Summary
Qui presentiamo un protocollo per visualizzare il trasporto di monocarbossilati, glucosio e ATP nelle cellule gliali e nei neuroni utilizzando sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Förster geneticamente codificati in una preparazione cerebrale larvale di Drosophila ex-vivo .
Abstract
L'elevato fabbisogno energetico del cervello dovuto all'attività elettrica è una delle loro caratteristiche più distintive. Questi requisiti sono soddisfatti dalla produzione di ATP dal glucosio e dai suoi metaboliti, come i monocarbossilati lattato e piruvato. Non è ancora chiaro come questo processo sia regolato o chi siano gli attori chiave, in particolare in Drosophila.
Utilizzando sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Förster codificati geneticamente, presentiamo un metodo semplice per misurare il trasporto di monocarbossilati e glucosio nelle cellule gliali e nei neuroni in una preparazione cerebrale larvale di Drosophila ex-vivo . Il protocollo descrive come sezionare e far aderire un cervello larvale che esprime uno dei sensori su un vetrino coprioggetto.
Presentiamo i risultati di un intero esperimento in cui il trasporto del lattato è stato misurato nel cervello larvale abbattendo i trasportatori di monocarbossilati precedentemente identificati nelle cellule gliali. Inoltre, dimostriamo come aumentare rapidamente l'attività neuronale e monitorare i cambiamenti dei metaboliti nel cervello attivo. Il metodo descritto, che fornisce tutte le informazioni necessarie, può essere utilizzato per analizzare altri tessuti viventi di Drosophila .
Introduction
Il cervello ha un elevato fabbisogno energetico a causa dell'elevato costo del ripristino dei gradienti ionici nei neuroni causati dalla generazione e dalla trasmissione del segnale elettrico neuronale, nonché dalla trasmissione sinaptica 1,2. A lungo si è pensato che questa elevata richiesta di energia fosse soddisfatta dalla continua ossidazione del glucosio per produrre ATP3. Trasportatori specifici alla barriera emato-encefalica trasferiscono il glucosio nel sangue al cervello. Livelli glicemici costanti assicurano che il cervello riceva un apporto costante di glucosio4. È interessante notare che una crescente evidenza sperimentale suggerisce che le molecole derivate dal metabolismo del glucosio, come il lattato e il piruvato, svolgono un ruolo importante nella produzione di energia delle cellule cerebrali 5,6. Tuttavia, c'è ancora un certo dibattito su quanto siano importanti queste molecole per la produzione di energia e quali cellule del cervello le producano o le utilizzino 7,8. La mancanza di strumenti molecolari appropriati con l'alta risoluzione temporale e spaziale richiesta per questo compito è un problema significativo che ha impedito che questa controversia fosse completamente risolta.
Lo sviluppo e l'applicazione di diversi sensori metabolici fluorescenti ingegnerizzati hanno portato a un notevole aumento della nostra comprensione di dove e come i metaboliti vengono prodotti e utilizzati, nonché di come i flussi metabolici si verificano durante l'attività basale e neuronaleelevata 9. I sensori metabolici geneticamente codificati basati sulla microscopia a trasferimento di energia a risonanza di Förster (FRET), come ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glucosio), Laconic (lattato) e Pyronic (piruvato), hanno contribuito alla nostra comprensione del metabolismo energetico cerebrale 10,11,12,13. Tuttavia, a causa dei costi elevati e delle sofisticate attrezzature necessarie per condurre esperimenti su animali vivi o tessuti, i risultati nei modelli di vertebrati sono ancora principalmente limitati alle colture cellulari (cellule gliali e neuroni).
L'uso emergente del modello Drosophila per esprimere questi sensori ha rivelato che le caratteristiche metaboliche chiave sono conservate tra le specie e la loro funzione può essere facilmente affrontata con questo strumento. Ancora più importante, il modello di Drosophila ha fatto luce su come il glucosio e il lattato/piruvato vengono trasportati e metabolizzati nel cervello del moscerino, il legame tra il consumo di monocarbossilati e la formazione della memoria e la notevole dimostrazione di come gli aumenti dell'attività neurale e del flusso metabolico si sovrappongano 14,15,16,17. Il metodo qui presentato per misurare i livelli di monocarbossilato, glucosio e ATP utilizzando sensori FRET geneticamente codificati espressi nel cervello larvale consente ai ricercatori di saperne di più su come il cervello di Drosophila utilizza l'energia, che può essere applicata al cervello di altri animali.
Mostriamo che questo metodo è efficace per rilevare il lattato e il glucosio nelle cellule gliali e nei neuroni e che un trasportatore di monocarbossilati (Chaski) è coinvolto nell'importazione del lattato nelle cellule gliali. Dimostriamo anche un metodo semplice per studiare i cambiamenti dei metaboliti durante l'aumento dell'attività neuronale, che possono essere facilmente indotti dall'applicazione in bagno di un antagonista del recettore GABAA . Infine, mostriamo che questa metodologia può essere utilizzata per misurare il trasporto di monocarbossilati e glucosio in altri tessuti metabolicamente significativi, come i corpi adiposi.
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Protocol
1. Mantenimento del ceppo di mosca e sincronizzazione larvale
- Per eseguire questi esperimenti, utilizzare colture di moscerini allevate a 25 °C su un alimento standard a base di Drosophila composto dal 10% di lievito, dall'8% di glucosio, dal 5% di farina di frumento, dall'1,1% di agar, dallo 0,6% di acido propionico e dall'1,5% di metilparabene.
- Per seguire questo protocollo, utilizzare le seguenti linee: w1118 (background di controllo sperimentale), OK6-GAL4 (driver per motoneuroni), repo-GAL4 (driver per tutte le cellule gliali), CG-GAL4 (driver per corpi grassi), UAS-Pyronic (sensore di piruvato), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (sensore di glucosio), UAS-Laconic (sensore di lattato), UAS-GCaMP6f (sensore di calcio), UAS-AT1.03NL (sensore ATP) e UAS-Chk RNAi GD1829. Tutte le linee che esprimono sensori o RNAi sono nel background genetico w1118 .
- Per ottenere larve erranti sincronizzate nel terzo stadio, porre 300 mosche (3-5 giorni di età, 100 maschi, 200 femmine vergini) dell'incrocio genetico desiderato nella camera di deposizione delle uova, che contiene una capsula di Petri di 60 mm ricoperta di agarosio all'1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Posizionare una goccia di lievito liquido/cremoso (1,5 cm di diametro) al centro della placca per incoraggiare le mosche a deporre le uova (Figura 1).
- Tenere le mosche a 25 °C per 3 giorni sostituendo la capsula di Petri con agarosio con una fresca e lievito appena sciolto due volte al giorno.
- Lasciare che le mosche depongano le uova per 4 ore il quarto giorno prima di cambiare la capsula di Petri. Rimuovere questa placca. Quindi, per 3 ore, lasciare che le mosche depongano le uova in una nuova placca di agarosio con lievito appena sciolto. Usa queste larve negli esperimenti.
- Dopo 3 ore, rimuovere la placca contenente le uova e metterla in un'incubatrice a 25 °C per 24 ore.
- Raccogliere da 50 a 100 larve appena schiuse da questa placca (0 ore dopo la schiusa delle larve) e metterle in una fiala di plastica contenente cibo standard. Per consentire alle larve di nutrirsi correttamente, assicurarsi che il cibo sia macinato e morbido. Utilizzare le larve 96 ore dopo il trasferimento.
2. Realizzare i vetrini coprioggetti con poli-L-lisina
- Eseguire questa fase 1 ora prima della dissezione larvale. In una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti, posizionare vetrini coprioggetti da 25 mm (il diametro dei coperchi da utilizzare dipende dalla camera di registrazione disponibile al microscopio).
- Mettere una goccia (300 μL) di poli-L-lisina al centro di ciascun vetrino coprioggetti per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare ogni vetrino coprioggetto 3 volte con acqua distillata, poi 2 volte con una soluzione salina priva di Ca2+ (la stessa soluzione utilizzata per sezionare le larve, vedere il passaggio 3.2). Installare i coperchi nella camera di registrazione e riempirla con soluzione salina priva di Ca2+.
NOTA: Sebbene il cervello larvale possa aderire direttamente ai vetrini coprioggetti, l'adesione è debole e il cervello occasionalmente si muove o si sposta durante l'esperimento a causa del flusso continuo di soluzione salina. L'aggiunta del gradino di poli-L-lisina riduce il rischio di movimenti o addirittura di perdita cerebrale a seguito dei lavaggi.
3. Sezionare il midollo nervoso ventrale (VNC) e i corpi adiposi (FB)
- Raccogli le larve vaganti di terzo stadio dall'incrocio genetico desiderato (dal passaggio 1.7) e lavale accuratamente 3 volte con acqua distillata.
- Porre le larve in un pozzetto di dissezione in vetro contenente 750 μL di soluzione salina ghiacciata nominalmente zero Ca2+ composta da 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM trealosio, 5 mM HEPES e 35 mM di saccarosio (pH = 6,7, misurato con un pHmetro e regolato con 1 M NaOH e HCl 37% v/v).
NOTA: L'impostazione del pH a 6,7 è fondamentale perché, come osservato in precedenza, il trasporto dei monocarbossilati dipende fortemente dal pH della soluzione. Inoltre, 6,7 corrisponde al pH nell'emolinfa di una larva di terzo stadio17,18. - Metti la larva sotto uno stereomicroscopio e fai un taglio trasversale sulla parte posteriore dell'addome con un paio di pinze.
- Spingi la mascella con la pinza mentre capovolgi le larve.
- Osservare il midollo nervoso ventrale (VNC) accanto alla mandibola. Rimuovere con cautela i dischi immaginali e i restanti tessuti cervello-caudali.
- Separare il VNC con il cervello centrale e i lobi ottici dal resto del tessuto tagliando i nervi. Trasferire il VNC, prelevandolo con una pinza dai nervi rimanenti e posizionandolo nella camera di registrazione contenente la soluzione di registrazione senza Ca2+ (stessa soluzione del passaggio 3.2). I VNC aderiranno immediatamente ai tagliando coperchio.
- Per evitare interferenze da parte dei nervi rimanenti, fissarli nella parte inferiore del vetrino coprioggetto utilizzando una pinza (i nervi saranno anche fluorescenti a seconda della linea di guida utilizzata) (Figura 2).
- Per eseguire esperimenti sui corpi grassi (FB) che misurano il trasporto di glucosio o monocarbossilati in un'altra serie di esperimenti, procedere all'isolamento dei tessuti seguendo i passaggi 3.1-3.4. Una volta che le larve sono capovolte, osservare che il FB è un tessuto bianco, bilaterale, piatto.
- Posizionare i FB isolati che esprimono i sensori FRET (ottenuti da un incrocio genetico utilizzando gli appositi driver) nella camera di registrazione contenente la soluzione di registrazione senza Ca2+.
NOTA: L'FB è altamente idrofobico (tende a galleggiare sulla superficie della soluzione) ed estremamente vulnerabile alla manipolazione con pinze, deve essere maneggiato con cura. Qualsiasi manipolazione approssimativa di questo tessuto si tradurrà in cellule morte in seguito (con una diminuzione della fluorescenza dei sensori). - Posizionare la camera di registrazione contenente VNC/FB sul tavolino del microscopio.
4. Imaging di cellule vive
- Per acquisire le immagini dei sensori di espressione tissutale, utilizzare un microscopio a fluorescenza verticale accoppiato a un sistema di scissione dell'emissione e a una telecamera CCD. Accendere il sistema di illuminazione del microscopio 30 minuti prima di iniziare qualsiasi esperimento.
NOTA: Qui utilizziamo un microscopio a fluorescenza Spinning Disk dotato di un obiettivo a immersione in acqua 20x/0,5 per osservare sia VNC che FB. La Figura 2 mostra anche l'uso di un obiettivo a immersione in acqua 40x/0,8. - Per visualizzare la fluorescenza GCaMP6f, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente a 488 nm e 540 nm. Per i sensori laconici/pironici/ATP/glucosio, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 440 nm e le lunghezze d'onda di emissione a 488 nm (mTFP, CFP) e 540 nm (Venus, YFP).
- Acquisisci immagini di dimensioni 512 x 512 pixel ogni 2 s per GCaMP6f e ogni 10-30 s per sensori Laconici/Pironici/ATP/glucosio. Determinare l'esposizione ottimale alla sorgente luminosa osservando la qualità dell'immagine ottenuta. Per seguire questo protocollo, assicurarsi che le immagini abbiano un'esposizione di 300 ms per i sensori laconici e pironici e di 100-150 ms per i sensori di glucosio e ATP .
NOTA: L'esposizione può variare a seconda dell'uso di un microscopio confocale o a fluorescenza normale. - Una volta installata la camera di registrazione nel tavolino del microscopio, posizionare con cura l'obiettivo a immersione in acqua e assicurarsi che l'obiettivo rimanga immerso per tutta la durata dell'esperimento. Mantenere la temperatura ambiente a 25 °C.
- Collegare la camera di registrazione a un sistema di perfusione e mantenere i tessuti immersi nella soluzione di registrazione contenente 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM trealosio, 5 mM HEPES e 35 mM saccarosio, pH 6,7 (misurato con un pHmetro e regolato con NaOH e HCl).
- Mantenere un flusso costante di 3 ml/min di soluzione di registrazione attraverso il tessuto utilizzando la gravità, accoppiata a una pompa peristaltica a basso flusso per estrarre il liquido dalla camera mantenendo costante il volume. Per ottenere il flusso richiesto, posizionare le provette contenenti la soluzione (provette di plastica da 50 mL) 25 cm sopra il tavolino del microscopio.
NOTA: Questo flusso guidato dalla gravità viene utilizzato per prevenire il movimento dei tessuti causato dalle pompe peristaltiche, consentendo un'analisi delle immagini più accurata in seguito. - Prima di qualsiasi stimolazione, mantenere la soluzione di registrazione in flusso per 5-10 minuti per ottenere una linea di base stabile di fluorescenza dai sensori. Modificare la durata in base alle esigenze per ottenere questa previsione.
- Sostituire la soluzione fluida con la soluzione di stimolazione per 5 minuti per stimolare i VNC/FB (con glucosio, piruvato o lattato alla concentrazione descritta per ogni esperimento disciolto in soluzione salina; vedere ogni figura).
NOTA: La durata della stimolazione può essere variata in base alle esigenze dell'esperimento (ad esempio, gli impulsi di glucosio possono essere aumentati a 10 min per raggiungere un plateau nei neuroni, come riportato in precedenza16). - Per mantenere l'osmolarità nella soluzione di stimolazione, rettificare la concentrazione di saccarosio (un carboidrato non metabolizzabile dal cervello della Drosophila ) in base alla concentrazione del monocarbossilato o del glucosio aggiunto.
- Cambiare le soluzioni utilizzando un semplice sistema di valvole. Fare attenzione a non spostare il tavolino del microscopio.
- Esporre il VNC a 80 μM di picrotossina (PTX, a flusso continuo) per stimolare l'attività neuronale. Questa procedura aumenta la frequenza delle oscillazioni di Ca2+ , rendendo possibile osservare cambiamenti in molecole metabolicamente rilevanti (ad esempio, ATP intracellulare).
- Al termine di ogni esperimento, lavare accuratamente l'intero sistema di flusso, comprese le provette e la camera di registrazione, per almeno 10 minuti con la soluzione salina e altri 10 minuti con acqua distillata per eliminare ogni traccia delle soluzioni utilizzate.
5. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati
- Per elaborare le immagini ottenute, procedere con i passaggi mostrati in Figura 3.
- Importare l'immagine (laconica) nel software ImageJ. L'immagine ha due viste del campione: quella di sinistra è il segnale mTFP e quella a destra è il segnale di Venere. Selezionare una regione che includa le celle da analizzare e separare queste immagini (mTFP e Venere) in una nuova finestra. Assicurarsi che queste immagini contengano esattamente la stessa area.
- Apri il plugin di registrazione e correggi la piccola deriva del tessuto che si osserva normalmente nell'esperimento con la funzione corpo rigido. Eseguire questa operazione in entrambe le immagini (mTFP e Venus).
- Selezionare almeno 10 regioni di interesse (ROI) nel citosol delle 10 cellule corrispondenti nel segnale mTFP (488 nm) e trasferire le selezioni all'immagine di Venere (540 nm).
- Selezionare due o tre ROI vicino alle cellule analizzate ma senza alcun segnale distinguibile (sempre all'interno del VNC o del tessuto analizzato, vedere la Figura 3). Questi sono i ROI di fondo.
- Con i ROI selezionati in entrambe le immagini, ottenere il valore medio di grigio di ciascun segnale utilizzando la misura della funzione. Trasferisci i dati in un foglio dati e sottrai il valore medio di fondo per ogni segnale.
- Determinare il rapporto di fluorescenza mTFP su Venere (per laconico e pironico). Questo valore viene calcolato in modo diverso rispetto agli altri sensori FRET qui descritti (dove il rapporto è solitamente YFP/CFP) perché quando sono legati ai rispettivi substrati, sia il laconico che il pironico riducono le loro efficienze FRET.
- Normalizzare i dati dividendo ogni valore registrato per la linea di base. In una scheda tecnica separata, calcolare la linea di base prendendo il valore medio del rapporto mTFP/Venus durante i 2 minuti precedenti lo stimolo.
- Per le misurazioni del glucosio e dell'ATP utilizzando sensori basati su FRET, calcolare il rapporto YFP/CFP e normalizzare i dati come descritto nel passaggio 5.8.
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Representative Results
Per un massimo di 1 ora, questa procedura consente di misurare facilmente i cambiamenti intracellulari nella fluorescenza dei sensori di monocarbossilato e glucosio. Come mostrato nella Figura 4, i sensori laconici sia nelle cellule gliali che nei motoneuroni rispondono a 1 mM di lattato a una velocità simile all'inizio dell'impulso, ma i motoneuroni raggiungono un aumento maggiore rispetto al basale durante l'impulso di 5 minuti, come precedentemente dimostrato17. Questa concentrazione di lattato è stata scelta perché è paragonabile ai livelli riscontrati nell'emolinfa delle larve di terzo stadio. Allo stesso modo, quando i sensori di glucosio che esprimono VNC sono stati esposti a 5 mM di glucosio (un valore simile a quello misurato nell'emolinfa da noi e da altri19), il segnale del sensore è aumentato a una velocità simile nelle cellule gliali e nei neuroni. Durante l'impulso di glucosio, tuttavia, il segnale nei neuroni aumenta più che nelle cellule gliali. Ciò è coerente con le precedenti osservazioni di preparazioni simili che esprimono il sensore FRET16.
Questo preparato può essere utilizzato per condurre esperimenti su trasportatori di monocarbossilati e glucosio non descritti espressi in cellule gliali o neuroni di Drosophila 20. Qui esemplificamo l'uso dell'interferenza dell'RNA per mostrare che Chaski (Chk), che in precedenza era noto per trasportare monocarbossilati in cellule eterologhe, trasporta il lattato nelle cellule gliali (Figura 5). In condizioni di restrizione nutrizionale, questo trasportatore è stato descritto come un ruolo importante nella fisiologia e nel comportamento degli animali21. Abbiamo scoperto che nelle cellule gliali, l'eliminazione di Chk ha ridotto il trasporto di lattato rispetto ai VNC di controllo esposti a 1 mM di lattato (Figura 5). Altri presunti trasportatori possono essere testati per vedere se possono trasportare metaboliti in condizioni fisiologiche e patologiche.
Per affrontare lo studio dei cambiamenti metabolici associati all'attività neuronale, abbiamo sviluppato un metodo semplice per aumentare l'attività neuronale senza utilizzare procedure tecnicamente complesse come l'optogenetica, che possono interferire con le misurazioni del sensore FRET (Figura 6). Il VNC isolato è stato esposto alla picrotossina (PTX), un noto antagonista del recettore GABAA precedentemente utilizzato da noi e da altri17,22. La concentrazione utilizzata aumenta la frequenza delle oscillazioni del calcio nei neuroni (misurata dai cambiamenti nella fluorescenza GCaMP6f) e i cambiamenti significativi in molecole metabolicamente rilevanti come il glucosio, il lattato e il piruvato17. Inoltre, gli aumenti dell'attività neuronale indotti da PTX provocano un calo transitorio dei livelli di ATP nel soma dei motoneuroni. Questo fenomeno è stato precedentemente descritto in modelli di vertebrati in cui l'attività neuronale è stata aumentata tramite stimolazione elettrica o utilizzando antagonisti del recettore GABAA 23,24. Di conseguenza, questo modello può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti metabolici in specifici sottoinsiemi di neuroni e cellule gliali, affrontando la necessità di trasportatori legati all'energia che contribuiscono alla produzione di ATP durante un'elevata attività neuronale.
Il trasporto di glucosio e monocarbossilati è importante anche nei tessuti o nelle cellule diverse dal cervello. Mostriamo qui la visualizzazione del monocarbossilato (lattato/piruvato) e dell'assorbimento del glucosio nei corpi grassi, un tessuto metabolicamente rilevante presente nelle larve e nel moscerino adulto che ha diverse funzioni chiave come l'immagazzinamento e la metabolizzazione dei lipidi25. Il sensore laconico è ben espresso in FB, come mostrato in Figura 7, dove le goccioline lipidiche possono essere viste come minuscole sfere nere all'interno della cellula. Questo tessuto isolato aderisce bene ai vetrini coprioggetti rivestiti in poli-L-lisina, consentendo una procedura di imaging cellulare a lungo termine che è anche facile da analizzare. Abbiamo osservato un aumento significativo della fluorescenza del sensore di glucosio quando FB è stato esposto a concentrazioni di glucosio crescenti (circa 5 mM), che è vicino alla concentrazione di glucosio trovata nell'emolinfa. Un'ulteriore esposizione a concentrazioni più elevate di glucosio (10 mM) non comporta l'aumento previsto della fluorescenza del sensore. Infine, in FB, siamo stati in grado di misurare l'importazione di lattato e piruvato (Figura 7C,D). In questo caso, l'aumento delle concentrazioni di lattato e piruvato provoca un aumento proporzionale della fluorescenza laconica e pironica (da 0,1 a 1 mM). Concentrazioni più elevate di monocarbossilati provocano la saturazione del segnale all'interno delle cellule.
Figura 1: Sincronizzazione delle larve di Drosophila . La procedura di sincronizzazione larvale è rappresentata graficamente. Due ore prima dell'inizio del processo, le piastre di agarosio all'1% devono essere preparate e cambiate due volte al giorno fino al giorno 4. Le larve da cova devono essere raccolte con cura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cervello larvale isolato di Drosophila che esprime il sensore del lattato Laconico. (A) Un'immagine rappresentativa di una larva isolata di terzo stadio di Drosophila VNC aderente a un vetrino coprioggetto rivestito di poli-L-lisina ed esprimente il sensore del lattato Laconico nei motoneuroni (OK6-GAL4). Le immagini mostrano un'immagine in campo chiaro del VNC (a sinistra) e della fluorescenza mTFP del sensore (pannello centrale) catturata con un obiettivo a immersione in acqua 20x. Le immagini nel pannello inferiore sono dello stesso VNC scattate con un obiettivo a immersione in acqua 40x. (B) Motoneuroni di un VNC esprimente il sensore di lattato laconico (OK6>Laconico) posto in una soluzione salina a zero lattato. L'immagine mostra la fluorescenza mTFP (a sinistra), la fluorescenza di Venere (al centro) e il rapporto tra le due fluorescenze (a destra, prodotto utilizzando il plug-in Ratio Plus del software ImageJ). Barre di scala = 50 μm (A, pannello superiore), 10 μm (A pannello inferiore, B). Abbreviazioni: VNC = cordone nervoso ventrale; mTFP = proteina fluorescente monomerica verde acqua. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi passo passo delle immagini. Un'illustrazione schematica del protocollo software ImageJ per l'analisi delle immagini, che mostra il processo (prima colonna), i comandi ImageJ (seconda colonna) e i risultati dell'elaborazione delle immagini (terza colonna). L'esempio inizia con un'immagine grezza presa da un VNC che esprime il sensore di lattato laconico nei motoneuroni (OK6-GAL4). Abbreviazioni: VNC = cordone nervoso ventrale; mTFP = proteina fluorescente monomerica verde acqua. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Trasporto di monocarbossilati e glucosio nei neuroni e nelle cellule gliali del cervello larvale di Drosophila . (A) Immagini rappresentative di VNC che esprimono il sensore del lattato laconico nei motoneuroni (OK6-Gal4>Laconico). La fluorescenza laconica nei motoneuroni si osserva prima, durante e dopo un impulso di 5 minuti di 1 mM di lattato. Il plug-in Ratio Plus di ImageJ è stato utilizzato per creare immagini di rapporto (mTFP/Venus). Barra della scala = 10 μm. (B) Registrazioni rappresentative dei segnali FRET da VNC isolati che esprimono il sensore di lattato laconico in motoneuroni (OK6-GAL4, linee grigie) o cellule gliali (REPO-GAL4, linee nere) esposti a 1 mM di lattato per 5 minuti. Le tracce rappresentano i segnali FRET aggiustati al valore medio raccolto 2 minuti prima dell'esposizione al lattato. (C) Registrazioni rappresentative di segnali FRET da VNC isolati che esprimono il sensore di glucosio FLII12Pglu700μδ6 in motoneuroni (OK6-GAL4, linee grigie) o cellule gliali (REPO-GAL4, linee nere) esposti a 5 mM di glucosio per 5 min. Le tracce rappresentano i segnali FRET aggiustati al valore medio raccolto due minuti prima dell'esposizione al glucosio. Abbreviazioni: VNC = cordone nervoso ventrale; mTFP = proteina fluorescente monomerica verde acqua; FRET = Trasferimento di energia di risonanza di Föster. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Trasporto del lattato nelle cellule gliali del cervello larvale di Drosophila che esprimono Chaski RNAi. (A) VNC isolati che esprimono il sensore del lattato solo laconico (controllo genetico, w1118, linea nera) o che co-esprimono un RNAi per abbattere l'espressione di Chaski (Chk) (chk-RNAi, magenta) sono stati esposti a 1 mM di lattato per 5 minuti. Per ogni condizione, le tracce rappresentano il valore medio di FRET ottenuto da sette VNC separati (70 cellule per condizione, normalizzate utilizzando il valore medio ottenuto 2 minuti prima di essere esposte al lattato). (B) L'area sotto la curva in A viene utilizzata per calcolare l'accumulo di lattato intracellulare. Per ogni condizione, i valori sono la media SE di 70 cellule e sette esperimenti indipendenti (controllo o chk-RNAi). Per l'analisi statistica è stato utilizzato il test t di Student non accoppiato (*p < 0,05). Abbreviazioni: VNC = cordone nervoso ventrale; FRET = Trasferimento di energia di risonanza di Föster. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Cambiamenti nei livelli neuronali di ATP indotti dall'esposizione alla picrotossina. Registrazioni della fluorescenza catturata da VNC che esprimono il sensore di calcio geneticamente codificato (A) GCaMP6f o (B, un diverso set di esperimenti) il sensore ATP AT1.03NL nei motoneuroni (OK6-GAL4) che sono stati esposti all'antagonista del recettore GABAA Picrotoxin (80 μM) durante il tempo indicato dalla linea. La registrazione rappresentativa proviene da un singolo motoneurone da un VNC (in A) o il ± medio SE da 10 cellule da un singolo VNC (in B) normalizzati ai valori medi ottenuti 2 minuti prima dell'esposizione al PTX. Abbreviazioni: VNC = cordone nervoso ventrale; PTX = picrotossina; SE = errore standard; CFP = proteina fluorescente ciano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Trasporto di monocarbossilato e glucosio nei corpi adiposi di Drosophila . (A) Immagine del corpo adiposo isolato da larve di terzo stadio che esprimono il sensore del lattato laconico (fluorescenza mTFP). Barra della scala = 10 μm. (B) Tracce rappresentative del segnale normalizzato catturato in FB che esprime il sensore di glucosio (FLII12Pglu700μδ6) esposto al glucosio (1, 5 e 10 mM di glucosio). I dati sono stati normalizzati ai primi 2 minuti prima dell'esposizione al glucosio. (C,D) Tracce rappresentative del segnale normalizzato ottenuto da FB che esprime il sensore di lattato (C) o il sensore di piruvato (D) esposto a 0.1-0.5-1 mM di lattato o piruvato. I dati sono stati normalizzati ai primi 2 minuti prima dell'esposizione al lattato o al piruvato. Abbreviazioni: FB = corpo grasso; mTFP = proteina fluorescente monomerica verde acqua; YFP = proteina fluorescente gialla; CFP = proteina fluorescente ciano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'uso del modello Drosophila per lo studio del metabolismo cerebrale è relativamente nuovo26 ed è stato dimostrato che condivide più caratteristiche con il metabolismo dei mammiferi di quanto ci si aspettasse, che è stato studiato principalmente in vitro in colture di neuroni primari o fette di cervello. La Drosophila eccelle negli esperimenti in vivo grazie alla batteria di strumenti genetici e sensori geneticamente codificati disponibili che consentono ai ricercatori di visualizzare in tempo reale i cambiamenti metabolici causati dall'attività indotta o anche in risposta a uno stimolo sensoriale.
Il protocollo qui descritto mostra come misurare il trasporto di monocarbossilati e glucosio nelle cellule gliali e nei neuroni VNC di Drosophila in una preparazione ex-vivo che consente l'uso di sensori metabolici fluorescenti geneticamente codificati basati sulla microscopia FRET per realizzare video time-lapse dei cambiamenti metabolici nei neuroni a riposo e attivi. Questo protocollo può essere facilmente montato ed eseguito in qualsiasi laboratorio utilizzando il modello Drosophila senza l'uso di macchinari complessi, utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di un sistema di suddivisione delle emissioni. Può anche essere adattato ad apparecchiature più avanzate come un disco rotante, un laser confocale o microscopi a due fotoni (ma è necessario uno splitter per dividere l'emissione di luce) per registrare cellule specifiche situate più in profondità nel cervello come accade nel cervello adulto di Drosophila . Poiché questi tipi di segnali metabolici sono relativamente lenti, non è necessaria una videocamera veloce o costosa.
Inoltre, la preparazione isolata di VNC o FB non necessita di un metodo sofisticato per la correzione del movimento, a volte necessario per le registrazioni in vivo . I plugin ImageJ possono correggere in modo soddisfacente la maggior parte dei movimenti dei VNC prodotti durante l'esperimento. Di conseguenza, l'aumento dell'attività neuronale mediante l'aggiunta di PTX o l'aggiunta di metaboliti rilevanti può essere eseguito contemporaneamente senza i problemi causati dalla naturale contrazione muscolare del corpo, come si è visto in altri protocolli (come la preparazione del filetto)27.
Mostriamo esperimenti rappresentativi in cui il trasporto di lattato e glucosio è chiaramente osservato a concentrazioni fisiologicamente rilevanti di questi metaboliti (1 e 5 mM, rispettivamente). Da qui, ci si aspetta che qualsiasi gene non caratterizzato o proteina precedentemente riportata possa essere testato per la capacità di trasporto in varie condizioni, come l'utilizzo di diversi modelli di malattie neurodegenerative o insulti metabolici (diete ipercaloriche o restrizione nutrizionale). A questo proposito, mostriamo che il knockdown mediato dall'RNAi di un noto trasportatore di monocarbossilati riduce significativamente il trasporto del lattato nelle cellule gliali. È interessante notare che i segnali ottenuti dai sensori laconici e pironici sono altamente sensibili ai cambiamenti del lattato o del piruvato nel mezzo, consentendo una misurazione accurata dei cambiamenti intracellulari in questi metaboliti. Questa ampia gamma dinamica del segnale sembra essere diversa nelle cellule di mammifero, dove è stata osservata una relazione non lineare tra il segnale del sensore e la concentrazione intracellulare di lattato28.
Questo approccio può fornire risposte ad aspetti importanti su dove e quando i monocarbossilati e il glucosio vengono elaborati o utilizzati per generare energia nel cervello durante l'attività basale e neuronale elevata. L'aumento dell'attività neuronale causato da PTX può causare notevoli alterazioni dei metaboliti legati all'energia, in modo simile a quanto osservato nelle colture cellulari, nei vetrini cerebrali e negli organismi viventi 23,24. In particolare, un aumento della produzione di ATP si verifica pochi minuti dopo un aumento dell'attività neuronale, molto probabilmente a causa della metabolizzazione del glucosio e dello scambio di lattato e piruvato tra cellule gliali e neuroni, come precedentemente riportato17. Lo studio delle esigenze di cellule specifiche per l'apporto di glucosio e monocarbossilati, nonché dei meccanismi alla base del loro trasporto o generazione, può essere reso possibile manipolando l'espressione di alcuni geni in combinazione con l'uso di sensori geneticamente codificati.
Altri tessuti metabolicamente importanti possono facilmente legarsi ai vetrini coprioggetti rivestiti di poli-L-lisina e i cambiamenti dei metaboliti possono essere visualizzati per diversi minuti. Possono essere studiati nuovi trasportatori che mediano il trasporto del glucosio o del lattato in diversi tessuti. Il glucosio circolante viene trasportato per produrre il disaccaride trealosio nei corpi adiposi larvali attraverso meccanismi che non sono completamente compresi, questi metodi potrebbero aiutare a comprendere meglio questo percorso. Inoltre, sotto restrizione nutrizionale, gli acidi grassi possono essere metabolizzati per produrre corpi chetonici nel FB e i trasportatori necessari per estruderli all'emolinfa sono ancora sconosciuti.
È importante notare che questo protocollo può essere utilizzato per stimare l'accumulo di un metabolita nel tempo o per determinare i tassi di aumento della fluorescenza di un sensore specifico tra le condizioni, ma non per considerare formalmente i cambiamenti di "concentrazione" perché ciò richiederebbe una calibrazione del sensore in situ. I diversi strati cellulari che compongono il VNC in questo caso limitano la diffusione di molecole, come gli ionofori, necessarie per questa calibrazione. Tuttavia, si consiglia di seguire le linee guida per l'elaborazione delle immagini che consentono di confrontare i livelli di lattato tra i vari organi o cellule all'interno di un animale29,30.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti o finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i membri del Sierralta Lab. Questo lavoro è stato sostenuto da FONDECYT-Iniciación 11200477 (ad AGG) e FONDECYT Regular 1210586 (a JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (sensore di glucosio) è stato gentilmente donato da Pierre-Yves Plaçais e Thomas Preat, CNRS-Parigi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
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