Summary
Aquí presentamos un protocolo para visualizar el transporte de monocarboxilatos, glucosa y ATP en células gliales y neuronas utilizando sensores basados en transferencia de energía por resonancia de Förster codificados genéticamente en una preparación cerebral larvaria de Drosophila ex-vivo .
Abstract
Los altos requerimientos energéticos de los cerebros debido a la actividad eléctrica son una de sus características más distintivas. Estos requisitos se satisfacen mediante la producción de ATP a partir de la glucosa y sus metabolitos, como los monocarboxilatos lactato y piruvato. Todavía no está claro cómo se regula este proceso o quiénes son los actores clave, particularmente en Drosophila.
Utilizando sensores basados en la transferencia de energía por resonancia de Förster codificados genéticamente, presentamos un método simple para medir el transporte de monocarboxilatos y glucosa en células gliales y neuronas en una preparación cerebral de larva de Drosophila ex vivo . El protocolo describe cómo diseccionar y adherir un cerebro larvario que expresa uno de los sensores a un cubreobjetos de vidrio.
Presentamos los resultados de un experimento completo en el que se midió el transporte de lactato en cerebros de larvas mediante la eliminación de transportadores de monocarboxilato previamente identificados en células gliales. Además, demostramos cómo aumentar rápidamente la actividad neuronal y rastrear los cambios en los metabolitos en el cerebro activo. El método descrito, que proporciona toda la información necesaria, puede utilizarse para analizar otros tejidos vivos de Drosophila .
Introduction
El cerebro tiene altos requerimientos de energía debido al alto costo de restaurar los gradientes iónicos en las neuronas causados por la generación y transmisión de señales eléctricas neuronales, así como la transmisión sináptica 1,2. Durante mucho tiempo se ha pensado que esta alta demanda de energía se satisface mediante la oxidación continua de la glucosa para producir ATP3. Transportadores específicos en la barrera hematoencefálica transfieren la glucosa de la sangre al cerebro. Los niveles glucémicos constantes aseguran que el cerebro reciba un suministro constantede glucosa. Curiosamente, la creciente evidencia experimental sugiere que las moléculas derivadas del metabolismo de la glucosa, como el lactato y el piruvato, juegan un papel importante en la producción de energía de las células cerebrales 5,6. Sin embargo, todavía existe cierto debate sobre la importancia de estas moléculas para la producción de energía y qué células del cerebro las producen o utilizan 7,8. La falta de herramientas moleculares apropiadas con la alta resolución temporal y espacial requerida para esta tarea es un problema importante que ha impedido que esta controversia se resuelva por completo.
El desarrollo y la aplicación de varios sensores metabólicos fluorescentes diseñados han dado lugar a un aumento notable en nuestra comprensión de dónde y cómo se producen y utilizan los metabolitos, así como de cómo se producen los flujos metabólicos durante la actividad basal y neuronalalta. Los sensores metabólicos codificados genéticamente basados en la microscopía de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster, como ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glucosa), Laconic (lactato) y Pyronic (piruvato), han contribuido a nuestra comprensión del metabolismo energético cerebral 10,11,12,13. Sin embargo, debido a los altos costos y al equipo sofisticado requerido para realizar experimentos en animales o tejidos vivos, los resultados en modelos de vertebrados todavía se limitan principalmente a cultivos celulares (células gliales y neuronas).
El uso emergente del modelo de Drosophila para expresar estos sensores ha revelado que las características metabólicas clave se conservan en todas las especies y su función se puede abordar fácilmente con esta herramienta. Más importante aún, el modelo de Drosophila ha arrojado luz sobre cómo la glucosa y el lactato/piruvato se transportan y metabolizan en el cerebro de la mosca, el vínculo entre el consumo de monocarboxilato y la formación de la memoria, y la notable demostración de cómo los aumentos en la actividad neuronal y el flujo metabólico se superponen 14,15,16,17. El método presentado aquí para medir los niveles de monocarboxilato, glucosa y ATP utilizando sensores FRET codificados genéticamente expresados en el cerebro de las larvas permite a los investigadores aprender más sobre cómo el cerebro de Drosophila utiliza la energía, que se puede aplicar a los cerebros de otros animales.
Demostramos que este método es eficaz para detectar lactato y glucosa en células gliales y neuronas, y que un transportador de monocarboxilato (Chaski) está implicado en la importación de lactato a las células gliales. También demostramos un método simple para estudiar los cambios en los metabolitos durante el aumento de la actividad neuronal, que se puede inducir fácilmente mediante la aplicación en baño de un antagonista del receptor GABAA . Finalmente, demostramos que esta metodología se puede utilizar para medir el transporte de monocarboxilato y glucosa en otros tejidos metabólicamente significativos, como los cuerpos grasos.
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Protocol
1. Mantenimiento de la cepa de mosca y sincronización larvaria
- Para realizar estos experimentos, se utilizaron cultivos de moscas criados a 25 °C en alimentos estándar de Drosophila compuestos por un 10% de levadura, un 8% de glucosa, un 5% de harina de trigo, un 1,1% de agar, un 0,6% de ácido propiónico y un 1,5% de metilparabeno.
- Para seguir este protocolo, utilice las siguientes líneas: w1118 (antecedentes de control experimental), OK6-GAL4 (controlador para neuronas motoras), repo-GAL4 (controlador para todas las células gliales), CG-GAL4 (controlador para cuerpos grasos), UAS-Pyronic (sensor de piruvato), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (sensor de glucosa), UAS-Laconic (sensor de lactato), UAS-GCaMP6f (sensor de calcio), UAS-AT1.03NL (sensor de ATP) y UAS-Chk RNAi GD1829. Todas las líneas que expresan sensores o RNAi están en el fondo genético w1118 .
- Para obtener larvas errantes sincronizadas del tercer estadio, coloque 300 moscas (de 3 a 5 días de edad, 100 machos, 200 hembras vírgenes) del cruce genético deseado en la cámara de puesta de huevos, que contiene una placa de Petri de 60 mm cubierta con agarosa al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Coloque una gota de levadura líquida/cremosa (1,5 cm de diámetro) en el centro de la placa para animar a las moscas a poner huevos (Figura 1).
- Mantenga las moscas a 25 °C durante 3 días, reemplazando la placa de Petri de agarosa por una fresca y levadura recién disuelta dos veces al día.
- Deje que las moscas pongan huevos durante 4 h el cuarto día antes de cambiar la placa de Petri. Retira esta placa. Luego, durante 3 h, deje que las moscas pongan huevos en una nueva placa de agarosa con levadura recién disuelta. Utiliza estas larvas en los experimentos.
- Después de 3 h, retire la placa que contiene los huevos y colóquela en una incubadora a 25 °C durante 24 h.
- Recoja de 50 a 100 larvas recién eclosionadas de esta placa (0 h después de la eclosión de las larvas) y colóquelas en un frasco de plástico que contenga alimento estándar. Para permitir que las larvas se alimenten adecuadamente, asegúrese de que la comida esté molida y blanda. Utilizar las larvas 96 h después de la transferencia.
2. Hacer los cubreobjetos de vidrio con poli-L-lisina
- Realice este paso 1 h antes de la disección larvaria. En una placa de cultivo celular de 6 pocillos, coloque cubreobjetos de vidrio de 25 mm (el diámetro de las cubiertas a utilizar depende de la cámara de registro disponible en el microscopio).
- Coloque una gota (300 μL) de poli-L-lisina en el centro de cada cubreobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lave cada cubreobjetos 3 veces con agua destilada, luego 2 veces con una solución salina desprovista de Ca2+ (la misma solución utilizada para diseccionar las larvas, consulte el paso 3.2). Instale las tapas en la cámara de grabación y llénela con solución salina libre de Ca2+.
NOTA: Aunque el cerebro de la larva puede adherirse directamente a los cubreobjetos de vidrio, la adherencia es débil y el cerebro ocasionalmente se mueve o desplaza durante el experimento debido al flujo continuo de solución salina. La adición del paso de poli-L-lisina reduce el riesgo de movimientos o incluso pérdida de cerebro como resultado de los lavados.
3. Diseccionar el cordón nervioso ventral (VNC) y los cuerpos grasos (FB)
- Reúna las larvas errantes del tercer estadio del cruce genético deseado (del paso 1.7) y lávelas bien 3 veces con agua destilada.
- Colocar las larvas en un recipiente de disección de vidrio que contenga 750 μL de solución salina helada de Ca2+ nominalmente nula compuesta por 128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 4 mM de MgCl2, 5 mM de trehalosa, 5 mM de HEPES y 35 mM de sacarosa (pH = 6,7, medido con un medidor de pH y ajustado con 1 M de NaOH y HCl 37% v/v).
NOTA: Establecer el pH en 6.7 es fundamental porque, como se observó anteriormente, el transporte de monocarboxilato depende en gran medida del pH de la solución. Además, 6,7 corresponde al pH en la hemolinfa de una larva de tercer estadio17,18. - Coloque la larva bajo un microscopio estereoscópico y haga un corte transversal en la parte posterior del abdomen con un par de fórceps.
- Empuja la mandíbula con las pinzas mientras volteas las larvas del revés.
- Observe el cordón nervioso ventral (VNC, por sus siglas en inglés) junto a la mandíbula. Retire con cuidado los discos imaginales y los tejidos cerebrales y caudales restantes.
- Separe el VNC con el cerebro central y los lóbulos ópticos del resto del tejido cortando los nervios. Transfiera el VNC, recojándolo con pinzas de los nervios restantes y colocándolo en la cámara de registro que contiene la solución de grabación libre de Ca2+ (la misma solución del paso 3.2). Los VNC se adherirán inmediatamente a los cubreobjetos.
- Para evitar la interferencia de los nervios restantes, fíjelos en la parte inferior del cubreobjetos con pinzas (los nervios también serán fluorescentes dependiendo de la línea de conducción utilizada) (Figura 2).
- Para realizar experimentos en cuerpos grasos (FBs) midiendo el transporte de glucosa o monocarboxilato en otro conjunto de experimentos, proceda a aislar los tejidos siguiendo los pasos 3.1-3.4. Una vez que las larvas se hayan volteado, observe que el FB es un tejido blanco, bilateral y plano.
- Coloque los FB aislados que expresan los sensores FRET (obtenidos a partir de un cruce genético utilizando los controladores apropiados) en la cámara de registro que contiene la solución de registro sin Ca2+.
NOTA: El FB es altamente hidrofóbico (tiende a flotar en la superficie de la solución) y extremadamente vulnerable a la manipulación con fórceps, debe manipularse con cuidado. Cualquier manipulación brusca de este tejido dará lugar a células muertas más adelante (con una disminución de la fluorescencia de los sensores). - Coloque la cámara de registro que contiene VNC/FB en la platina del microscopio.
4. Obtención de imágenes de células vivas
- Para adquirir imágenes de los sensores de expresión de tejido, utilice un microscopio de fluorescencia vertical acoplado a un sistema de división de emisiones y una cámara CCD. Encienda el sistema de iluminación del microscopio 30 minutos antes de comenzar cualquier experimento.
NOTA: Aquí utilizamos un microscopio de fluorescencia de disco giratorio equipado con un objetivo de inmersión en agua de 20x/0,5 para observar tanto VNC como FB. La Figura 2 también muestra el uso de un objetivo de inmersión en agua de 40x/0,8. - Para visualizar la fluorescencia GCaMP6f, establezca las longitudes de onda de excitación y emisión en 488 nm y 540 nm, respectivamente. Para sensores lacónicos/piroónicos/ATP/glucosa, ajuste la longitud de onda de excitación a 440 nm y las longitudes de onda de emisión a 488 nm (mTFP, CFP) y 540 nm (Venus, YFP).
- Adquiera imágenes de 512 x 512 píxeles cada 2 s para GCaMP6f y cada 10-30 s para sensores lacónicos/piroónicos/ATP/glucosa. Determinar la exposición óptima a la fuente de luz observando la calidad de la imagen obtenida. Para seguir este protocolo, asegúrese de que las imágenes sean de exposición de 300 ms para los sensores lacónicos y piroónicos y de 100-150 ms para los sensores de glucosa y ATP .
NOTA: La exposición puede variar según el uso de un microscopio de fluorescencia confocal o normal. - Una vez instalada la cámara de registro en la platina del microscopio, coloque con cuidado el objetivo de inmersión en agua y asegúrese de que el objetivo permanezca sumergido durante todo el experimento. Mantenga la temperatura ambiente a 25 °C.
- Conecte la cámara de registro a un sistema de perfusión y mantenga los tejidos bañados en la solución de registro que contiene 128 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1,5 mM de CaCl2, 4 mM de MgCl2, 5 mM de trehalosa, 5 mM de HEPES y 35 mM de sacarosa, pH 6,7 (medido con un medidor de pH y ajustado con NaOH y HCl).
- Mantener un flujo constante de 3 mL/min de solución de registro a través del tejido utilizando la gravedad, acoplado a una bomba peristáltica de bajo flujo para extraer el líquido de la cámara manteniendo el volumen constante. Para lograr el caudal requerido, coloque los tubos que contienen solución (tubos de plástico de 50 ml) a 25 cm por encima de la platina del microscopio.
NOTA: Este flujo impulsado por la gravedad se utiliza para evitar el movimiento del tejido causado por las bombas peristálticas, lo que permite un análisis de imágenes más preciso más adelante. - Antes de cualquier estimulación, mantenga la solución de registro fluyendo durante 5-10 minutos para obtener una línea de base estable de fluorescencia de los sensores. Cambie la duración según sea necesario para obtener esta línea base.
- Sustituya la solución fluida por la solución de estimulación durante 5 min para estimular los VNC/FB (con glucosa, piruvato o lactato a la concentración descrita para cada experimento disuelto en solución salina; véase cada figura).
NOTA: La duración de la estimulación puede variar según las necesidades del experimento (por ejemplo, los pulsos de glucosa pueden aumentarse a 10 min para alcanzar una meseta en las neuronas, como se informó anteriormente16). - Para mantener la osmolaridad en la solución de estimulación, rectifique la concentración de sacarosa (un carbohidrato no metabolizable por el cerebro de Drosophila ) de acuerdo con la concentración del monocarboxilato o glucosa agregada.
- Cambie las soluciones mediante un sencillo sistema de válvulas. Tenga cuidado de no mover la platina del microscopio.
- Exponer el VNC a 80 μM de picrotoxina (PTX, flujo continuo) para estimular la actividad neuronal. Este procedimiento aumenta la frecuencia de las oscilaciones de Ca2+ , lo que permite observar cambios en moléculas metabólicamente relevantes (por ejemplo, ATP intracelular).
- Al final de cualquier experimento, lavar a fondo todo el sistema de flujo, incluidos los tubos y la cámara de registro, durante al menos 10 minutos con la solución salina y otros 10 minutos con agua destilada para eliminar cualquier rastro de las soluciones utilizadas.
5. Procesamiento de imágenes y análisis de datos
- Para procesar las imágenes obtenidas, continúe con los pasos que se muestran en la Figura 3.
- Importe la imagen (lacónica) al software ImageJ. La imagen tiene dos vistas de la muestra: la de la izquierda es la señal mTFP y la de la derecha es la señal de Venus. Seleccione una región que incluya las células que se van a analizar y separe estas imágenes (mTFP y Venus) en una nueva ventana. Asegúrese de que estas imágenes contengan exactamente la misma área.
- Abra el complemento de registro y corrija la pequeña deriva del tejido que normalmente se observa en el experimento con la función cuerpo rígido. Realice esto en ambas imágenes (mTFP y Venus).
- Seleccione al menos 10 regiones de interés (ROI) en el citosol de las 10 células correspondientes en la señal mTFP (488 nm) y transfiera las selecciones a la imagen de Venus (540 nm).
- Seleccione dos o tres ROI cercanos a las células que se están analizando pero sin señal discernible (siempre dentro del VNC o tejido analizado, ver Figura 3). Estos son los ROI de fondo.
- Con los ROI seleccionados en ambas imágenes, obtenga el valor medio de gris de cada señal utilizando la función measure. Transfiera los datos a una hoja de datos y reste el valor de fondo promedio para cada señal.
- Determine la relación de fluorescencia mTFP sobre Venus (para lacónico y piroónico). Este valor se calcula de manera diferente a los otros sensores FRET descritos aquí (donde la relación suele ser YFP/CFP) porque cuando se unen a sus respectivos sustratos, tanto Laconic como Pyronic reducen sus eficiencias FRET.
- Normalice los datos dividiendo cada valor registrado por la línea base. En una hoja de datos separada, calcule la línea de base tomando el valor medio de la relación mTFP/Venus durante los 2 minutos anteriores al estímulo.
- Para las mediciones de glucosa y ATP utilizando sensores basados en FRET, calcule la relación YFP/CFP y normalice los datos como se describe en el paso 5.8.
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Representative Results
Durante un máximo de 1 h, este procedimiento permite medir fácilmente los cambios intracelulares en la fluorescencia de los sensores de monocarboxilato y glucosa. Como se muestra en la Figura 4, los sensores lacónicos tanto en las células gliales como en las neuronas motoras responden al lactato de 1 mM a una velocidad similar al inicio del pulso, pero las neuronas motoras alcanzan un aumento mayor sobre la línea de base durante el pulso de 5 minutos, como se demostró anteriormente17. Se eligió esta concentración de lactato porque es comparable a los niveles encontrados en la hemolinfa de las larvas de tercer estadio. De manera similar, cuando los sensores de glucosa que expresan VNC se expusieron a 5 mM de glucosa (un valor similar al medido en la hemolinfa por nosotros y otros19), la señal del sensor aumentó a un ritmo similar en las células gliales y las neuronas. Sin embargo, durante el pulso de glucosa, la señal en las neuronas aumenta más que en las células gliales. Esto es coherente con observaciones anteriores de preparaciones similares que expresan sensores FRET16.
Esta preparación se puede utilizar para realizar experimentos con monocarboxilato y transportadores de glucosa no descritos expresados en células gliales o neuronas de Drosophila 20. Aquí ejemplificamos el uso de ARN de interferencia para mostrar que Chaski (Chk), que anteriormente se sabía que transportaba monocarboxilatos en células heterólogas, transporta lactato en células gliales (Figura 5). En condiciones de restricción nutricional, se describió que este transportador desempeña un papel importante en la fisiología y el comportamiento de los animales21. Encontramos que en las células gliales, la eliminación de Chk redujo el transporte de lactato en comparación con los VNC de control expuestos a 1 mM de lactato (Figura 5). Se pueden probar otros transportadores putativos para ver si pueden transportar metabolitos en condiciones fisiológicas y patológicas.
Para abordar el estudio de los cambios metabólicos asociados a la actividad neuronal, hemos desarrollado un método sencillo para aumentar la actividad neuronal sin utilizar procedimientos técnicamente complejos como la optogenética, que pueden interferir con las mediciones de los sensores FRET (Figura 6). El VNC aislado fue expuesto a Picrotoxina (PTX), un conocido antagonista del receptor GABAA utilizado previamente por nosotros y otros17,22. La concentración utilizada aumenta la frecuencia de las oscilaciones de calcio en las neuronas (medida por los cambios en la fluorescencia de GCaMP6f), así como los cambios significativos en moléculas metabólicamente relevantes como la glucosa, el lactato y el piruvato17. Además, los aumentos de la actividad neuronal inducidos por PTX dan lugar a una caída transitoria de los niveles de ATP en el soma de las neuronas motoras. Este fenómeno ha sido descrito previamente en modelos de vertebrados en los que la actividad neuronal se incrementó a través de la estimulación eléctrica o mediante el uso de antagonistas del receptor GABAA 23,24. Como resultado, este modelo se puede utilizar para rastrear los cambios metabólicos en subconjuntos específicos de neuronas y células gliales, abordando la necesidad de transportadores relacionados con la energía que contribuyan a la producción de ATP durante la alta actividad neuronal.
El transporte de glucosa y monocarboxilato también es importante en tejidos o células distintas del cerebro. Mostramos aquí la visualización del monocarboxilato (lactato/piruvato) y la absorción de glucosa en los cuerpos grasos, un tejido metabólicamente relevante presente en las larvas y la mosca adulta que tiene varias funciones clave como el almacenamiento y metabolización de lípidos25. El sensor lacónico está bien expresado en FB, como se muestra en la Figura 7, donde las gotas de lípidos se pueden ver como pequeñas esferas negras dentro de la célula. Este tejido aislado se adhiere bien a los cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina, lo que permite un procedimiento de imagen celular a largo plazo que también es fácil de analizar. Observamos un aumento significativo en la fluorescencia del sensor de glucosa cuando la FB se expuso a concentraciones de glucosa crecientes (aproximadamente 5 mM), que se acerca a la concentración de glucosa encontrada en la hemolinfa. Una mayor exposición a concentraciones más altas de glucosa (10 mM) no da lugar al aumento esperado de la fluorescencia del sensor. Finalmente, en FB, pudimos medir la importación de lactato y piruvato (Figura 7C,D). En este caso, el aumento de las concentraciones de lactato y piruvato provoca un aumento proporcional de la fluorescencia lacónica y pirónica (que oscila entre 0,1 y 1 mM). Las concentraciones más altas de monocarboxilato dan como resultado la saturación de la señal dentro de las células.
Figura 1: Sincronización de larvas de Drosophila . El procedimiento de sincronización larvaria se representa gráficamente. Dos horas antes de que comience el proceso, se deben preparar placas de agarosa al 1% y cambiarlas dos veces al día hasta el día 4. Las larvas que eclosionan deben recolectarse con cuidado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cerebro larvario aislado de Drosophila que expresa el sensor de lactato lacónico. (A) Una imagen representativa de un VNC separado de una larva aislada de Drosophila en el tercer estadio adherida a un cubreobjetos recubierto de poli-L-lisina y expresando el sensor de lactato lacónico en las neuronas motoras (OK6-GAL4). Las imágenes muestran una imagen de campo claro del VNC (izquierda) y la fluorescencia mTFP del sensor (panel central) capturada con un objetivo de inmersión en agua de 20x. Las imágenes en el panel inferior son del mismo VNC tomadas con un objetivo de inmersión en agua de 40x. (B) Neuronas motoras de un VNC que expresan el sensor de lactato lacónico (OK6>lacónico) colocadas en una solución salina sin lactato. La imagen muestra la fluorescencia mTFP (izquierda), la fluorescencia de Venus (centro) y la relación entre las dos fluorescencias (derecha, producida con el complemento Ratio Plus del software ImageJ). Barras de escala = 50 μm (A, panel superior), 10 μm (A panel inferior, B). Abreviaturas: VNC = cordón nervioso ventral; mTFP = proteína fluorescente monomérica de color verde azulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis paso a paso de las imágenes. Una ilustración esquemática del protocolo de software ImageJ para el análisis de imágenes, que muestra el proceso (primera columna), los comandos de ImageJ (segunda columna) y los resultados del procesamiento de imágenes (tercera columna). El ejemplo comienza con una imagen en bruto tomada de un VNC que expresa el sensor lacónico de lactato en neuronas motoras (OK6-GAL4). Abreviaturas: VNC = cordón nervioso ventral; mTFP = proteína fluorescente monomérica de color verde azulado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Transporte de monocarboxilato y glucosa en neuronas y células gliales del cerebro larvario de Drosophila . (A) Imágenes representativas de VNC que expresan el sensor de lactato lacónico en neuronas motoras (OK6-Gal4>lacónico). La fluorescencia lacónica en las neuronas motoras se observa antes, durante y después de un pulso de 5 min de 1 mM de lactato. El plugin Ratio Plus de ImageJ se utilizó para crear imágenes de relación (mTFP/Venus). Barra de escala = 10 μm. (B) Registros representativos de señales FRET de VNC aislados que expresan el sensor de lactato lacónico en neuronas motoras (OK6-GAL4, líneas grises) o células gliales (REPO-GAL4, líneas negras) expuestas a lactato de 1 mM durante 5 min. Las trazas muestran las señales FRET ajustadas al valor medio recogido 2 minutos antes de la exposición al lactato. (C) Registros representativos de señales FRET de VNC aislados que expresan el sensor de glucosa FLII12Pglu700μδ6 en neuronas motoras (OK6-GAL4, líneas grises) o células gliales (REPO-GAL4, líneas negras) expuestas a 5 mM de glucosa durante 5 min. Las trazas representan las señales FRET ajustadas al valor medio recogido dos minutos antes de la exposición a la glucosa. Abreviaturas: VNC = cordón nervioso ventral; mTFP = proteína fluorescente monomérica de color verde azulado; FRET = Transferencia de energía de resonancia de Föster. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Transporte de lactato en células gliales del cerebro larvario de Drosophila que expresan ARNi de Chaski. (A) VNC aislados que expresan el sensor de lactato lacónico solo (control genético, w1118, línea negra) o co-expresan un RNAi para derribar la expresión de Chaski (Chk) (chk-RNAi, magenta) fueron expuestos a 1 mM de lactato durante 5 min. Para cada afección, las trazas representan el valor medio de FRET obtenido de siete VNC distintas (70 células por afección, normalizadas utilizando el valor medio obtenido 2 min antes de la exposición al lactato). (B) El área bajo la curva en A se utiliza para calcular la acumulación de lactato intracelular. Para cada condición, los valores son la media de SE de 70 células y siete experimentos independientes (control o chk-RNAi). Para el análisis estadístico se utilizó la prueba t de Student no pareada (*p < 0,05). Abreviaturas: VNC = cordón nervioso ventral; FRET = Transferencia de energía de resonancia de Föster. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Cambios en los niveles neuronales de ATP inducidos por la exposición a picrotoxinas. Registros de la fluorescencia capturada de VNCs que expresan el sensor de calcio genéticamente codificado (A) GCaMP6f o (B, un conjunto diferente de experimentos) el sensor ATP AT1.03NL en neuronas motoras (OK6-GAL4) que fueron expuestas al antagonista del receptor GABAA picrotoxina (80 μM) durante el tiempo indicado por la línea. El registro representativo proviene de una sola neurona motora de un VNC (en A) o de la media ± SE de 10 células de un solo VNC (en B) normalizado a los valores medios obtenidos 2 min antes de la exposición a PTX. Abreviaturas: VNC = cordón nervioso ventral; PTX = picrotoxina; SE = error estándar; CFP = proteína cian fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Transporte de monocarboxilato y glucosa en cuerpos grasos de Drosophila . (A) Imagen del cuerpo graso aislado de larvas de tercer estadio que expresan el sensor de lactato lacónico (fluorescencia mTFP). Barra de escala = 10 μm. (B) Trazas representativas de la señal normalizada captada en FB que expresa el sensor de glucosa (FLII12Pglu700μδ6) expuesto a glucosa (1, 5 y 10 mM de glucosa). Los datos se normalizaron a los primeros 2 minutos antes de la exposición a la glucosa. (C,D) Trazas representativas de la señal normalizada obtenida de FB que expresan el sensor de lactato (C) o el sensor de piruvato (D) expuestos a 0,1-0,5-1 mM de lactato o piruvato. Los datos se normalizaron a los primeros 2 minutos antes de la exposición al lactato o piruvato. Abreviaturas: FB = cuerpo graso; mTFP = proteína fluorescente monomérica de color verde azulado; YFP = proteína fluorescente amarilla; CFP = proteína cian fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El uso del modelo de Drosophila para el estudio del metabolismo cerebral es relativamente nuevo26, y se ha demostrado que comparte más características con el metabolismo de los mamíferos de lo esperado, que se ha estudiado principalmente in vitro en cultivos de neuronas primarias o cortes de cerebro. Drosophila sobresale en experimentos in vivo gracias a la batería de herramientas genéticas y sensores codificados genéticamente disponibles que permiten a los investigadores visualizar en tiempo real los cambios metabólicos causados por la actividad inducida o incluso en respuesta a un estímulo sensorial.
El protocolo aquí descrito muestra cómo medir el transporte de monocarboxilato y glucosa en células gliales y neuronas VNC de Drosophila en una preparación ex vivo que permite el uso de sensores metabólicos fluorescentes codificados genéticamente basados en microscopía FRET para realizar videos de lapso de tiempo de cambios metabólicos en neuronas activas y en reposo. Este protocolo se puede montar y llevar a cabo fácilmente en cualquier laboratorio utilizando el modelo de Drosophila sin el uso de maquinaria compleja, utilizando un microscopio epifluorescente equipado con un sistema de división de emisiones. También se puede escalar a equipos más avanzados como un disco giratorio, un confocal láser o microscopios de dos fotones (pero se requiere un divisor para dividir la emisión de luz) para registrar células específicas ubicadas más profundamente en el cerebro, como ocurre en el cerebro adulto de Drosophila . Como este tipo de señales metabólicas son relativamente lentas, no se necesita una cámara de video rápida o costosa.
Además, la preparación aislada de VNC o FB no necesita un método sofisticado para la corrección del movimiento que a veces se necesita para las grabaciones in vivo . Los plugins de ImageJ pueden corregir satisfactoriamente la mayoría de los movimientos de los VNCs que se producen durante el experimento. Como resultado, el aumento de la actividad neuronal por la adición de PTX o la adición de metabolitos relevantes se puede realizar simultáneamente sin los problemas causados por la contracción muscular natural del cuerpo, como se ve en otros protocolos (como la preparación del filete)27.
Mostramos experimentos representativos en los que se observa claramente el transporte de lactato y glucosa a concentraciones fisiológicamente relevantes de estos metabolitos (1 y 5 mM, respectivamente). A partir de aquí, se espera que cualquier gen no caracterizado o proteína previamente reportada pueda ser probado para determinar la capacidad de transporte en diversas condiciones, como el uso de diferentes modelos de enfermedades neurodegenerativas o agresiones metabólicas (dietas altas en calorías o restricción de nutrientes). En este sentido, demostramos que la eliminación mediada por ARNi de un transportador de monocarboxilato conocido reduce significativamente el transporte de lactato en las células gliales. Curiosamente, las señales obtenidas de los sensores lacónicos y piroónicos son altamente sensibles a los cambios en el lactato o piruvato en los medios, lo que permite una medición precisa de los cambios intracelulares en estos metabolitos. Este amplio rango dinámico de la señal parece ser diferente en células de mamíferos donde se ha observado una relación no lineal entre la señal del sensor y la concentración de lactato intracelular28.
Este enfoque puede proporcionar respuestas a aspectos importantes sobre dónde y cuándo se procesan o utilizan los monocarboxilatos y la glucosa para generar energía en el cerebro durante la actividad basal y neuronal alta. El aumento de la actividad neuronal causado por el PTX puede causar alteraciones considerables en los metabolitos relacionados con la energía, de manera similar a lo que se ha observado en cultivos celulares, portaobjetos cerebrales y organismos vivos23,24. Específicamente, un aumento en la producción de ATP ocurre minutos después de un aumento en la actividad neuronal, muy probablemente debido a la metabolización de la glucosa y al intercambio de lactato y piruvato entre las células gliales y las neuronas, como se informó previamente17. El estudio de las necesidades de células específicas para el suministro de glucosa y monocarboxilatos, así como de los mecanismos subyacentes a su transporte o generación, puede ser posible mediante la manipulación de la expresión de ciertos genes junto con el uso de sensores codificados genéticamente.
Otros tejidos metabólicamente importantes pueden unirse fácilmente a los cubreobjetos recubiertos de poli-L-lisina y obtener imágenes de los cambios en los metabolitos durante varios minutos. Se pueden estudiar nuevos transportadores que medien el transporte de glucosa o lactato en diferentes tejidos. La glucosa circulante se transporta para producir el disacárido trehalosa en los cuerpos grasos de las larvas a través de mecanismos que no se comprenden completamente, estos métodos podrían ayudar a comprender mejor esta vía. Además, bajo restricción nutricional, los ácidos grasos pueden metabolizarse para producir cuerpos cetónicos en la FB y aún se desconocen los transportadores necesarios para extruirlos a la hemolinfa.
Es importante tener en cuenta que este protocolo se puede utilizar para estimar la acumulación de un metabolito a lo largo del tiempo o para determinar las tasas de aumento de la fluorescencia de un sensor específico entre condiciones, pero no para considerar formalmente los cambios en la "concentración" porque esto requeriría una calibración del sensor in situ. Las diversas capas celulares que componen el VNC en este caso limitan la difusión de moléculas, como los ionóforos, necesarias para esta calibración. Sin embargo, aconsejamos seguir pautas de procesamiento de imágenes que permitan contrastar los niveles de lactato entre varios órganos o células dentro de un animal29,30.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos ni financieros.
Acknowledgments
Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio Sierralta. Este trabajo contó con el apoyo de FONDECYT-Iniciación 11200477 (a AGG) y FONDECYT Regular 1210586 (a JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (sensor de glucosa) fue amablemente donado por Pierre-Yves Plaçais y Thomas Preat, CNRS-París.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
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