Summary
ここでは、 ex-vivoショウジョウバエ の幼虫の脳調製において、遺伝的にコードされたフェルスター共鳴エネルギー伝達ベースのセンサーを使用して、グリア細胞およびニューロンにおけるモノカルボン酸塩、グルコース、およびATPの輸送を視覚化するプロトコルを提示します。
Abstract
電気的活動による脳の高いエネルギー要件は、脳の最も際立った特徴の1つです。これらの要件は、グルコースおよび乳酸モノカルボン酸塩およびピルビン酸塩などのその代謝産物からのATPの産生によって満たされる。このプロセスがどのように規制されているのか、特にショウジョウバエでは、誰が主要なプレーヤーなのかはまだ不明です。
遺伝的にコードされたフェルスター共鳴エネルギー移動ベースのセンサーを使用して、 ex-vivoショウジョウバエ 幼虫の脳調製物におけるグリア細胞およびニューロンにおけるモノカルボン酸塩およびグルコースの輸送を測定するための簡単な方法を提示します。このプロトコルでは、センサーの1つを発現している幼虫の脳を解剖し、ガラスのカバースリップに接着する方法を説明しています。
本稿では、幼虫の脳において、グリア細胞において同定されたモノカルボン酸トランスポーターをノックダウンすることにより、乳酸輸送を測定した実験全体の結果を提示する。さらに、神経細胞の活動を急速に増加させ、活動脳の代謝物の変化を追跡する方法を実証します。すべての必要な情報を提供する記載の方法は、他の ショウジョウバエ の生体組織を分析するために使用することができる。
Introduction
脳は、神経細胞の電気信号の生成と伝達、およびシナプス伝達によって引き起こされるニューロンのイオン勾配を回復するためのコストが高いため、高いエネルギー要件を持っています1,2。この高いエネルギー需要は、グルコースの連続的な酸化によって満たされ、ATP3を生成すると長い間考えられてきました。血液脳関門の特定のトランスポーターは、血液中のグルコースを脳に伝達します。一定のグリセミックレベルは、脳がグルコース4の安定した供給を受けることを保証します。興味深いことに、乳酸やピルビン酸などのグルコース代謝に由来する分子が、脳細胞のエネルギー産生に重要な役割を果たしていることを示唆する実験的証拠が増えています5,6。しかし、これらの分子がエネルギー生産にとってどれほど重要であるか、そして脳内のどの細胞がそれらを生成または使用するかについては、まだいくつかの議論があります7,8。この課題に必要な高い時間的・空間的分解能を備えた適切な分子ツールの欠如は、この論争を完全に解決することを妨げている重要な問題です。
いくつかの人工蛍光代謝センサーの開発と応用により、代謝産物がどこでどのように生成され、使用されるか、および基礎および高ニューロン活動中に代謝フラックスがどのように発生するかについての理解が著しく向上しました9。ATeam(ATP)、FLII12Pglu700μδ6(グルコース)、ラコニック(乳酸)、ピロニック(ピルビン酸)などのフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)顕微鏡に基づく遺伝的にコードされた代謝センサーは、脳のエネルギー代謝の理解に貢献しています10,11,12,13。しかし、生きた動物や組織で実験を行うには高いコストと高度な機器が必要であるため、脊椎動物モデルの結果は、主に細胞培養(グリア細胞とニューロン)に限定されています。
ショウジョウバエモデルを用いてこれらのセンサーを発現させることで、主要な代謝的特徴が種を超えて保存されており、その機能にこのツールで簡単に対処できることが明らかになりました。さらに重要なことに、ショウジョウバエモデルは、グルコースと乳酸/ピルビン酸がハエの脳内でどのように輸送および代謝されるか、モノカルボン酸の消費と記憶形成の関連性、および神経活動と代謝流束の増加がどのように重なるかの驚くべき実証に光を当てました14,15,16,17.幼虫の脳に発現する遺伝的にコードされたFRETセンサーを用いて、モノカルボン酸、グルコース、ATPレベルを測定するために今回紹介した方法により、研究者はショウジョウバエの脳がエネルギーをどのように使用しているかについてさらに学ぶことができ、それを他の動物の脳に適用することができます。
本手法がグリア細胞や神経細胞の乳酸やグルコースの検出に有効であること、グリア細胞への乳酸の取り込みにモノカルボン酸トランスポーター(Chaski)が関与していることを明らかにしました。また、GABAA 受容体拮抗薬の浴中塗布によって容易に誘導できる、神経活動の増加中の代謝物の変化を研究するための簡単な方法も示します。最後に、この方法論を使用して、脂肪体などの他の代謝的に重要な組織におけるモノカルボン酸およびグルコース輸送を測定できることを示します。
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Protocol
1.ハエのひずみ維持と幼虫の同期
- これらの実験を行うには、酵母10%、グルコース8%、小麦粉5%、寒天1.1%、プロピオン酸0.6%、メチルパラベン1.5%からなる標準的な ショウジョウバエ の餌で25°Cで飼育したハエ培養物を使用します。
- このプロトコルに従うには、次の行を使用します: w1118 (実験的制御バックグラウンド)、OK6-GAL4(運動ニューロン用ドライバー)、レポ-GAL4(すべてのグリア細胞用ドライバー)、CG-GAL4(脂肪体用ドライバー)、UAS-Pyronic(ピルビン酸センサー)、UAS-FLII12Pglu700μδ6(グルコースセンサー)、UAS-Laconic(乳酸センサー)、UAS-GCaMP6f(カルシウムセンサー)、UAS-AT1.03NL(ATPセンサー)およびUAS-Chk RNAi GD1829。センサーまたはRNAiを発現するすべての系統は、 w1118 遺伝的背景にあります。
- 同期した3番目の星内放浪幼虫を得るには、300匹のハエ(生後3〜5日、雄100匹、処女雌200匹)を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1%アガロースで覆われた60mmのシャーレを含む産卵室に入れます。プラークの中央に液体/クリーミーな酵母(直径1.5cm)を一滴垂らし、ハエが卵を産むように促します(図1)。
- ハエを25°Cで3日間保管し、アガロースペトリ皿を新鮮なシャーレと溶かしたばかりの酵母と1日2回交換します。
- 4日目にハエが4時間卵を産むのを待ってから、ペトリ皿を交換します。このプラークを取り除きます。次に、3時間、ハエが新しく溶解した酵母を含む新しいアガロースプラークに卵を産むのを待ちます。これらの幼虫を実験に使用してください。
- 3時間後、卵を含むプラークを取り除き、25°Cのインキュベーターに24時間入れます。
- このプラークから50〜100匹の新しく孵化した幼虫を集め(幼虫の孵化から0時間後)、標準的な餌が入ったプラスチック製のバイアルに入れます。幼虫が適切に餌を食べられるように、食べ物が粉砕され、柔らかくなっていることを確認してください。幼虫は移してから96時間後に使用します。
2.ポリ-L-リジンでガラスカバースリップを作ります
- このステップは、幼虫の解剖の1時間前に実行してください。6ウェル細胞培養プレートに、25 mmのガラス製カバーガラスを置きます(使用するカバーの直径は、顕微鏡で利用可能な記録チャンバーによって異なります)。
- ポリ-L-リジンを各カバーガラスの中央に滴下(300 μL)し、室温で30分間置きます。
- 各カバーガラスを蒸留水で3回洗浄し、次にCa2+ を含まない生理食塩水(幼虫の解剖に使用したのと同じ溶液、ステップ3.2を参照)で2回洗浄します。記録チャンバーにカバーを取り付け、Ca2+フリーの生理食塩水で満たします。
注:幼虫の脳はガラスカバーガラスに直接付着できますが、接着力は弱く、生理食塩水が連続的に流れるため、実験中に脳が移動したり移動したりすることがあります。ポリ-L-リジンステップを添加することで、洗浄の結果としての動きや脳喪失のリスクが軽減されます。
3.腹側神経索(VNC)と脂肪体(FB)を解剖します
- 目的の遺伝子交配(ステップ1.7から)から放浪する3番目の星齢の幼虫を集め、蒸留水で3回徹底的に洗浄します。
- 128 mM NaCl、2 mM KCl、4 mM MgCl2、5 mMトレハロース、5 mM HEPES、および35 mMスクロース(pH = 6.7、pHメーターで測定し、1 M NaOHおよびHCl 37% v/vで調整)からなる公称ゼロのCa2+氷冷生理食塩水750μLを含むガラス製解剖皿ウェルに幼虫を入れます。
注:前述したように、モノカルボン酸塩の輸送は溶液のpHに大きく依存するため、pHを6.7に設定することが重要です。さらに、6.7は3番目の幼虫17,18の血リンパ液のpHに相当します。 - 幼虫を実体顕微鏡の下に置き、一対の鉗子で腹部の後ろを横方向に切り裂きます。
- 鉗子で顎を押しながら、幼虫を裏返しにします。
- 顎の隣にある腹側神経索(VNC)を観察します。想像上の椎間板と残りの脳尾部組織を慎重に取り除きます。
- 神経を切断することにより、中枢脳と視神経葉を持つVNCを残りの組織から分離します。VNCを移し、残りの神経から鉗子で拾い上げ、Ca2+フリーの記録溶液(ステップ3.2と同じ溶液)を含む記録チャンバーに入れます。VNCはすぐにカバーガラスに付着します。
- 残った神経からの干渉を避けるために、鉗子を使用してカバーガラスの下部に取り付けます(使用するドライバーラインによっては、神経も蛍光を発します)(図2)。
- 別の一連の実験でグルコースまたはモノカルボン酸の輸送を測定する脂肪体(FB)で実験を行うには、手順3.1〜3.4に従って組織を分離します。幼虫が裏返しになったら、FBが白い両側の平らな組織であることを観察します。
- FRETセンサーを発現する単離されたFB(適切なドライバーを使用して遺伝子交配から得られた)を、Ca2+を含まない記録溶液を含む記録チャンバーに入れます。
注:FBは疎水性が高く(溶液の表面に浮く傾向がある)、鉗子による操作に対して非常に脆弱であるため、取り扱いには注意が必要です。この組織を乱暴に扱うと、後で細胞が死んでしまいます(センサーの蛍光が低下します)。 - VNC/FBを含む記録チャンバーを顕微鏡ステージに置きます。
4. 生細胞イメージング
- 組織発現センサーの画像を取得するには、発光分解システムとCCDカメラを組み合わせた正立蛍光顕微鏡を使用します。実験を開始する30分前に顕微鏡の照明システムをオンにします。
注:ここでは、20倍/0.5の水浸対物レンズを備えたスピニングディスク蛍光顕微鏡を使用して、VNCとFBの両方を観察します。 図 2 は、40倍/0.8の水浸対物レンズの使用も示しています。 - GCaMP6fの蛍光を可視化するには、励起波長を488 nm、発光波長を540 nmに設定します。ラコニック/パイロニック/ATP/グルコースセンサの場合、励起波長を440 nm、発光波長を488 nm(mTFP、CFP)および540 nm(金星、YFP)に設定します。
- GCaMP6fでは2秒ごと、ラコニック/パイロニック/ATP/グルコースセンサーでは10-30秒ごとに512 x 512ピクセルサイズの画像を取得します。得られた画像の品質を観察して、光源への最適な露出を決定します。このプロトコルに従うには、画像がラコニックおよびパイロニックセンサーの場合は300ミリ秒、グルコースおよびATPセンサーの場合は100〜150ミリ秒の露光であることを確認してください。
注意: 曝露は、共焦点顕微鏡または通常の蛍光顕微鏡の使用によって異なる場合があります。 - 記録チャンバーを顕微鏡のステージに取り付けたら、水浸対物レンズを慎重に配置し、実験中、対物レンズが水没したままであることを確認してください。室温は25°Cに保ちます。
- 記録チャンバーを灌流システムに接続し、128 mM NaCl、2 mM KCl、1.5 mM CaCl2、4 mM MgCl2、5 mMトレハロース、5 mM HEPES、および35 mMスクロース、pH 6.7(pHメーターで測定し、NaOHおよびHClで調整)を含む記録溶液に組織を浸し続けます。
- 重力を利用して組織内を通る記録溶液の3 mL/分の一定の流量を維持し、低フラックスの蠕動ポンプと組み合わせて、容量を一定に保ちながらチャンバーから液体を抽出します。必要な流量を得るには、溶液含有チューブ(50 mLプラスチックチューブ)を顕微鏡ステージの25cm上に配置します。
注:この重力駆動の流れは、蠕動ポンプによって引き起こされる組織の動きを防ぐために使用され、後でより正確な画像分析を可能にします。 - 刺激の前に、記録溶液を5〜10分間流し続けて、センサーから安定した蛍光のベースラインを取得します。このベースラインを取得するために、必要に応じて期間を変更します。
- 流動溶液を刺激溶液と5分間交換して、VNC / FBを刺激します(生理食塩水に溶解した各実験で説明した濃度のグルコース、ピルビン酸、または乳酸で、各図を参照)。
注:刺激の持続時間は、実験の必要性に応じて変化させることができる(例えば、以前に報告されたように、グルコースパルスを10分に増やしてニューロンのプラトーに達することができる16)。 - 刺激液中の浸透圧を維持するには、添加するモノカルボン酸またはグルコースの濃度に応じて、ショ糖濃度(ショウ ジョウバエ の脳で代謝されない炭水化物)を整流します。
- シンプルなバルブシステムを使用してソリューションを変更します。顕微鏡ステージを動かさないように注意してください。
- VNCを80μMのピクロトキシン(PTX、連続的に流れる)に曝露して、ニューロンの活動を刺激します。この手順により、Ca2+ 振動の頻度が増加し、代謝的に関連する分子(細胞内ATPなど)の変化を観察することが可能になります。
- 実験の最後に、チューブと記録チャンバーを含むフローシステム全体を生理食塩水で少なくとも10分間、蒸留水でさらに10分間完全に洗浄して、使用した溶液の痕跡を取り除きます。
5. 画像処理とデータ解析
- 取得した画像を処理するには、 図 3 に示す手順に進みます。
- 画像(Laconic)をImageJソフトウェアにインポートします。この画像にはサンプルの2つのビューがあり、左がmTFP信号、右が金星信号です。解析する細胞を含む領域を選択し、これらの画像(mTFPと金星)を新しいウィンドウで分離します。これらの画像にまったく同じ領域が含まれていることを確認します。
- レジストレーションプラグインを開き、剛体関数を用いた実験で通常観察される組織の小さなドリフトを補正します。これを両方の画像(mTFPと金星)で実行します。
- mTFPシグナル(488 nm)の対応する10個の細胞の細胞質で少なくとも10個の関心領域(ROI)を選択し、その選択をVenus(540 nm)画像に転送します。
- 分析対象の細胞の近くにあるが、識別可能なシグナルがないROIを2つまたは3つ選択します(常に分析対象のVNCまたは組織内、 図3を参照)。これらは背景のROIです。
- 両方のイメージで ROI を選択した状態で、関数 measure を使用して各信号の平均グレー値を取得します。データをデータシートに転送し、各信号の平均バックグラウンド値を減算します。
- 金星のmTFP蛍光比を決定します(ラコニックとパイロニックの場合)。この値は、ここで説明する他のFRETセンサー(比率は通常YFP/CFP)とは異なる方法で計算されますが、これは、それぞれの基板に結合すると、ラコニックとパイロニックの両方がFRET効率を低下させるためです。
- 記録された各値をベースラインで除算してデータを正規化します。別のデータシートで、刺激の前の2分間のmTFP/Venus比の平均値を使用してベースラインを計算します。
- FRETベースのセンサーを使用したグルコースとATPの測定では、YFP/CFP比を計算し、ステップ5.8の説明に従ってデータを正規化します。
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Representative Results
この手順により、最大1時間、モノカルボン酸およびグルコースセンサーの蛍光の細胞内変化を簡単に測定できます。 図4に示すように、グリア細胞と運動ニューロンの両方のラコニックセンサーは、パルスの開始時に1mMの乳酸に同様の速度で応答しますが、運動ニューロンは、以前に実証されたように、5分間のパルス中にベースラインよりも高い増加に達します17。この乳酸濃度が選ばれたのは、第3齢幼虫の血リンパ液に見られるレベルに匹敵するからです。同様に、VNC発現グルコースセンサーが5mMのグルコース(私たちらによって血リンパで測定された値と同様の値)に曝露されたとき19、センサーのシグナルはグリア細胞とニューロンで同様の速度で増加しました。しかし、グルコースパルスの間、ニューロンの信号はグリア細胞よりも増加します。これは、同様のFRETセンサー発現調製物の以前の観察と一致している16。
この調製物は、 ショウジョウバエ のグリア細胞またはニューロンで発現する未記載のモノカルボン酸およびグルコーストランスポーターに関する実験を行うために使用することができる20。ここでは、RNA干渉を利用して、異種細胞ではモノカルボン酸塩を輸送することが以前から知られていたChaski(Chk)が、グリア細胞では乳酸を輸送することを示しています(図5)。栄養制限条件下では、このトランスポーターは動物の生理学と行動において重要な役割を果たしていると説明されました21。グリア細胞では、Chkをノックアウトすると、1 mMの乳酸に曝露されたコントロールVNCと比較して、乳酸輸送が減少することがわかりました(図5)。他の推定トランスポーターは、生理学的および病理学的条件で代謝産物を輸送できるかどうかを調べるためにテストできます。
神経細胞の活動に関連する代謝変化の研究に取り組むために、FRETセンサーの測定に干渉する可能性のあるオプトジェネティクスなどの技術的に複雑な手順を使用せずに、神経細胞の活動を増加させる簡単な方法を開発しました(図6)。単離されたVNCは、以前に私たちや他の人が使用した既知のGABAA受容体拮抗薬であるピクロトキシン(PTX)に曝露されました17,22。使用される濃度は、ニューロンのカルシウム振動の頻度(GCaMP6f蛍光の変化によって測定される)と、グルコース、乳酸、ピルビン酸などの代謝関連分子の有意な変化を増加させる17。さらに、PTXによって誘発されるニューロン活動の増加は、運動ニューロンの体細胞におけるATPレベルの一時的な低下をもたらします。この現象は、電気刺激またはGABAA受容体拮抗薬の使用によって神経細胞の活動が増加した脊椎動物モデルで以前に報告されています23,24。その結果、このモデルを使用して、ニューロンとグリア細胞の特定のサブセットの代謝変化を追跡し、神経細胞の活動が活発なときにATP産生に寄与するエネルギー関連トランスポーターの必要性に対処することができます。
グルコースとモノカルボン酸の輸送は、脳以外の組織や細胞でも重要です。ここでは、脂質貯蔵や代謝などのいくつかの重要な機能を持つ幼虫と成虫のハエに存在する代謝関連組織である脂肪体におけるモノカルボン酸塩(乳酸/ピルビン酸)とグルコース取り込みの視覚化を示します25。ラコニックセンサーは、 図7に示すようにFBでよく発現しており、脂質滴は細胞内の小さな黒い球体として見ることができます。この単離された組織は、ポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラスによく接着するため、分析も容易な長期の細胞イメージング手順が可能になります。血リンパ液中のグルコース濃度に近いグルコース濃度の上昇(約5 mM)にFBを曝露すると、グルコースセンサーの蛍光が有意に増加しました。さらに高濃度のグルコース(10 mM)に曝露しても、センサーの蛍光は期待どおりに増加しません。最後に、FBでは、乳酸とピルビン酸の輸入量を測定することができました(図7C、D)。この場合、乳酸とピルビン酸の濃度を上げると、ラコニック蛍光とピロン蛍光が比例して増加します(0.1〜1 mMの範囲)。モノカルボン酸濃度が高くなると、細胞内のシグナルが飽和します。
図1:ショウ ジョウバエ 幼虫の同期。 幼虫の同期手順を図式で示しています。プロセス開始の 2 時間前に、1% アガロースプレートを調製し、4 日目まで 1 日 2 回交換する必要があります。孵化した幼虫は慎重に収集する必要があります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:乳酸センサーLaconicを発現するショウ ジョウバエ 幼虫の単離脳。 (A)単離された ショウジョウバエ 第3齢幼虫の分離VNCがポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラスに付着し、運動ニューロンで乳酸センサーLaconic(OK6-GAL4)を発現している代表的な画像。画像は、20倍の水浸対物レンズで撮影されたVNC(左)とセンサーのmTFP蛍光(中央のパネル)の明視野画像を示しています。下のパネルの画像は、40倍の水浸対物レンズで撮影した同じVNCです。(B)乳酸ゼロ生理食塩水に入れたラコニック乳酸センサー(OK6>ラコニック)を発現するVNCの運動ニューロン。この画像は、mTFP蛍光(左)、金星蛍光(中央)、および2つの蛍光の比率(右、ImageJソフトウェアのRatio Plusプラグインを使用して生成)を示しています。スケールバー = 50 μm (A、上部パネル)、10 μm (A 、下部パネル、 B)。略語:VNC =腹側神経索;mTFP = 単量体ティール蛍光タンパク質。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:画像の段階的な分析。 画像解析用の ImageJ ソフトウェアプロトコルの概略図で、プロセス (1 列目)、ImageJ コマンド (2 列目)、および画像処理結果 (3 列目) を表示しています。この例は、運動ニューロン(OK6-GAL4)のラコニック乳酸センサーを発現するVNCから取得した生の画像から始まります。略語:VNC =腹側神経索;mTFP = 単量体ティール蛍光タンパク質。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4: ショウジョウバエ 幼虫脳のニューロンとグリア細胞におけるモノカルボン酸とグルコースの輸送。 (A)運動ニューロン(OK6-Gal4>ラコニック)に乳酸センサーラコニックを発現するVNCの代表画像。運動ニューロンのラコニック蛍光は、1 mMの乳酸の5分間のパルスの前、最中、後に見られます。ImageJのRatio Plusプラグインを使用して、比率画像(mTFP/Venus)を作成しました。スケールバー = 10 μm。 (B)1 mM 乳酸に 5 分間曝露した運動ニューロン(OK6-GAL4、灰色の線)またはグリア細胞(REPO-GAL4、黒線)のラコニック乳酸センサーを発現する単離された VNC からの FRET シグナルの代表的な記録。トレースは、乳酸曝露の 2 分前に収集された平均値に調整された FRET 信号を示しています。(C)5 mMグルコースに5分間曝露した運動ニューロン(OK6-GAL4、灰色の線)またはグリア細胞(REPO-GAL4、黒線)におけるグルコースセンサーFLII12Pglu700μδ6を発現する単離されたVNCからのFRET信号の代表的な記録。トレースは、グルコース曝露の 2 分前に収集された平均値に調整された FRET 信号を示しています。略語:VNC =腹側神経索;mTFP = 単量体ティール蛍光タンパク質;FRET = Föster共鳴エネルギー移動。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:Chaski RNAiを発現する ショウジョウバエ 幼虫脳のグリア細胞における乳酸輸送。 (A)乳酸センサーラコニックを単独で発現する単離されたVNC(遺伝的対照、 w1118、黒線)またはRNAiを共発現してChaski(Chk)発現をノックダウンする(chk-RNAi、マゼンタ)を1 mM乳酸に5分間曝露した。各条件について、トレースは 7 つの個別の VNC から得られた平均 FRET 値を表します(条件ごとに 70 セル、乳酸に曝露される 2 分前に得られた平均値を使用して正規化)。(B) A の曲線下の面積は、細胞内の乳酸蓄積を計算するために使用されます。各条件の値は、70 個の細胞と 7 つの独立した実験 (コントロールまたは chk-RNAi) からの平均 SE です。対応のないスチューデントの t検定を統計分析に使用しました(*p < 0.05)。略語:VNC =腹側神経索;FRET = Föster共鳴エネルギー移動。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:ピクロトキシン曝露によって誘発される神経細胞のATPレベルの変化。線で示された時間中にGABAA受容体拮抗薬ピクロトキシン(80μM)に曝露された運動ニューロン(OK6-GAL4)の遺伝的にコードされた(A)カルシウムセンサーGCaMP6fまたは(B、別の実験セット)ATPセンサーAT1.03NLを発現するVNCからキャプチャされた蛍光の記録。代表的な記録は、PTX曝露の2分前に得られた平均値に正規化されたVNC(A)からの単一の運動ニューロン(A)または単一のVNC(B)からの10細胞の平均±SEから得られます。略語:VNC =腹側神経索;PTX = ピクロトキシン;SE = 標準誤差;CFP = シアン蛍光タンパク質。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図7: ショウジョウバエ の脂肪体におけるモノカルボン酸塩とグルコースの輸送。 (A)乳酸センサーラコニック(mTFP蛍光)を発現する第3齢幼虫から分離された脂肪体の画像。スケールバー = 10 μm。 (B)グルコース(1、5、10 mMのグルコース)に曝露されたグルコースセンサー(FLII12Pglu700μδ6)を発現するFBで捕捉された正規化シグナルの代表的なトレース。データは、グルコース曝露の最初の2分間に正規化されました。 (C、D)0.1〜0.5〜1mMの乳酸またはピルビン酸に曝露された乳酸センサー(C)またはピルビン酸センサー(D)を発現するFBから得られた正規化シグナルの代表的なトレース。データは、乳酸またはピルビン酸曝露の最初の2分前に正規化されました。略語:FB =ファットボディ;mTFP = 単量体ティール蛍光タンパク質;YFP = 黄色蛍光タンパク質;CFP = シアン蛍光タンパク質。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ショウ ジョウバエ モデルを脳代謝の研究に用いるのは比較的新しいことであり26、哺乳類の代謝と予想以上に多くの特徴を共有することが示されており、これは主に初代ニューロン培養または脳スライスで in vitro で研究されてきた。 ショウジョウバエ は、一連の遺伝的ツールと遺伝的にコード化されたセンサーのおかげで、研究者が誘発された活動や感覚刺激に反応して引き起こされる代謝変化をリアルタイムで視覚化できるため、 in vivo 実験に優れています。
ここに記述されているプロトコルは休息し、活動的なニューロンの新陳代謝の変更の時転倒のビデオを作るのにFRETの顕微鏡検査に基づいて遺伝的にコードされた蛍光代謝センサーの使用を可能にするex-vivo準備のショウジョウバエVNCのglial細胞そしてニューロンのmonocarboxylateそしてブドウ糖の輸送を測定する方法を示す。このプロトコルは、発光分割システムを備えた落射蛍光顕微鏡を使用して、複雑な機械を使用せずにショウジョウバエモデルを使用する任意のラボで簡単に取り付けて実行できます。また、ショウジョウバエの成体脳で発生するように、脳のより深い位置にある特定の細胞を記録するために、回転する円盤、レーザー共焦点、または2光子顕微鏡(ただし、発光を分割するためのスプリッターが必要)などのより高度な機器に拡張することもできます。これらのタイプの代謝シグナルは比較的遅いため、高速または高価なビデオカメラは必要ありません。
さらに、単離されたVNCまたはFB調製は、 in vivo 記録に時々必要となる動き補正のための高度な方法を必要としません。ImageJプラグインは、実験中に生成されるVNCの動きのほとんどを十分に修正できます。その結果、PTXの添加または関連する代謝産物の添加によるニューロン活動の増加は、他のプロトコル(フィレット調製など)に見られるように、自然な身体の筋肉収縮によって引き起こされる問題なしに同時に行うことができる27。
乳酸とグルコースの輸送が、これらの代謝産物の生理学的に適切な濃度(それぞれ1 mMと5 mM)で明確に観察される代表的な実験を示します。ここから、特徴不明の遺伝子や以前に報告されたタンパク質は、神経変性疾患や代謝障害(高カロリー食や栄養制限)のさまざまなモデルを使用するなど、さまざまな条件で輸送能力をテストできるようになることが期待されます。この点に関して、RNAiを介した既知のモノカルボン酸トランスポーターのノックダウンは、グリア細胞における乳酸輸送を有意に減少させることを示しています。興味深いことに、ラコニックセンサーとピロニックセンサーから得られる信号は、培地中の乳酸またはピルビン酸の変化に非常に敏感であり、これらの代謝産物の細胞内変化を正確に測定することができます。この十分な信号のダイナミックレンジは、センサーの信号と細胞内乳酸濃度との間に非線形関係が観察されている哺乳類細胞では異なるようである28。
このアプローチは、基底および高ニューロン活動中に脳内でエネルギーを生成するために、モノカルボン酸塩とグルコースがいつどこで処理または利用されるかについての重要な側面に対する答えを提供することができます。PTXによって引き起こされるニューロン活動の増加は、細胞培養、脳スライド、および生物で見られたものと同様に、エネルギー関連の代謝物にかなりの変化を引き起こす可能性があります23,24。具体的には、ATP産生の急増は、以前に報告されたように、ニューロンの活動が増加してから数分後に起こり、おそらくグルコース代謝と、グリア細胞とニューロン間の乳酸とピルビン酸の交換が原因です17。グルコースおよびモノカルボン酸塩の供給に対する特定の細胞のニーズ、ならびにそれらの輸送または生成の根底にあるメカニズムの研究は、遺伝的にコードされたセンサーの使用と組み合わせて特定の遺伝子の発現を操作することによって可能になる。
他の代謝的に重要な組織は、ポリ-L-リジンでコーティングされたカバーガラスに容易に結合でき、代謝物の変化を数分間画像化できます。異なる組織におけるグルコースまたは乳酸の輸送を媒介する新規トランスポーターを研究することができます。循環グルコースは、完全には理解されていないメカニズムを介して幼虫の脂肪体内で二糖トレハロースを生成するために輸送されますが、これらの方法は、この経路をよりよく理解するのに役立つ可能性があります。さらに、栄養制限下では、脂肪酸が代謝されてFBでケトン体が生成されますが、脂肪酸を血リンパ液に押し出すために必要なトランスポーターはまだ不明です。
このプロトコルは、経時的な代謝産物の蓄積を推定したり、条件間の特定のセンサーの蛍光の増加率を決定したりするために使用できますが、in-situセンサーの校正が必要になるため、「濃度」の変化を正式に考慮しないことに注意することが重要です。この場合、VNCを構成するいくつかの細胞層は、このキャリブレーションに必要なイオノフォアなどの分子の拡散を制限します。ただし、動物内のさまざまな臓器または細胞間で乳酸レベルを対比できる画像処理ガイドラインに従うことをお勧めします29,30。
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Disclosures
著者は、競合または金銭的利益がないことを宣言します。
Acknowledgments
Sierralta Labのメンバーの皆様に感謝いたします。この研究は、FONDECYT-Iniciación 11200477 (AGGへ) と FONDECYT Regular 1210586 (JSへ) の支援を受けました。UAS-FLII12Pglu700μδ6 (グルコースセンサー) は、CNRS-ParisのPierre-Yves Plaçais氏とThomas Preat氏のご厚意により寄贈されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
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