Summary
Burada, ex-vivo Drosophila larva beyin preparatında genetik olarak kodlanmış Förster rezonans enerji transferi tabanlı sensörler kullanarak glial hücrelerde ve nöronlarda monokarboksilatların, glikozun ve ATP'nin taşınmasını görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Elektriksel aktiviteye bağlı olarak beyinlerin yüksek enerji gereksinimleri en ayırt edici özelliklerinden biridir. Bu gereksinimler, glikozdan ve monokarboksilatlar laktat ve piruvat gibi metabolitlerinden ATP üretimi ile karşılanır. Bu sürecin nasıl düzenlendiği veya özellikle Drosophila'daki kilit oyuncuların kim olduğu hala belirsiz.
Genetik olarak kodlanmış Förster rezonans enerji transferi tabanlı sensörleri kullanarak, ex-vivo Drosophila larva beyin preparatında glial hücrelerde ve nöronlarda monokarboksilatların ve glikozun taşınmasını ölçmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Protokol, sensörlerden birini bir cam lamele ifade eden bir larva beyninin nasıl kesileceğini ve yapıştırılacağını açıklar.
Glial hücrelerde daha önce tanımlanmış monokarboksilat taşıyıcılarını yıkarak larva beyinlerinde laktat taşınımının ölçüldüğü bütün bir deneyin sonuçlarını sunuyoruz. Ayrıca, nöronal aktivitenin nasıl hızla artırılacağını ve aktif beyindeki metabolit değişikliklerinin nasıl izleneceğini gösteriyoruz. Gerekli tüm bilgileri sağlayan tarif edilen yöntem, diğer Drosophila canlı dokularını analiz etmek için kullanılabilir.
Introduction
Beyin, nöronal elektrik sinyali üretimi ve iletiminin yanı sıra sinaptik iletimin neden olduğu nöronlardaki iyon gradyanlarını geri yüklemenin yüksek maliyeti nedeniyle yüksek enerji gereksinimlerine sahiptir 1,2. Bu yüksek enerji talebinin uzun zamandır ATP3 üretmek için glikozun sürekli oksidasyonu ile karşılandığı düşünülüyordu. Kan-beyin bariyerindeki spesifik taşıyıcılar, kandaki glikozu beyne aktarır. Sabit glisemik seviyeler, beynin sabit bir glikoz kaynağı almasını sağlar4. İlginç bir şekilde, artan deneysel kanıtlar, laktat ve piruvat gibi glikoz metabolizmasından türetilen moleküllerin beyin hücrelerinin enerji üretiminde önemli bir rol oynadığını göstermektedir 5,6. Bununla birlikte, bu moleküllerin enerji üretimi için ne kadar önemli olduğu ve beyindeki hangi hücrelerin bunları ürettiği veya kullandığı konusunda hala bazı tartışmalar vardır 7,8. Bu görev için gerekli olan yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip uygun moleküler araçların eksikliği, bu tartışmanın tamamen çözülmesini engelleyen önemli bir konudur.
Birkaç tasarlanmış floresan metabolik sensörün geliştirilmesi ve uygulanması, metabolitlerin nerede ve nasıl üretildiği ve kullanıldığı ile metabolik akışların bazal ve yüksek nöronal aktivite sırasında nasıl oluştuğuna dair anlayışımızda dikkate değer bir artışa neden olmuştur9. ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glikoz), Laconic (laktat) ve Pyronic (piruvat) gibi Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskobuna dayalı genetik olarak kodlanmış metabolik sensörler, beyin enerji metabolizmasını anlamamıza katkıda bulunmuştur 10,11,12,13. Bununla birlikte, canlı hayvanlar veya dokular üzerinde deney yapmak için gereken yüksek maliyetler ve karmaşık ekipman nedeniyle, omurgalı modellerindeki sonuçlar hala öncelikle hücre kültürleriyle (glial hücreler ve nöronlar) sınırlıdır.
Bu sensörleri ifade etmek için Drosophila modelinin ortaya çıkan kullanımı, temel metabolik özelliklerin türler arasında korunduğunu ve işlevlerinin bu araçla kolayca ele alınabileceğini ortaya koymuştur. Daha da önemlisi, Drosophila modeli, glikoz ve laktat/piruvatın sinek beyninde nasıl taşındığına ve metabolize edildiğine, monokarboksilat tüketimi ile hafıza oluşumu arasındaki bağlantıya ve nöral aktivite ve metabolik akıştaki artışların nasıl örtüştüğünün dikkate değer gösterimine ışık tutmuştur 14,15,16,17 . Larva beyninde ifade edilen genetik olarak kodlanmış FRET sensörlerini kullanarak monokarboksilat, glikoz ve ATP seviyelerini ölçmek için burada sunulan yöntem, araştırmacıların Drosophila'nın beyninin diğer hayvanların beyinlerine uygulanabilecek enerjiyi nasıl kullandığı hakkında daha fazla bilgi edinmelerini sağlar.
Bu yöntemin glial hücrelerde ve nöronlarda laktat ve glikozu tespit etmede etkili olduğunu ve bir monokarboksilat taşıyıcısının (Chaski) glial hücrelere laktat ithalatında rol oynadığını gösterdik. Ayrıca, bir GABAA reseptör antagonistinin banyo uygulamasıyla kolayca indüklenebilen, artan nöronal aktivite sırasında metabolit değişikliklerini incelemek için basit bir yöntem gösteriyoruz. Son olarak, bu metodolojinin, yağ cisimleri gibi diğer metabolik olarak önemli dokularda monokarboksilat ve glikoz taşınmasını ölçmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sinek suşu bakımı ve larva senkronizasyonu
- Bu deneyleri gerçekleştirmek için, %10 maya, %8 glikoz, %5 buğday unu, %1,1 agar, %0,6 propiyonik asit ve %1,5 metilparabenden oluşan standart Drosophila gıdalarında 25 °C'de yetiştirilen sinek kültürlerini kullanın.
- Bu protokolü takip etmek için aşağıdaki satırları kullanın: w1118 (deneysel kontrol arka planı), OK6-GAL4 (motor nöronlar için sürücü), repo-GAL4 (tüm glial hücreler için sürücü), CG-GAL4 (yağ cisimleri için sürücü), UAS-Pyronic (piruvat sensörü), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glikoz sensörü), UAS-Laconic (laktat sensörü), UAS-GCaMP6f (kalsiyum sensörü), UAS-AT1.03NL (ATP sensörü) ve UAS-Chk RNAi GD1829. Sensörleri veya RNAi'yi ifade eden tüm çizgiler w1118 genetik arka planındadır.
- Senkronize üçüncü instar dolaşan larvaları elde etmek için, fosfat tamponlu salin çözeltisinde (PBS) %1 agaroz ile kaplı 60 mm'lik bir Petri kabı içeren yumurtlama odasına istenen genetik çaprazlamanın 300 sineğini (3-5 günlük, 100 erkek, 200 bakire dişi) yerleştirin. Sinekleri yumurtlamaya teşvik etmek için plağın ortasına bir damla sıvı/kremsi maya (1,5 cm çapında) koyun (Şekil 1).
- Sinekleri 3 gün boyunca 25 °C'de tutun, agaroz Petri kabını günde iki kez taze bir tane ve taze çözünmüş maya ile değiştirin.
- Petri kabını değiştirmeden önce sineklerin dördüncü günde 4 saat yumurtlamasına izin verin. Bu plakayı çıkarın. Daha sonra, 3 saat boyunca, sineklerin taze çözünmüş maya ile yeni bir agaroz plağına yumurta bırakmasına izin verin. Bu larvaları deneylerde kullanın.
- 3 saat sonra, yumurtaları içeren plağı çıkarın ve 24 saat boyunca 25 ° C'lik bir inkübatöre koyun.
- Bu plaktan 50 ila 100 yeni yumurtadan çıkmış larva toplayın (larva yumurtadan çıktıktan 0 saat sonra) ve bunları standart yiyecek içeren plastik bir şişeye koyun. Larvaların düzgün beslenmesini sağlamak için yiyeceğin öğütülmüş ve yumuşak olduğundan emin olun. Transferden 96 saat sonra larvaları kullanın.
2. Cam lameller poli-L-lizin ile yapın
- Bu adımı larva diseksiyonundan 1 saat önce gerçekleştirin. 6 oyuklu bir hücre kültürü plakasına 25 mm'lik cam lameller yerleştirin (kullanılacak kapakların çapı mikroskopta bulunan kayıt odasına bağlıdır).
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her lamellerin ortasına bir damla (300 μL) poli-L-lizin koyun.
- Her lamel 3x'i damıtılmış suyla, ardından 2x'i Ca2+ içermeyen bir tuzlu su çözeltisiyle yıkayın (larvaları incelemek için kullanılan aynı çözelti, bkz. adım 3.2). Kapakları kayıt odasına takın ve Ca2+ içermeyen salin solüsyonu ile doldurun.
NOT: Larva beyni doğrudan cam lamellere yapışabilse de, yapışma zayıftır ve beyin, sürekli salin çözeltisi akışı nedeniyle deney sırasında zaman zaman hareket eder veya yer değiştirir. Poli-L-lizin adımının eklenmesi, yıkamaların bir sonucu olarak hareket riskini ve hatta beyin kaybını azaltır.
3. Ventral sinir kordonunu (VNC) ve yağ cisimciklerini (FB'ler) inceleyin
- Dolaşan üçüncü instar larvalarını istenen genetik çaprazlamadan (adım 1.7'den itibaren) toplayın ve 3 kez damıtılmış suyla iyice yıkayın.
- Larvaları, 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM trehaloz, 5 mM HEPES ve 35 mM sükrozdan oluşan 750 μL nominal olarak sıfır Ca2+ buz gibi soğuk salin solüsyonu içeren bir cam diseksiyon kabına yerleştirin (pH = 6.7, bir pH metre ile ölçülür ve 1 M NaOH ve HCl% 37 v / v ile ayarlanır).
NOT: pH'ın 6.7'ye ayarlanması çok önemlidir, çünkü daha önce gözlemlendiği gibi, monokarboksilat taşınması büyük ölçüde çözeltinin pH'ına bağlıdır. Ek olarak, 6.7, üçüncü bir instar larvasının hemolenfindeki pH'akarşılık gelir 17,18. - Larvaları bir stereomikroskop altına yerleştirin ve bir çift forseps ile karnın arkasından enine bir kesim yapın.
- Larvaları ters çevirirken çeneyi forseps ile itin.
- Çenenin yanındaki ventral sinir kordonunu (VNC) gözlemleyin. Hayali diskleri ve kalan beyin kaudal dokularını dikkatlice çıkarın.
- Sinirleri keserek VNC'yi merkezi beyin ve optik loblarla dokunun geri kalanından ayırın. VNC'yi aktarın, kalan sinirlerden forseps ile alın ve Ca2+ içermeyen kayıt solüsyonunu içeren kayıt odasına yerleştirin (adım 3.2'deki aynı solüsyon). VNC'ler hemen lamellere yapışacaktır.
- Kalan sinirlerin karışmasını önlemek için, bunları forseps kullanarak lamel altına takın (kullanılan sürücü hattına bağlı olarak sinirler de floresan olacaktır) (Şekil 2).
- Başka bir deney setinde glikoz veya monokarboksilat taşınmasını ölçen yağ cisimciklerinde (FB'ler) deneyler yapmak için, 3.1-3.4 adımlarını izleyerek dokuları izole etmeye devam edin. Larvalar ters çevrildiğinde, FB'nin beyaz, iki taraflı, düz bir doku olduğunu gözlemleyin.
- FRET sensörlerini (uygun sürücüler kullanılarak genetik bir çaprazlamadan elde edilen) eksprese eden izole edilmiş FB'leri, Ca2+ olmadan kayıt solüsyonunu içeren kayıt odasına yerleştirin.
NOT: FB oldukça hidrofobiktir (çözeltinin yüzeyinde yüzmeye meyillidir) ve forseps ile manipülasyona karşı son derece savunmasızdır, dikkatli kullanılmalıdır. Bu dokunun herhangi bir kaba kullanımı, daha sonra ölü hücrelere neden olacaktır (sensörlerin floresansının azalmasıyla). - VNC'leri/FB'leri içeren kayıt odasını mikroskop tablasına yerleştirin.
4. Canlı hücre görüntüleme
- Doku eksprese eden sensörlerin görüntülerini elde etmek için, bir emisyon bölme sistemine ve bir CCD kameraya bağlı dik bir floresan mikroskobu kullanın. Herhangi bir deneye başlamadan 30 dakika önce mikroskobun aydınlatma sistemini açın.
NOT: Burada hem VNC'leri hem de FB'leri gözlemlemek için 20x/0.5 suya daldırma objektifi ile donatılmış bir Dönen Disk floresan mikroskobu kullanıyoruz. Şekil 2 ayrıca 40x/0.8 suya daldırma objektifinin kullanımını göstermektedir. - GCaMP6f floresansını görselleştirmek için, uyarma ve emisyon dalga boylarını sırasıyla 488 nm ve 540 nm'ye ayarlayın. Laconic/Pironik/ATP/glikoz sensörleri için uyarma dalga boyunu 440 nm'ye ve emisyon dalga boylarını 488 nm (mTFP, CFP) ve 540 nm'ye (Venüs, YFP) ayarlayın.
- GCaMP6f için her 2 saniyede bir ve Laconic/Pironik/ATP/glikoz sensörleri için her 10-30 saniyede bir 512 x 512 piksel boyutunda görüntüler elde edin. Elde edilen görüntünün kalitesini gözlemleyerek ışık kaynağına en uygun pozlamayı belirleyin. Bu protokolü takip etmek için, görüntülerin Laconic ve Pyronic sensörler için 300 ms ve glikoz ve ATP sensörleri için 100-150 ms pozlama olduğundan emin olun.
NOT: Maruziyet, konfokal veya normal floresan mikroskobunun kullanımına bağlı olarak değişebilir. - Kayıt odası mikroskop aşamasına yerleştirildikten sonra, suya daldırma objektifini dikkatlice yerleştirin ve objektifin deney boyunca su altında kaldığından emin olun. Oda sıcaklığını 25 °C'de tutun.
- Kayıt odasını bir perfüzyon sistemine bağlayın ve dokuları 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM trehaloz, 5 mM HEPES ve 35 mM sükroz, pH 6.7 (pH metre ile ölçülmüş ve NaOH ve HCl ile ayarlanmış) içeren kayıt solüsyonunda yıkayın.
- Hacmi sabit tutarken sıvıyı hazneden çıkarmak için düşük akı peristaltik pompaya bağlı olarak yerçekimi kullanarak doku boyunca 3 mL / dak kayıt çözeltisinin sabit akışını sağlayın. Gerekli akışı elde etmek için, çözelti içeren tüpleri (50 mL plastik tüpler) mikroskop tablasının 25 cm yukarısına yerleştirin.
NOT: Bu yerçekimi güdümlü akış, peristaltik pompaların neden olduğu doku hareketini önlemek için kullanılır ve daha sonra daha doğru görüntü analizine olanak tanır. - Herhangi bir stimülasyondan önce, sensörlerden sabit bir floresan taban çizgisi elde etmek için kayıt solüsyonunun 5-10 dakika akmasını sağlayın. Bu temeli elde etmek için süreyi gerektiği gibi değiştirin.
- VNC / FB'leri uyarmak için akan çözeltiyi 5 dakika boyunca stimülasyon çözeltisiyle değiştirin (salin çözeltisi içinde çözülen her deney için açıklanan konsantrasyonda glikoz, piruvat veya laktat ile; her şekle bakın).
NOT: Stimülasyon süresi, deneyin ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir (örneğin, daha önce bildirildiği gibi, nöronlarda bir platoya ulaşmak için glikoz darbeleri 10 dakikaya çıkarılabilir16). - Stimülasyon çözeltisinde ozmolariteyi korumak için, eklenen monokarboksilat veya glikoz konsantrasyonuna göre sükroz konsantrasyonunu ( Drosophila beyni tarafından metabolize edilemeyen bir karbonhidrat) düzeltin.
- Basit bir vana sistemi kullanarak çözümleri değiştirin. Mikroskop tablasını hareket ettirmemeye dikkat edin.
- Nöronal aktiviteyi uyarmak için VNC'yi 80 μM pikrotoksine (PTX, sürekli akan) maruz bırakın. Bu prosedür,Ca2+ salınımlarının sıklığını arttırır ve metabolik olarak ilgili moleküllerdeki (örneğin, hücre içi ATP) değişiklikleri gözlemlemeyi mümkün kılar.
- Herhangi bir deneyin sonunda, tüpler ve kayıt odası da dahil olmak üzere tüm akış sistemini, kullanılan çözeltilerin izini ortadan kaldırmak için en az 10 dakika tuzlu su çözeltisi ve 10 dakika daha damıtılmış su ile iyice yıkayın.
5. Görüntü işleme ve veri analizi
- Elde edilen görüntüleri işlemek için Şekil 3'te gösterilen adımları izleyin.
- Görüntüyü (Laconic) ImageJ yazılımına aktarın. Görüntü, örneğin iki görünümüne sahiptir: soldaki mTFP sinyali ve sağdaki Venüs sinyalidir. Analiz edilecek hücreleri içeren bir bölge seçin ve bu görüntüleri (mTFP ve Venüs) yeni bir pencerede ayırın. Bu görüntülerin tam olarak aynı alanı içerdiğinden emin olun.
- Kayıt eklentisini açın ve normalde deneyde gözlemlenen dokunun küçük kaymasını sert gövde işleviyle düzeltin. Bunu her iki görüntüde de (mTFP ve Venüs) gerçekleştirin.
- mTFP sinyalindeki (488 nm) karşılık gelen 10 hücrenin sitozolünde en az 10 ilgi bölgesi (ROI) seçin ve seçimleri Venüs (540 nm) görüntüsüne aktarın.
- Analiz edilen hücrelere yakın, ancak fark edilebilir bir sinyal olmayan iki veya üç ROI seçin (her zaman VNC veya analiz edilen doku içinde, bkz. Şekil 3). Bunlar arka plan yatırım getirileridir.
- Her iki görüntüde de ROI'ler seçiliyken, fonksiyon ölçümünü kullanarak her sinyalin ortalama gri değerini elde edin. Verileri bir veri sayfasına aktarın ve her sinyal için ortalama arka plan değerini çıkarın.
- Venüs üzerindeki mTFP floresan oranını belirleyin (Laconic ve Pyronic için). Bu değer, burada açıklanan diğer FRET sensörlerinden farklı şekilde hesaplanır (burada oran genellikle YFP/CFP'dir), çünkü ilgili alt tabakalarına bağlandığında hem Laconic hem de Pyronic FRET verimliliklerini azaltır.
- Kaydedilen her değeri taban çizgisine bölerek verileri normalleştirin. Ayrı bir veri sayfasında, uyarandan önceki 2 dakika boyunca mTFP/Venüs oranının ortalama değerini alarak taban çizgisini hesaplayın.
- FRET tabanlı sensörler kullanan glikoz ve ATP ölçümleri için YFP/CFP oranını hesaplayın ve verileri adım 5.8'de açıklandığı gibi normalleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 saate kadar bu prosedür, monokarboksilat ve glikoz sensörlerinin floresansındaki hücre içi değişikliklerin kolayca ölçülmesini sağlar. Şekil 4'te gösterildiği gibi, hem glial hücrelerdeki hem de motor nöronlardaki Lakonik sensörler, nabzın başlangıcında benzer bir oranda 1 mM laktata yanıt verir, ancak motor nöronlar, daha önce gösterildiği gibi, 5 dakikalık nabız sırasında taban çizgisi üzerinde daha yüksek bir artışa ulaşır17. Bu laktat konsantrasyonu, üçüncü instar larvalarının hemolenfinde bulunan seviyelerle karşılaştırılabilir olduğu için seçilmiştir. Benzer şekilde, VNC eksprese eden glikoz sensörleri 5 mM glikoza maruz kaldığında (biz ve diğerleri tarafından hemolenfte ölçülene benzer bir değer19), sensörün sinyali glial hücrelerde ve nöronlarda benzer bir oranda artmıştır. Bununla birlikte, glikoz nabzı sırasında, nöronlardaki sinyal, glial hücrelerden daha fazla artar. Bu, benzer FRET sensör eksprese preparatlarının16 önceki gözlemleriyle tutarlıdır.
Bu preparat, Drosophila glial hücrelerinde veya nöronlarında20 eksprese edilen tanımlanmamış monokarboksilat ve glikoz taşıyıcıları üzerinde deneyler yapmak için kullanılabilir. Burada, daha önce heterolog hücrelerde monokarboksilatları taşıdığı bilinen Chaski'nin (Chk) glial hücrelerde laktat taşıdığını göstermek için RNA girişiminin kullanımını örnekliyoruz (Şekil 5). Beslenme kısıtlaması koşulları altında, bu taşıyıcının hayvan fizyolojisi ve davranışında önemli bir rol oynadığı tanımlanmıştır21. Glial hücrelerde, Chk'nın nakavt edilmesinin, 1 mM laktata maruz kalan kontrol VNC'lerine kıyasla laktat taşınmasını azalttığını bulduk (Şekil 5). Diğer varsayılan taşıyıcılar, fizyolojik ve patolojik koşullarda metabolitleri taşıyıp taşıyamayacaklarını görmek için test edilebilir.
Nöronal aktivite ile ilişkili metabolik değişikliklerin incelenmesini ele almak için, FRET sensör ölçümlerine müdahale edebilecek optogenetik gibi teknik olarak karmaşık prosedürler kullanmadan nöronal aktiviteyi artırmak için basit bir yöntem geliştirdik (Şekil 6). İzole edilen VNC, daha önce biz ve diğerleri tarafından kullanılan bilinen bir GABAA reseptör antagonisti olan Pikrotoksin'e (PTX) maruz bırakıldı17,22. Kullanılan konsantrasyon, nöronlardaki kalsiyum salınımlarının sıklığını (GCaMP6f floresansındaki değişikliklerle ölçüldüğü gibi) ve ayrıca glikoz, laktat ve piruvat17 gibi metabolik olarak ilgili moleküllerdeki önemli değişiklikleri arttırır. Ayrıca, nöronal aktivitede PTX'in neden olduğu artışlar, motor nöronların somasında ATP seviyelerinde geçici bir düşüşe neden olur. Bu fenomen daha önce nöronal aktivitenin elektrik stimülasyonu yoluyla veya GABAA reseptör antagonistleri23,24 kullanılarak arttırıldığı omurgalı modellerinde tanımlanmıştır. Sonuç olarak, bu model, nöronların ve glial hücrelerin belirli alt kümelerindeki metabolik değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve yüksek nöronal aktivite sırasında ATP üretimine katkıda bulunan enerji ile ilgili taşıyıcılara olan ihtiyacı ele alır.
Glikoz ve monokarboksilat taşınması, beyin dışındaki dokularda veya hücrelerde de önemlidir. Burada, larvalarda ve yetişkin sinekte bulunan ve lipid depolama ve metabolizasyon gibi birkaç temel işlevi olan metabolik olarak ilgili bir doku olan yağ cisimlerinde monokarboksilat (laktat / piruvat) ve glikoz alımının görselleştirilmesini gösteriyoruz25. Laconic sensör, Şekil 7'de gösterildiği gibi, lipid damlacıklarının hücre içinde küçük siyah küreler olarak görülebildiği FB'de iyi ifade edilir. Bu izole edilmiş doku, poli-L-lizin kaplı lamellere iyi yapışır ve analiz edilmesi de kolay olan uzun süreli bir hücre görüntüleme prosedürüne izin verir. FB, hemolenfte bulunan glikoz konsantrasyonuna yakın olan artan glikoz konsantrasyonlarına (yaklaşık 5 mM) maruz kaldığında glikoz sensörünün floresansında önemli bir artış gözlemledik. Daha yüksek konsantrasyonlarda glikoza (10 mM) daha fazla maruz kalmak, sensör floresansında beklenen artışa neden olmaz. Son olarak, FB'de laktat ve piruvat ithalatını ölçebildik (Şekil 7C,D). Bu durumda, laktat ve piruvat konsantrasyonlarının arttırılması, Lakonik ve Pironik floresansta (0.1 ila 1 mM arasında değişen) orantılı bir artışa neden olur. Daha yüksek monokarboksilat konsantrasyonları, hücrelerin içinde sinyal doygunluğuna neden olur.
Şekil 1: Drosophila larvalarının senkronizasyonu. Larva senkronizasyon prosedürü grafiksel olarak gösterilmiştir. İşlem başlamadan iki saat önce %1'lik agaroz plakları hazırlanmalı ve 4. güne kadar günde iki kez değiştirilmelidir. Kuluçkalık larvalar özenle toplanmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Laktat sensörü Laconic'i eksprese eden izole Drosophila larva beyni. (A) Poli-L-lizin kaplı bir lamel üzerine yapışmış ve motor nöronlarda (OK6-GAL4) laktat sensörünü eksprese eden izole bir Drosophila üçüncü instar larvasının ayrılmış VNC'sinin temsili bir görüntüsü. Görüntüler, VNC'nin (solda) ve sensörün mTFP floresansının (orta panel) 20x suya daldırma objektifiyle yakalanan parlak alan görüntüsünü gösterir. Alt paneldeki görüntüler, 40x suya daldırma objektifi ile çekilen aynı VNC'ye aittir. (B) Sıfır laktat salin çözeltisine yerleştirilmiş Laconic laktat sensörünü (OK6>Laconic) eksprese eden bir VNC'den gelen motor nöronlar. Görüntü, mTFP floresansını (solda), Venüs floresansını (ortada) ve iki floresan arasındaki oranı (sağda, ImageJ yazılımının Ratio Plus eklentisi kullanılarak üretilmiştir) göstermektedir. Ölçek çubukları = 50 μm (A, üst panel), 10 μm (A alt panel, B). Kısaltmalar: VNC = ventral sinir kordonu; mTFP = monomerik deniz mavisi floresan proteini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Görüntülerin adım adım analizi. Görüntü analizi için ImageJ yazılım protokolünün şematik bir gösterimi, süreci (ilk sütun), ImageJ komutlarını (ikinci sütun) ve görüntü işleme sonuçlarını (üçüncü sütun) gösterir. Örnek, motor nöronlarda (OK6-GAL4) Laconic laktat sensörünü eksprese eden bir VNC'den alınan ham bir görüntü ile başlar. Kısaltmalar: VNC = ventral sinir kordonu; mTFP = monomerik deniz mavisi floresan proteini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Drosophila larva beyninin nöronlarında ve glial hücrelerinde monokarboksilat ve glikoz taşınması. (A) Motor nöronlarda laktat sensörü Laconic'i eksprese eden VNC'nin temsili görüntüleri (OK6-Gal4>Laconic). Motor nöronlarda özlü floresan, 5 dakikalık 1 mM laktat darbesinden önce, sırasında ve sonrasında görülür. Oran görüntüleri (mTFP/Venüs) oluşturmak için ImageJ'in Ratio Plus eklentisi kullanıldı. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) 5 dakika boyunca 1 mM laktata maruz kalan motor nöronlarda (OK6-GAL4, gri çizgiler) veya glial hücrelerde (REPO-GAL4, siyah çizgiler) Lakonik laktat sensörünü eksprese eden izole VNC'lerden FRET sinyallerinin temsili kayıtları. İzler, laktat maruziyetinden 2 dakika önce toplanan ortalama değere ayarlanmış FRET sinyallerini gösterir. (C) 5 dakika boyunca 5 mM glikoza maruz kalan motor nöronlarda (OK6-GAL4, gri çizgiler) veya glial hücrelerde (REPO-GAL4, siyah çizgiler) glikoz sensörü FLII12Pglu700μδ6'yı eksprese eden izole VNC'lerden FRET sinyallerinin temsili kayıtları. İzler, ayarlanmış FRET sinyallerini glikoz maruziyetinden iki dakika önce toplanan ortalama değere gösterir. Kısaltmalar: VNC = ventral sinir kordonu; mTFP = monomerik deniz mavisi floresan proteini; FRET = Föster rezonans enerji transferi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Chaski RNAi'yi eksprese eden Drosophila larva beyninin glial hücrelerinde laktat taşınması. (A) Laktat sensörünü tek başına Laconic (genetik kontrol, w1118, siyah çizgi) eksprese eden veya Chaski (Chk) ekspresyonunu (chk-RNAi, macenta) yıkmak için bir RNAi'yi birlikte eksprese eden izole VNC, 5 dakika boyunca 1 mM Laktat'a maruz bırakıldı. Her koşul için izler, yedi ayrı VNC'den elde edilen ortalama FRET değerini temsil eder (koşul başına 70 hücre, laktata maruz kalmadan 2 dakika önce elde edilen ortalama değer kullanılarak normalleştirilir). (B) A'daki eğrinin altındaki alan, hücre içi laktat birikimini hesaplamak için kullanılır. Her koşul için değerler, 70 hücreden ve yedi bağımsız deneyden (kontrol veya chk-RNAi) elde edilen ortalama SE'dir. İstatistiksel analiz için eşleştirilmemiş Student t-testi kullanıldı (*p < 0.05). Kısaltmalar: VNC = ventral sinir kordonu; FRET = Föster rezonans enerji transferi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Pikrotoksin maruziyetinin neden olduğu nöronal ATP seviyelerindeki değişiklikler. Genetik olarak kodlanmış (A) kalsiyum sensörü GCaMP6f'yi veya (B, farklı bir deney seti) motor nöronlarda (OK6-GAL4) ATP sensörü AT1.03NL'yi eksprese eden VNC'lerden yakalanan floresan kayıtları, GABAA reseptör antagonisti Pikrotoksin'e (80 μM) maruz bırakılan hat tarafından gösterilen süre boyunca. Temsili kayıt, bir VNC'den ( A'da) tek bir motor nörondan veya PTX maruziyetinden 2 dakika önce elde edilen ortalama değerlere normalize edilmiş tek bir VNC'den ( B'de) 10 hücreden ortalama ± SE'den gelir. Kısaltmalar: VNC = ventral sinir kordonu; PTX = pikrotoksin; SE = standart hata; CFP = camgöbeği floresan proteini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Drosophila yağ cisimciklerinde monokarboksilat ve glikozun taşınması. (A) Laktat sensörü Laconic'i (mTFP floresansı) eksprese eden üçüncü instar larvalarından izole edilen yağ gövdesinin görüntüsü. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Glikoza (1, 5 ve 10 mM glikoz) maruz kalan glikoz sensörünü (FLII12Pglu700μδ6) eksprese eden FB'de yakalanan normalleştirilmiş sinyalin temsili izleri. Veriler, glikoz maruziyetinden önceki ilk 2 dakikaya normalleştirildi. (C,D) 0.1-0.5-1 mM laktat veya piruvata maruz kalan laktat sensörünü (C) veya piruvat sensörünü (D) eksprese eden FB'den elde edilen normalleştirilmiş sinyalin temsili izleri. Veriler, laktat veya piruvat maruziyetinden önceki ilk 2 dakikaya normalleştirildi. Kısaltmalar: FB = şişman vücut; mTFP = monomerik deniz mavisi floresan proteini; YFP = sarı floresan proteini; CFP = camgöbeği floresan proteini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beyin metabolizmasının incelenmesi için Drosophila modelinin kullanımı nispeten yenidir26 ve memeli metabolizması ile beklenenden daha fazla özelliği paylaştığı gösterilmiştir, bu da öncelikle birincil nöron kültürlerinde veya beyin dilimlerinde in vitro olarak incelenmiştir. Drosophila , araştırmacıların indüklenen aktivitenin neden olduğu metabolik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmelerine veya hatta duyusal bir uyarana yanıt olarak genetik araçlar ve genetik olarak kodlanmış sensörler sayesinde in vivo deneylerde mükemmeldir.
Burada açıklanan protokol, Drosophila VNC glial hücrelerinde ve nöronlarında monokarboksilat ve glikoz taşınmasının, dinlenme ve aktif nöronlardaki metabolik değişikliklerin hızlandırılmış videolarını yapmak için FRET mikroskobuna dayalı genetik olarak kodlanmış floresan metabolik sensörlerin kullanılmasına izin veren bir ex-vivo preparatın nasıl ölçüleceğini gösterir. Bu protokol, emisyon bölme sistemi ile donatılmış bir epifloresan mikroskop kullanılarak, karmaşık makineler kullanılmadan Drosophila modelini kullanan herhangi bir laboratuvarda kolayca monte edilebilir ve gerçekleştirilebilir. Ayrıca, yetişkin Drosophila beyninde olduğu gibi beyinde daha derinde bulunan belirli hücreleri kaydetmek için dönen disk, lazer konfokal veya iki foton mikroskobu (ancak ışık emisyonunu bölmek için bir ayırıcı gereklidir) gibi daha gelişmiş ekipmanlara da ölçeklendirilebilir. Bu tür metabolik sinyaller nispeten yavaş olduğundan, hızlı veya pahalı bir video kameraya gerek yoktur.
Ek olarak, izole edilmiş VNC veya FB hazırlığı, bazen in vivo kayıtlar için gerekli olan hareket düzeltmesi için karmaşık bir yönteme ihtiyaç duymaz. ImageJ eklentileri, deney sırasında üretilen VNC'lerin hareketlerinin çoğunu tatmin edici bir şekilde düzeltebilir. Sonuç olarak, PTX ilavesi veya ilgili metabolitlerin eklenmesi ile nöronal aktivitedeki artış, diğer protokollerde (fileto hazırlama gibi) görüldüğü gibi, doğal vücut kas kasılmasının neden olduğu problemler olmadan eşzamanlı olarak gerçekleştirilebilir27.
Bu metabolitlerin fizyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarında (sırasıyla 1 ve 5 mM) laktat ve glikoz taşınmasının açıkça gözlemlendiği temsili deneyler gösteriyoruz. Buradan, karakterize edilmemiş herhangi bir genin veya daha önce bildirilen proteinin, farklı nörodejeneratif hastalık modelleri veya metabolik hakaretler (yüksek kalorili diyetler veya besin kısıtlaması) gibi çeşitli koşullarda taşıma kapasitesi açısından test edilebilmesi beklenmektedir. Bu bağlamda, bilinen bir monokarboksilat taşıyıcının RNAi aracılı yıkımının, glial hücrelerde laktat taşınmasını önemli ölçüde azalttığını gösteriyoruz. İlginç bir şekilde, Laconic ve Pyronic sensörlerden elde edilen sinyaller, ortamdaki laktat veya piruvattaki değişikliklere karşı oldukça hassastır ve bu metabolitlerdeki hücre içi değişikliklerin doğru bir şekilde ölçülmesine izin verir. Sinyalin bu geniş dinamik aralığı, sensörün sinyali ile hücre içi laktat konsantrasyonu arasında doğrusal olmayan bir ilişkinin gözlemlendiği memeli hücrelerinde farklı görünmektedir28.
Bu yaklaşım, bazal ve yüksek nöronal aktivite sırasında beyinde enerji üretmek için monokarboksilatların ve glikozun nerede ve ne zaman işlendiği veya kullanıldığı ile ilgili önemli hususlara cevaplar sağlayabilir. PTX'in neden olduğu nöronal aktivitedeki artış, hücre kültürlerinde, beyin slaytlarında ve canlı organizmalarda görülene benzer şekilde, enerji ile ilgili metabolitlerde önemli değişikliklere neden olabilir23,24. Spesifik olarak, ATP üretimindeki bir artış, daha önce bildirildiği gibi, büyük olasılıkla glikoz metabolizasyonu ve glial hücreler ve nöronlar arasındaki laktat ve piruvat değişimi nedeniyle, nöronal aktivitedeki bir artıştan dakikalar sonra meydana gelir17. Glikoz ve monokarboksilatların temini için spesifik hücrelerin ihtiyaçlarının yanı sıra bunların taşınması veya üretilmesinin altında yatan mekanizmaların incelenmesi, genetik olarak kodlanmış sensörlerin kullanımıyla birlikte belirli genlerin ekspresyonunun manipüle edilmesiyle mümkün olabilir.
Metabolik olarak önemli diğer dokular, poli-L-lizin kaplı lamellere kolayca bağlanabilir ve metabolit değişiklikleri birkaç dakika boyunca görüntülenebilir. Farklı dokularda glukoz veya laktat taşınmasına aracılık eden yeni taşıyıcılar incelenebilir. Dolaşımdaki glikoz, tam olarak anlaşılmayan mekanizmalar yoluyla larva yağ gövdelerinde disakkarit trehaloz üretmek için taşınır, bu yöntemler bu yolun daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, beslenme kısıtlaması altında, yağ asitleri FB'de keton cisimcikleri üretmek için metabolize edilebilir ve bunları hemolenfe ekstrüde etmek için gerekli taşıyıcılar hala bilinmemektedir.
Bu protokolün, bir metabolitin zaman içindeki birikimini tahmin etmek veya koşullar arasında belirli bir sensörün floresansındaki artış oranlarını belirlemek için kullanılabileceğini, ancak "konsantrasyondaki" değişiklikleri resmi olarak dikkate almayacağını belirtmek önemlidir, çünkü bu bir in-situ sensör kalibrasyonu gerektirecektir. Bu durumda VNC'yi oluşturan birkaç hücre katmanı, bu kalibrasyon için gerekli olan iyonoforlar gibi moleküllerin difüzyonunu sınırlar. Bununla birlikte, bir hayvan29,30 içindeki çeşitli organlar veya hücreler arasında zıt laktat seviyelerine izin veren görüntü işleme yönergelerini izlemenizi öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir rakip veya finansal çıkar beyan etmezler.
Acknowledgments
Sierralta Lab'ın tüm üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma FONDECYT-Iniciación 11200477 (AGG'ye) ve FONDECYT Regular 1210586 (JS'ye) tarafından desteklenmiştir. UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glikoz sensörü), CNRS-Paris'ten Pierre-Yves Plaçais ve Thomas Preat tarafından bağışlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
| Cell-R Software | Olympus | - | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
