Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera transporten av monokarboxylater, glukos och ATP i gliaceller och neuroner med hjälp av genetiskt kodade Förster-resonansenergiöverföringsbaserade sensorer i ett ex-vivo Drosophila-larvpreparat i hjärnan.
Abstract
Hjärnans höga energibehov på grund av elektrisk aktivitet är en av deras mest utmärkande egenskaper. Dessa krav uppfylls genom produktion av ATP från glukos och dess metaboliter, såsom monokarboxylater, laktat och pyruvat. Det är fortfarande oklart hur denna process regleras eller vilka nyckelaktörerna är, särskilt i Drosophila.
Med hjälp av genetiskt kodade Förster-resonansenergiöverföringsbaserade sensorer presenterar vi en enkel metod för att mäta transporten av monokarboxylater och glukos i gliaceller och neuroner i ett ex-vivo Drosophila-larvpreparat för hjärna. Protokollet beskriver hur man dissekerar och fäster en larvhjärna som uttrycker en av sensorerna på ett täckglas av glas.
Vi presenterar resultaten från ett helt experiment där laktattransport mättes i larvhjärnor genom att slå ner tidigare identifierade monokarboxylattransportörer i gliaceller. Dessutom visar vi hur man snabbt kan öka neuronal aktivitet och spåra metabolitförändringar i den aktiva hjärnan. Den beskrivna metoden, som ger all nödvändig information, kan användas för att analysera andra levande vävnader från Drosophila .
Introduction
Hjärnan har höga energibehov på grund av den höga kostnaden för att återställa jongradienter i neuroner orsakade av neuronal elektrisk signalgenerering och överföring, samt synaptisk överföring 1,2. Detta höga energibehov har länge ansetts tillgodoses genom kontinuerlig oxidation av glukos för att producera ATP3. Specifika transportörer vid blod-hjärnbarriären överför glukosen i blodet till hjärnan. Konstanta glykemiska nivåer säkerställer att hjärnan får en stadig tillförsel av glukos4. Intressant nog tyder växande experimentella bevis på att molekyler som härrör från glukosmetabolism, såsom laktat och pyruvat, spelar en viktig roll i hjärncellernas energiproduktion 5,6. Det finns dock fortfarande en viss debatt om hur viktiga dessa molekyler är för energiproduktionen och vilka celler i hjärnan som producerar elleranvänder dem. Bristen på lämpliga molekylära verktyg med den höga tidsmässiga och rumsliga upplösning som krävs för denna uppgift är en viktig fråga som har hindrat denna kontrovers från att lösas helt.
Utvecklingen och tillämpningen av flera modifierade fluorescerande metaboliska sensorer har resulterat i en anmärkningsvärd ökning av vår förståelse för var och hur metaboliter produceras och används, samt hur de metaboliska flödena uppstår under basal och hög neuronal aktivitet9. Genetiskt kodade metaboliska sensorer baserade på Förster-resonansenergiöverföring (FRET) mikroskopi, såsom ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glukos), Lakoniska (laktat) och Pyronic (pyruvat), har bidragit till vår förståelse av hjärnans energimetabolism 10,11,12,13. På grund av de höga kostnaderna och den sofistikerade utrustning som krävs för att utföra experiment på levande djur eller vävnader är resultaten i ryggradsdjursmodeller fortfarande i första hand begränsade till cellkulturer (gliaceller och neuroner).
Den framväxande användningen av Drosophila-modellen för att uttrycka dessa sensorer har avslöjat att viktiga metaboliska egenskaper bevaras hos alla arter och att deras funktion enkelt kan åtgärdas med detta verktyg. Ännu viktigare är att Drosophila-modellen har belyst hur glukos och laktat/pyruvat transporteras och metaboliseras i flughjärnan, kopplingen mellan monokarboxylatkonsumtion och minnesbildning, och den anmärkningsvärda demonstrationen av hur ökningar i neural aktivitet och metaboliskt flöde överlappar varandra 14,15,16,17. Metoden som presenteras här för att mäta monokarboxylat-, glukos- och ATP-nivåer med hjälp av genetiskt kodade FRET-sensorer som uttrycks i larvhjärnan gör det möjligt för forskare att lära sig mer om hur hjärnan hos Drosophila använder energi, som kan appliceras på hjärnan hos andra djur.
Vi visar att denna metod är effektiv för att detektera laktat och glukos i gliaceller och nervceller, och att en monokarboxylattransportör (Chaski) är involverad i laktatimport till gliaceller. Vi demonstrerar också en enkel metod för att studera metabolitförändringar under ökad neuronal aktivitet, som lätt kan induceras genom badapplicering av en GABAA-receptorantagonist . Slutligen visar vi att denna metodik kan användas för att mäta monokarboxylat- och glukostransport i andra metabolt signifikanta vävnader, såsom fettkroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Underhåll av flugstam och synkronisering av larver
- För att utföra dessa experiment används flugkulturer som är upphöjda vid 25 °C på standardfoder från Drosophila som består av 10 % jäst, 8 % glukos, 5 % vetemjöl, 1,1 % agar, 0,6 % propionsyra och 1,5 % metylparaben.
- För att följa detta protokoll, använd följande rader: w1118 (experimentell kontrollbakgrund), OK6-GAL4 (drivrutin för motorneuroner), repo-GAL4 (drivrutin för alla gliaceller), CG-GAL4 (drivrutin för fettkroppar), UAS-Pyronic (pyruvatsensor), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glukossensor), UAS-Laconic (laktatsensor), UAS-GCaMP6f (kalciumsensor), UAS-AT1.03NL (ATP-sensor) och UAS-Chk RNAi GD1829. Alla linjer som uttrycker sensorer eller RNAi finns i den genetiska bakgrunden w1118 .
- För att få synkroniserade tredje stjärnvandrande larver, placera 300 flugor (3-5 dagar gamla, 100 hanar, 200 jungfruliga honor) av den önskade genetiska korsningen i äggläggningskammaren, som innehåller en 60 mm petriskål täckt med 1 % agaros i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Placera en droppe flytande/krämig jäst (1,5 cm i diameter) i mitten av placket för att uppmuntra flugor att lägga ägg (Figur 1).
- Förvara flugorna vid 25 °C i 3 dagar och byt ut agarospetritriskålen mot en färsk och nyupplöst jäst två gånger dagligen.
- Låt flugorna lägga ägg i 4 timmar den fjärde dagen innan du byter petriskål. Ta bort denna plack. Låt sedan flugorna lägga ägg i en ny agarosplatta med nyupplöst jäst i 3 timmar. Använd dessa larver i experimenten.
- Efter 3 timmar tar du bort placket som innehåller äggen och lägger det i en 25 °C inkubator i 24 timmar.
- Samla in 50 till 100 nykläckta larver från detta plack (0 timmar efter larvkläckning) och placera dem i en plastflaska som innehåller standardfoder. För att larverna ska kunna äta ordentligt, se till att maten är mald och mjuk. Använd larverna 96 timmar efter överföringen.
2. Gör glastäcken med poly-L-lysin
- Utför detta steg 1 timme före larvdissektionen. I en 6-brunns cellodlingsplatta, placera 25 mm glastäcken (diametern på locken som ska användas beror på vilken inspelningskammare som finns i mikroskopet).
- Placera en droppe (300 μL) poly-L-lysin i mitten av varje täckglas i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta varje täckglas 3 gånger med destillerat vatten och sedan 2 gånger med en saltlösning utan Ca2+ (samma lösning som används för att dissekera larverna, se steg 3.2). Montera locken i inspelningskammaren och fyll den med Ca2+-fri koksaltlösning.
OBS: Även om larvhjärnan kan fästa direkt på glastäcken, är vidhäftningen svag och hjärnan rör sig ibland eller förskjuts under experimentet på grund av det kontinuerliga flödet av saltlösning. Tillsatsen av poly-L-lysinsteget minskar risken för rörelser eller till och med hjärnförlust till följd av tvättarna.
3. Dissekera den ventrala nervsträngen (VNC) och fettkropparna (FB)
- Samla in de vandrande larverna från den önskade genetiska korsningen (från steg 1.7) och tvätta dem noggrant 3 gånger med destillerat vatten.
- Placera larverna i en dissektionsskål av glas som innehåller 750 μL nominellt noll Ca2+ iskall koksaltlösning bestående av 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalos, 5 mM HEPES och 35 mM sackaros (pH = 6,7, mätt med en pH-mätare och justerad med 1 M NaOH och HCl 37 % v/v).
OBS: Det är viktigt att ställa in pH till 6.7 eftersom, som tidigare observerats, monokarboxylattransport är starkt beroende av lösningens pH. Dessutom motsvarar 6,7 pH i hemolymfan hos en tredje stjärnlarv17,18. - Placera larven under ett stereomikroskop och gör ett tvärsnitt över baksidan av buken med en pincett.
- Tryck på käken med pincetten samtidigt som du vänder larverna ut och in.
- Observera den ventrala nervsträngen (VNC) intill käken. Ta försiktigt bort de imaginära skivorna och kvarvarande hjärn-kaudala vävnader.
- Separera VNC med den centrala hjärnan och synloberna från resten av vävnaden genom att skära av nerverna. Överför VNC, plocka upp den med tång från de återstående nerverna och placera den i inspelningskammaren som innehåller den Ca2+-fria inspelningslösningen (samma lösning från steg 3.2). VNC:erna kommer omedelbart att fästa på täckglasen.
- För att undvika störningar från de återstående nerverna, fäst dem längst ner på täckglaset med en pincett (nerverna kommer också att vara fluorescerande beroende på vilken drivlina som används) (Figur 2).
- För att utföra experiment i fettkroppar (FB) som mäter glukos- eller monokarboxylattransport i en annan uppsättning experiment, fortsätt med att isolera vävnaderna enligt steg 3.1-3.4. När larverna har vänts ut och in, observera att FB är en vit, bilateral, platt vävnad.
- Placera de isolerade FB:erna som uttrycker FRET-sensorerna (erhållna från en genetisk korsning med lämpliga drivrutiner) i inspelningskammaren som innehåller registreringslösningen utan Ca2+.
OBS: FB är mycket hydrofob (den tenderar att flyta på ytan av lösningen) och extremt sårbar för manipulation med pincett, den måste hanteras med försiktighet. All hårdhänt hantering av denna vävnad kommer att resultera i döda celler senare (med en minskad fluorescens av sensorerna). - Placera inspelningskammaren som innehåller VNC/FB på mikroskopet stage.
4. Avbildning av levande celler
- För att ta bilder av vävnadsuttryckande sensorer, använd ett upprätt fluorescensmikroskop kopplat till ett emissionsdelningssystem och en CCD-kamera. Slå på mikroskopets belysningssystem 30 minuter innan du påbörjar något experiment.
OBS: Här använder vi ett fluorescensmikroskop med snurrande skiva utrustat med ett 20x/0.5 vattennedsänkningsobjektiv för att observera både VNC och FB. Figur 2 visar också användningen av ett 40x/0.8 vattennedsänkningsobjektiv. - För att visualisera GCaMP6f-fluorescens, ställ in excitations - och emissionsvåglängderna på 488 nm respektive 540 nm. För lakoniska/pyroniska/ATP/glukossensorer, ställ in excitationsvåglängden på 440 nm och emissionsvåglängderna på 488 nm (mTFP, CFP) och 540 nm (Venus, YFP).
- Ta bilder med en storlek på 512 x 512 pixlar varannan sekund för GCaMP6f och var 10-30:e sekund för lakoniska/pyroner/ATP/glukossensorer. Bestäm den optimala exponeringen för ljuskällan genom att observera kvaliteten på den erhållna bilden. För att följa detta protokoll, se till att bilderna är med 300 ms exponering för lakoniska och pyroniska sensorer och 100-150 ms för glukos - och ATP-sensorerna .
OBS: Exponeringen kan variera beroende på användningen av ett konfokalt eller normalt fluorescensmikroskop. - När inspelningskammaren är installerad i mikroskopetage, placera försiktigt vattennedsänkningsobjektivet och se till att objektivet förblir nedsänkt under hela experimentet. Håll rumstemperaturen vid 25 °C.
- Anslut registreringskammaren till ett perfusionssystem och låt vävnaderna bada i registreringslösningen som innehåller 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM trehalos, 5 mM HEPES och 35 mM sackaros, pH 6,7 (mätt med en pH-mätare och justerad med NaOH och HCl).
- Upprätthåll ett konstant flöde på 3 ml/min registreringslösning genom vävnaden med hjälp av gravitationen, kopplat till en peristaltisk pump med lågt flöde för att extrahera vätskan från kammaren samtidigt som volymen hålls konstant. För att uppnå önskat flöde, placera de lösningsinnehållande rören (50 ml plaströr) 25 cm ovanför mikroskopetage.
OBS: Detta gravitationsdrivna flöde används för att förhindra vävnadsrörelser orsakade av peristaltiska pumpar, vilket möjliggör mer exakt bildanalys senare. - Före stimulering, håll inspelningslösningen flödande i 5-10 minuter för att få en stabil baslinje av fluorescens från sensorerna. Ändra varaktigheten efter behov för att hämta den här baslinjen.
- Ersätt den flytande lösningen med stimuleringslösningen i 5 minuter för att stimulera VNC/FB (med glukos, pyruvat eller laktat vid den koncentration som beskrivs för varje experiment upplöst i saltlösning; se varje figur).
OBS: Stimuleringens varaktighet kan varieras beroende på experimentets behov (till exempel kan glukospulser ökas till 10 minuter för att nå en platå i neuroner, som tidigare rapporterats16). - För att bibehålla osmolariteten i stimuleringslösningen, korrigera sackaroskoncentrationen (en kolhydrat som inte kan metaboliseras av Drosophila-hjärnan ) i enlighet med koncentrationen av monokarboxylat eller glukos som tillsätts.
- Ändra lösningarna med hjälp av ett enkelt system av ventiler. Var försiktig så att du inte flyttar mikroskopetage.
- Exponera VNC för 80 μM pikromox (PTX, kontinuerligt strömmande) för att stimulera neuronal aktivitet. Denna procedur ökar frekvensen av Ca2+ -oscillationer, vilket gör det möjligt att observera förändringar i metaboliskt relevanta molekyler (t.ex. intracellulär ATP).
- Vid slutet av varje experiment tvättas hela flödessystemet, inklusive rören och registreringskammaren, noggrant i minst 10 minuter med saltlösning och ytterligare 10 minuter med destillerat vatten för att eliminera alla spår av de använda lösningarna.
5. Bildbehandling och dataanalys
- För att bearbeta de erhållna bilderna, fortsätt med stegen som visas i figur 3.
- Importera bilden (Laconic) till ImageJ-programvaran. Bilden har två vyer av provet: den vänstra är mTFP-signalen och den till höger är Venus-signalen. Välj ett område som innehåller cellerna som ska analyseras och separera dessa bilder (mTFP och Venus) i ett nytt fönster. Se till att dessa bilder innehåller exakt samma område.
- Öppna registreringspluginet och korrigera den lilla driften av vävnaden som normalt observeras i experimentet med funktionen stel kropp. Utför detta i båda bilderna (mTFP och Venus).
- Välj minst 10 intressanta regioner (ROI) i cytosolen för motsvarande 10 celler i mTFP-signalen (488 nm) och överför valen till Venus-bilden (540 nm).
- Välj två eller tre ROI nära cellerna som analyseras men utan någon märkbar signal (alltid inom VNC eller vävnad som analyseras, se figur 3). Det här är bakgrunden till ROI:erna.
- Med ROI:erna valda i båda bilderna, erhåll det genomsnittliga gråvärdet för varje signal med hjälp av funktionsmåttet. Överför data till ett datablad och subtrahera det genomsnittliga bakgrundsvärdet för varje signal.
- Bestäm mTFP-fluorescensförhållandet över Venus (för lakonisk och pyronik). Detta värde beräknas annorlunda än de andra FRET-sensorerna som beskrivs här (där förhållandet vanligtvis är YFP/CFP) eftersom både lakoniska och pyroniska minskar sina FRET-effektivitetsvinster när de är bundna till sina respektive substrat.
- Normalisera data genom att dividera varje registrerat värde med baslinjen. I ett separat datablad, beräkna baslinjen genom att ta medelvärdet av mTFP/Venus-förhållandet under de 2 minuter som föregår stimulus.
- För glukos- och ATP-mätningarna med FRET-baserade sensorer, beräkna YFP/CFP-förhållandet och normalisera data enligt beskrivningen i steg 5.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I upp till 1 timme möjliggör denna procedur enkel mätning av intracellulära förändringar i fluorescensen hos monokarboxylat- och glukossensorer. Som visas i figur 4 svarar lakoniska sensorer i både gliaceller och motorneuroner på 1 mM laktat i en liknande takt i början av pulsen, men motorneuroner når en högre ökning över baslinjen under 5 minuters puls, som tidigare visats17. Denna laktatkoncentration valdes eftersom den är jämförbar med de nivåer som finns i hemolymfan hos larver av tredje stjärna. På samma sätt, när VNC-uttryckande glukossensorer exponerades för 5 mM glukos (ett värde som liknar det som uppmättes i hemolymfan av oss och andra19), ökade sensorns signal i liknande takt i gliaceller och neuroner. Under glukospulsen ökar dock signalen i nervcellerna mer än i gliacellerna. Detta överensstämmer med tidigare observationer av liknande FRET-sensoruttryckande preparat16.
Detta preparat kan användas för att utföra experiment på obeskrivna monokarboxylat- och glukostransportörer som uttrycks i Drosophila gliaceller eller neuroner20. Här exemplifierar vi användningen av RNA-interferens för att visa att Chaski (Chk), som tidigare var känd för att transportera monokarboxylater i heterologa celler, transporterar laktat i gliaceller (Figur 5). Under näringsrestriktionsförhållanden beskrevs denna transportör spela en viktig roll i djurens fysiologioch beteende. Vi fann att i gliaceller minskade utslagning av Chk laktattransporten jämfört med kontroll-VNC som exponerades för 1 mM-laktat (Figur 5). Andra förmodade transportörer kan testas för att se om de kan transportera metaboliter vid fysiologiska och patologiska tillstånd.
För att ta itu med studien av metabola förändringar associerade med neuronal aktivitet utvecklade vi en enkel metod för att öka neuronal aktivitet utan att använda tekniskt komplexa procedurer som optogenetik, som kan störa FRET-sensormätningar (Figur 6). Den isolerade VNC exponerades för Picrotoxin (PTX), en känd GABAA-receptorantagonist som tidigare använts av oss och andra17,22. Koncentrationen som används ökar frekvensen av kalciumoscillationer i neuroner (mätt som förändringar i GCaMP6f-fluorescens) samt signifikanta förändringar i metaboliskt relevanta molekyler som glukos, laktat och pyruvat17. Dessutom resulterar PTX-inducerade ökningar av neuronal aktivitet i en övergående minskning av ATP-nivåerna i soma av motorneuroner. Detta fenomen har tidigare beskrivits i ryggradsdjursmodeller där nervcellsaktiviteten ökade via elektrisk stimulering eller med hjälp av GABA A-receptorantagonister23,24. Som ett resultat kan denna modell användas för att spåra metaboliska förändringar i specifika undergrupper av neuroner och gliaceller, vilket tillgodoser behovet av energirelaterade transportörer som bidrar till ATP-produktion under hög neuronal aktivitet.
Transporten av glukos och monokarboxylater är också viktig i andra vävnader eller celler än hjärnan. Vi visar här visualiseringen av monokarboxylat (laktat/pyruvat) och glukosupptag i fettkroppar, en metaboliskt relevant vävnad som finns i larverna och den vuxna flugan och som har flera nyckelfunktioner såsom lipidlagring och metabolisering25. Den lakoniska sensorn uttrycks väl i FB, som visas i figur 7, där lipiddropparna kan ses som små svarta sfärer i cellen. Denna isolerade vävnad fäster väl på de poly-L-lysinbelagda täckglasen, vilket möjliggör en långvarig cellavbildningsprocedur som också är lätt att analysera. Vi observerade en signifikant ökning av glukossensorns fluorescens när FB utsattes för ökande glukoskoncentrationer (cirka 5 mM), vilket ligger nära glukoskoncentrationen som finns i hemolymfan. Ytterligare exponering för högre koncentrationer av glukos (10 mM) resulterar inte i den förväntade ökningen av sensorfluorescens. Slutligen, i FB, kunde vi mäta laktat- och pyruvatimport (Figur 7C,D). I detta fall orsakar en ökning av laktat- och pyruvatkoncentrationerna en proportionell ökning av lakonisk och pyronisk fluorescens (från 0,1 till 1 mM). Högre monokarboxylatkoncentrationer resulterar i signalmättnad inuti cellerna.
Figur 1: Synkronisering av Drosophila-larver . Larvsynkroniseringsproceduren avbildas grafiskt. Två timmar innan processen startar måste 1 % agarosplattor förberedas och bytas två gånger dagligen fram till dag 4. De kläckande larverna måste samlas in med försiktighet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Isolerad Drosophila-larvhjärna som uttrycker laktatsensorn Laconic. (A) En representativ bild av en isolerad Drosophila-larvs separerade VNC vidhäftad till ett poly-L-lysinbelagt täckglas och uttrycker laktatsensorn Lakonisk i motorneuroner (OK6-GAL4). Bilderna visar en ljusfältsbild av VNC (vänster) och sensorns mTFP-fluorescens (mittpanel) fångad med ett 20x vattennedsänkningsobjektiv. Bilderna i den nedre panelen är av samma VNC tagna med ett 40x vattennedsänkningsobjektiv. (B) Motorneuroner från en VNC som uttrycker den lakoniska laktatsensorn (OK6>Laconic) placerad i en laktatfri koksaltlösning. Bilden visar mTFP-fluorescens (vänster), Venus-fluorescens (mitten) och förhållandet mellan de två fluorescenserna (höger, producerat med hjälp av Ratio Plus-plugin-programmet i ImageJ-programvaran). Skalstreck = 50 μm (A, topppanel), 10 μm (A bottenpanel, B). Förkortningar: VNC = ventral nervsträng; mTFP = monomert blågrönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Steg-för-steg-analyser av bilderna. En schematisk illustration av ImageJ-programvaruprotokollet för bildanalys, som visar processen (första kolumnen), ImageJ-kommandon (andra kolumnen) och bildbehandlingsresultat (tredje kolumnen). Exemplet börjar med en rå bild tagen från en VNC som uttrycker den lakoniska laktatsensorn i motorneuroner (OK6-GAL4). Förkortningar: VNC = ventral nervsträng; mTFP = monomert blågrönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Monokarboxylat- och glukostransport i nervceller och gliaceller i Drosophila-larvhjärnan . (A) Representativa bilder av VNC som uttrycker laktatsensorn Lakonisk i motorneuroner (OK6-Gal4>Laconic). Lakonisk fluorescens i motorneuroner ses före, under och efter en 5 minuters puls på 1 mM laktat. ImageJ:s Ratio Plus-plugin användes för att skapa ratio-bilder (mTFP/Venus). Skalstapel = 10 μm. (B) Representativa registreringar av FRET-signaler från isolerade VNC som uttrycker den lakoniska laktatsensorn i motorneuroner (OK6-GAL4, grå linjer) eller gliaceller (REPO-GAL4, svarta linjer) exponerade för 1 mM laktat i 5 min. Spåren visar de justerade FRET-signalerna till medelvärdet som samlats in 2 minuter före laktatexponeringen. (C) Representativa inspelningar av FRET-signaler från isolerade VNC som uttrycker glukossensorn FLII12Pglu700μδ6 i motorneuroner (OK6-GAL4, grå linjer) eller gliaceller (REPO-GAL4, svarta linjer) exponerade för 5 mM glukos under 5 min. Spåren visar de justerade FRET-signalerna till medelvärdet som samlats in två minuter före glukosexponeringen. Förkortningar: VNC = ventral nervsträng; mTFP = monomert blågrönt fluorescerande protein, FRET = Föster resonans energiöverföring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Laktattransport i gliaceller i Drosophila-larvhjärnan som uttrycker Chaski-RNAi. (A) Isolerad VNC som uttrycker laktatsensorn Lakonisk ensam (genetisk kontroll, w1118, svart linje) eller samuttrycker ett RNAi till knockdown Chaski (Chk) uttryck (chk-RNAi, magenta) exponerades för 1 mM laktat under 5 minuter. För varje tillstånd representerar spåren det genomsnittliga FRET-värdet som erhålls från sju separata VNC (70 celler per tillstånd, normaliserat med hjälp av medelvärdet som erhålls 2 minuter innan det exponeras för laktat). (B) Arean under kurvan i A används för att beräkna intracellulär laktatackumulering. För varje tillstånd är värdena medelvärdet för SE från 70 celler och sju oberoende experiment (kontroll eller chk-RNAi). Den oparade Students t-test användes för statistisk analys (*p < 0,05). Förkortningar: VNC = ventral nervsträng; FRET = Föster resonans energiöverföring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Förändringar i neuronala ATP-nivåer inducerade av exponering för pikromoxi. Registreringar av fluorescensen som fångats från VNC som uttrycker den genetiskt kodade (A) kalciumsensorn GCaMP6f eller (B, en annan uppsättning experiment) ATP-sensorn AT1.03NL i motorneuroner (OK6-GAL4) som exponerades för GABA A-receptorantagonisten Picrotoxin (80 μM) under den tid som indikeras av linjen. Den representativa registreringen kommer från en enda motorneuron från en VNC (i A) eller medelvärdet ± SE från 10 celler från en enda VNC (i B) normaliserat till de medelvärden som erhölls 2 minuter före PTX-exponering. Förkortningar: VNC = ventral nervsträng; PTX = pikromoxi, SE = standardfel; CFP = cyanfluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Transport av monokarboxylat och glukos i Drosophila-fettkroppar . (A) Bild av den isolerade fettkroppen från tredje stjärnlarver som uttrycker laktatsensorn Lakonisk (mTFP-fluorescens). Skalstapel = 10 μm. (B) Representativa spår av den normaliserade signalen som fångas i FB och som uttrycker glukossensorn (FLII12Pglu700μδ6) som exponeras för glukos (1, 5 och 10 mM glukos). Data normaliserades till de första 2 minuterna före glukosexponering. (C,D) Representativa spår av den normaliserade signalen erhållen från FB som uttrycker laktatsensorn (C) eller pyruvatsensorn (D) exponerad för 0,1-0,5-1 mM laktat eller pyruvat. Data normaliserades till de första 2 minuterna före laktat- eller pyruvatexponering. Förkortningar: FB = fet kropp; mTFP = monomert blågrönt fluorescerande protein, YFP = gult fluorescerande protein; CFP = cyanfluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av Drosophila-modellen för studier av hjärnans metabolism är relativt ny26, och den har visat sig dela fler egenskaper med däggdjurens metabolism än förväntat, vilket främst har studerats in vitro i primära neuronkulturer eller hjärnskivor. Drosophila utmärker sig i in vivo-experiment tack vare det batteri av genetiska verktyg och genetiskt kodade sensorer som finns tillgängliga och som gör det möjligt för forskare att i realtid visualisera de metaboliska förändringar som orsakas av inducerad aktivitet eller till och med som svar på en sensorisk stimulans.
Protokollet som beskrivs här visar hur man mäter monokarboxylat- och glukostransport i Drosophila VNC-gliaceller och neuroner i ett ex-vivo-preparat som möjliggör användning av genetiskt kodade fluorescerande metaboliska sensorer baserade på FRET-mikroskopi för att göra time-lapse-videor av metaboliska förändringar i vilande och aktiva neuroner. Detta protokoll kan enkelt monteras och utföras i vilket laboratorium som helst med hjälp av Drosophila-modellen utan användning av komplexa maskiner, med hjälp av ett epifluorescensmikroskop utrustat med ett emissionsdelningssystem. Det kan också skalas till mer avancerad utrustning som en snurrskiva, laserkonfokal eller tvåfotonmikroskop (men en splitter för att dela upp ljusemissionen krävs) för att registrera specifika celler som ligger djupare i hjärnan, vilket sker i vuxna Drosophila-hjärnor . Eftersom dessa typer av metaboliska signaler är relativt långsamma behövs ingen snabb eller dyr videokamera.
Dessutom behöver den isolerade VNC- eller FB-preparationen inte en sofistikerad metod för rörelsekorrigering som ibland behövs för in vivo-inspelningar . ImageJ-plugins kan på ett tillfredsställande sätt korrigera de flesta rörelserna hos VNC:erna som produceras under experimentet. Som ett resultat av detta kan ökningen av neuronal aktivitet genom tillsats av PTX eller tillägg av relevanta metaboliter utföras samtidigt utan de problem som orsakas av naturlig muskelsammandragning i kroppen, vilket ses i andra protokoll (t.ex. filéberedningen)27.
Vi visar representativa experiment där laktat- och glukostransport tydligt observeras vid fysiologiskt relevanta koncentrationer av dessa metaboliter (1 respektive 5 mM). Härifrån förväntas det att alla okarakteriserade gener eller tidigare rapporterade proteiner kan testas för transportkapacitet under olika förhållanden, till exempel med hjälp av olika modeller av neurodegenerativa sjukdomar eller metabola förolämpningar (kaloririk kost eller näringsrestriktion). I detta avseende visar vi att RNAi-medierad knockdown av en känd monokarboxylattransportör minskar laktattransporten i gliaceller signifikant. Intressant nog är signalerna som erhålls från lakoniska och pyroniska sensorer mycket känsliga för förändringar i laktat eller pyruvat i media, vilket möjliggör en noggrann mätning av de intracellulära förändringarna i dessa metaboliter. Detta stora dynamiska omfång av signalen verkar vara annorlunda i däggdjursceller där ett icke-linjärt förhållande mellan sensorns signal och den intracellulära laktatkoncentrationen har observerats28.
Detta tillvägagångssätt kan ge svar på viktiga aspekter om var och när monokarboxylater och glukos bearbetas eller används för att generera energi i hjärnan under basal och hög neuronal aktivitet. Ökningen av neuronal aktivitet orsakad av PTX kan orsaka betydande förändringar i energirelaterade metaboliter, på ett liknande sätt som vad som har setts i cellkulturer, hjärnglas och levande organismer23,24. Specifikt inträffar en ökning av ATP-produktionen minuter efter en ökning av neuronal aktivitet, troligen på grund av glukosmetabolisering och utbytet av laktat och pyruvat mellan gliaceller och neuroner, som tidigare rapporterats17. Studier av specifika cellers behov av tillförsel av glukos och monokarboxylater, liksom de mekanismer som ligger till grund för deras transport eller generering, kan möjliggöras genom att manipulera uttrycket av vissa gener i kombination med användning av genetiskt kodade sensorer.
Andra metaboliskt viktiga vävnader kan lätt binda till poly-L-lysinbelagda täckglas och metabolitförändringar avbildas under flera minuter. Nya transportörer som förmedlar glukos- eller laktattransport i olika vävnader kan studeras. Cirkulerande glukos transporteras för att producera disackariden trehalos i larvfettkroppar via mekanismer som inte är helt klarlagda, dessa metoder kan hjälpa till att bättre förstå denna väg. Dessutom, under näringsrestriktion, kan fettsyror metaboliseras för att producera ketonkroppar i FB och de transportörer som krävs för att extrudera dem till hemolymfan är fortfarande okända.
Det är viktigt att notera att detta protokoll kan användas för att uppskatta ackumuleringen av en metabolit över tid eller för att bestämma ökningshastigheten i fluorescensen hos en specifik sensor mellan betingelser, men inte för att formellt överväga förändringar i "koncentration" eftersom detta skulle kräva en in-situ sensorkalibrering. De flera celskikt som utgör VNC begränsar i detta fall diffusionen av molekyler, såsom jonoforer, som är nödvändiga för denna kalibrering. Vi rekommenderar dock att du följer riktlinjer för bildbehandling som tillåter kontrasterande laktatnivåer mellan olika organ eller celler hos ett djur29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga konkurrerande eller ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar i Sierralta Lab. Detta arbete stöddes av FONDECYT-Iniciación 11200477 (till AGG) och FONDECYT Regular 1210586 (till JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glukossensor) donerades av Pierre-Yves Plaçais och Thomas Preat, CNRS-Paris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
