版本 1.53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8水浸物镜 | Olympus | - | |
| 对羟基苯甲酸甲酯 | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington果蝇品系中心 | 运动神经元驱动子 | |
| 苦味毒 | Sigma | P1675S | 警告——吞食可致死 |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P4707 | |
| 丙酸 | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington果蝇品系中心 | 7415 | 胶质细胞驱动子（全部） |
| 乳酸钠 | Sigma | 71718 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma | P2256 | |
| 旋转盘荧光显微镜BX61WI | Olympus | - | |
| 蔗糖 | Sigma | S0389 | |
| 海藻糖 | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | 京都果蝇品系中心 | 117012 | ATP传感器 |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | 维也纳果蝇资源中心 | v37139 | Chk RNAi品系 |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington果蝇品系中心 | 93452 | 葡萄糖传感器 |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington果蝇品系中心 | 42747 | 钙离子传感器 |
| UAS-Laconic | Sierralta实验室 | - | 乳酸传感器 |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-巴黎 |
| UMPlanFl 20x/0.5水浸物镜 | Olympus | - |
参考文献
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A.
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重印与许可
