胃源性患者类器官在研究中的应用日益广泛，但目前尚缺乏从单细胞消化物出发、以标准化接种密度培养人胃类器官的正式方案。本方案提供了一种详细方法，可从上消化道内镜活检组织中稳定地构建胃类器官。
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本文内容
摘要
摘要
胃源性患者来源类器官（PDOs）为研究胃生物学和病理学提供了独特的工具，因此这些PDOs在多种研究应用中得到日益广泛的应用。然而，目前尚缺乏从单细胞消化物中制备胃类器官并保持标准化初始细胞接种密度的已发表方法。本方案重点介绍从分离的单个细胞启动胃类器官的建立过程，并提供通过碎片化方式进行类器官传代的技术方法。重要的是，该方案证明，采用标准化的初始细胞接种密度能够稳定地从良性活检组织中获得胃类器官，并实现对类器官生长的标准化定量分析。最后，研究证据支持一项新的发现：胃PDOs的形成速率和生长速度存在差异，具体取决于类器官来源于胃体部还是胃窦部的活检组织。具体而言，与来源于胃体部活检组织的类器官相比，使用胃窦部活检组织启动类器官可在一个20天的观察期内形成更多的类器官，并表现出更快的生长速度。本文所述的方案为研究人员提供了一种及时且可重复的方法，用于成功建立和操作胃源性PDOs。
引言
类器官是微小的三维（3D）细胞结构，其形态和功能类似于来源器官1,2。这些在实验室中培养的模型通过在受控环境中培养干细胞或组织特异性细胞，使细胞能够自我组织并分化为多种细胞类型而获得1,2,3。类器官的一个关键优势在于，与传统的二维（2D）细胞培养相比，它们能更真实地模拟人类生物学特性1,2,3。特别是，人类类器官已被证明能够保留其来源组织的遗传多样性3,4,5。类器官为研究人类器官发育、建立疾病模型以及在受控的实验室环境中测试潜在治疗方法提供了独特的机会。此外，类器官可来源于个体患者的样本，从而支持个性化医疗策略以及个体化治疗方案的潜在开发3,6
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方案
本方案中使用的所有人体组织均来自通过宾夕法尼亚大学机构审查委员会（IRB #842961）批准的胃组织采集研究项目并签署知情同意书的个体。参与本研究的受试者需因常规诊疗需要接受上消化道内镜检查，年龄至少18岁，并能够提供知情同意。所有研究工作均遵循宾夕法尼亚大学制定的指导方针。
1. 实验准备
- 按先前所述方法制备条件培养基L-WRN16。尽管非必需，但可使用市售ELISA试剂盒按照制造商说明检测条件培养基中Wnt-3A、R-spondin和noggin的浓度（参见材料表）。
- 配制含抗生素的RPMI培养基（RPMI-ABX）、含抗生素的PBS（PBS-ABX）、含二硫苏糖醇的PBS（PBS-DTT）、消化缓冲液以及胃类器官培养基（具体成分见补充表1）。胃类器官培养基在4 °C下可稳定保存1周。
- 对镊子、精细解剖剪刀和1.5 mL离心管进行高压灭菌处理。
- 将基底膜基质（Matrigel）置于冰上开始解冻。
- 将消化缓冲液和胰蛋白酶-EDTA置于37 °C水浴中开始解冻。
- 将培养箱内的轨道摇床预设为37 °C、200 rpm。
2. ....
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结果
以下代表性结果来自五名接受上消化道内镜检查患者的胃体和胃窦区域良性上皮组织活检样本。每名患者的胃体和胃窦活检样本分别接种并分析了2至4个“穹顶”/孔。所有五名患者的胃体和胃窦活检组织均成功生成了类器官。平均每个“穹顶”/孔分析了41个类器官。所有图像均使用共聚焦显微镜获取的z轴投影图像，类器官大小和球形度的定量分析采用 commercially available image analysis software（见材料表）进行。
类器官通常在单细胞接种后10天内可被识别（图3A）。至第20天，类器官体积已较大，通常需要进行传代。尽管单细胞接种后形成的类器官数量存在一定变异性，但来自胃体和胃窦活检组织的类器官形成数量的预期结果如图3B所示。胃体和胃窦类器官的数量在接种后第10天达到峰值。虽然差异不显著，但从第10天到第15天以及第15天到第20天，类器官总数开始呈下降趋势。似乎存在一小群在第10天形成的小型类器官，其在随后的10天内.......
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讨论
本文概述了一种从胃体和幽门良性上皮活检组织中分离的单细胞可靠生成人胃类器官的详细方案。该方案的关键步骤涉及时间控制以及对基底膜基质的处理。为保持细胞活性，获取活检组织后应尽快启动实验，目标是在活检后30分钟内开始消化组织。处理基底膜基质也可能具有挑战性：当其在冰上解冻时保持液态，但在温度高于4 °C时会聚合。因此，必须迅速将基底膜基质从冰上取出并与单细胞或类器官片段混合，以制备用于铺板的"穹顶状结构"，因为其在1分钟内即开始聚合。一旦基质在离心管中聚合，便无法再用移液枪头吸取。若发生此情况，可将离心管放回冰上，直至Matrigel重新解聚为液态。在轻柔吹打混匀单细胞或类器官片段与基底膜基质时，也必须避免产生气泡。虽然基底膜基质"穹顶"内的气泡似乎不影响类器官的形成与生长，但会阻碍观察。此外，将基底膜基质/细胞混合物分装至细胞培养板的孔中后，必须将培养板倒置并放入培养箱中。此步骤至关重要，可使基底膜基质聚合形成三维"穹顶"结构，并防止单细胞或类器官片段沉降至孔底。
采用本方案，胃类器官在单细胞接种后10天内即可被识别。经验表明，10天后.......
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披露
作者无相关披露信息。
致谢
宾夕法尼亚大学基因组医学培训项目 T32 HG009495（KHB），美国国家癌症研究所 R21 CA267949（BWK），男性 & Basser BRCA 研究中心 BRCA 项目（KHB，BWK），DeGregorio 家族基金会资助奖（BWK）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| 两性霉素B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| 胶原酶III | Worthington | LS004182 | |
| 分散酶II | Sigma | D4693-1G | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 抗真菌剂（Fungin） | InvivoGen | NC9326704 | |
| 胃泌素I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| 庆大霉素 | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| 人EGF（hEGF） | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| 人FGF-10（hFGF-10） | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN细胞系 | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| 甲硝唑 | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2添加剂 | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA试剂盒 | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| 青霉素-链霉素（Pen Strep） | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
参考文献
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al.
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