Summary
אורגנואידים שמקורם בקיבה מוצאים שימוש הולך וגובר במחקר, אך פרוטוקולים רשמיים ליצירת אורגנואידי קיבה אנושיים מתעכלים חד-תאיים עם צפיפות זריעה מתוקננת חסרים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת אורגנואידים בקיבה באופן אמין מרקמת ביופסיה המתקבלת במהלך אנדוסקופיה עליונה.
Abstract
אורגנואידים שמקורם בקיבה (PDOs) מציעים כלי ייחודי לחקר ביולוגיה ופתולוגיה של קיבה. כתוצאה מכך, PDOs אלה מוצאים שימוש הולך וגובר במגוון רחב של יישומי מחקר. עם זאת, קיים מחסור בגישות שפורסמו לייצור PDO בקיבה מתעכלים חד-תאיים תוך שמירה על צפיפות זריעת תאים ראשונית מתוקננת. בפרוטוקול זה, הדגש הוא על התחלת אורגנואידים בקיבה מתאים בודדים מבודדים ומתן שיטה להעברת אורגנואידים באמצעות פיצול. חשוב לציין, הפרוטוקול מראה כי גישה סטנדרטית לצפיפות זריעת התאים הראשונית מניבה באופן עקבי אורגנואידים בקיבה מרקמת ביופסיה שפירה ומאפשרת כימות סטנדרטי של צמיחת אורגנואידים. לבסוף, ראיות תומכות בתצפית החדשנית כי PDO קיבה מציג שיעורים משתנים של היווצרות וגדילה בהתבסס על האם מקורם של האורגנואידים בביופסיות של הגוף או באזורים אנטראליים של הקיבה. באופן ספציפי, מתגלה כי השימוש ברקמת ביופסיה אנטראלית להתחלת אורגנואידים גורם למספר גדול יותר של אורגנואידים שנוצרו ולצמיחת אורגנואידים מהירה יותר על פני תקופה של 20 יום בהשוואה לאורגנואידים שנוצרו מביופסיות של גוף הקיבה. הפרוטוקול המתואר כאן מציע לחוקרים שיטה בזמן וניתנת לשחזור ליצירה מוצלחת ולעבודה עם PDO קיבה.
Introduction
אורגנואידים הם מבנים תאיים זעירים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) הדומים לארכיטקטורה ולפונקציונליות של האיברים שמהם הם נגזרו 1,2. מודלים אלה שגודלו במעבדה נוצרים על ידי טיפוח תאי גזע או תאים ספציפיים לרקמות בסביבה מבוקרת המאפשרת לתאים אלה להתארגן בעצמם ולהתמיין לסוגי תאים שונים 1,2,3. אחד היתרונות העיקריים של אורגנואידים הוא יכולתם לשחזר את הביולוגיה האנושית באופן הדוק יותר מאשר תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות (2D) 1,2,3. בפרט, אורגנואידים אנושיים הוכחו לשמור על המגוון הגנטי של רקמת המקור שלהם 3,4,5. אורגנואידים מציעים הזדמנות ייחודית לחקור התפתחות איברים אנושיים, למדל מחלות ולבחון טיפולים פוטנציאליים בסביבת מעבדה מבוקרת. יתר על כן, ניתן להפיק אורגנואידים מדגימות בודדות של מטופלים, מה שמאפשר גישות של רפואה מותאמת אישית ופיתוח פוטנציאלי של טיפולים מותאמים אישית 3,6,7.
חוקרים השתמשו באורגנואידים של קיבה אנושית כדי לחקור היבטים שונים של ביולוגיה ופתולוגיה של קיבה. דוגמאות בולטות כוללות את השימוש באורגנואידים שמקורם בחולים (PDOs) כדי לחזות תגובות כימותרפיותלסרטן קיבה 8,9,10 ולדגמן את תגובת האפיתל לזיהום הליקובקטר פילורי 11,12,13. אורגנואידי קיבה אנושיים מורכבים מסוגי תאים שונים הנמצאים בקיבה, כולל תאי צוואר, תאי בור ותאים תומכים אחרים11,14. אורגנואידים בקיבה יכולים להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) או מתאי גזע שבודדו ישירות מרקמת קיבה המתקבלת באמצעות ביופסיות או מדגימות כריתת קיבה11,14. בידוד תאי גזע בקיבה מרקמת קיבה נעשה בדרך כלל על ידי בידוד ותרבית בלוטות קיבה או עיכול אנזימטי של דגימות רקמה כדי לשחרר תאים בודדים 9,13,15. חשוב לציין, ההתמיינות של תאים בתוך אורגנואידים קיבה שנוצרו באמצעות כל אחת מהטכניקות הללו הוכחה כדומה13. הפרוטוקול המתואר כאן מתמקד בתקציר חד-תאי.
אורגנואידים מייצגים חידוש מדעי המגשר על הפער בין תרבית תאים מסורתית לבין איברים שלמים. ככל שהמחקר בתחום ממשיך להתקדם, אורגנואידים צפויים לתרום לפיתוח טיפולים וטיפולים יעילים יותר למגוון רחב של יישומים. בהתחשב בשימוש הגובר של PDO קיבה, יש צורך בזמן גישה סטנדרטית הדור שלהם. כאן מתואר הפרוטוקול ליצירת PDO קיבה אנושי מתאים בודדים שבודדו מרקמת ביופסיית קיבה שפירה שנרכשה במהלך אנדוסקופיה עליונה. חשוב וייחודי, נקבע מספר סטנדרטי של תאים בודדים לזריעה כדי ליצור באופן אמין PDO קיבה ולאפשר אפיון לאחר מכן. באמצעות טכניקה זו, הבדלים אמינים בהיווצרות וצמיחה של אורגנואידים שנוצרו מביופסיות של גוף הקיבה או אנטרום קיבה מודגמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הרקמה האנושית המשמשת בפרוטוקול זה נאספה מאנשים שסיפקו הסכמה מדעת לאיסוף רקמות באמצעות מחקר איסוף רקמות קיבה שאושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת פנסילבניה (IRB #842961). המשתתפים במחקר זה נדרשו לעבור אנדוסקופיה עליונה כחלק מהטיפול השגרתי שלהם, להיות בני 18 לפחות ולהיות מסוגלים לספק הסכמה מדעת. כל המחקרים שנערכו עמדו בהנחיות שנקבעו על ידי אוניברסיטת פנסילבניה.
1. הכנה ניסיונית
- הכן מדיית L-WRN מותנית כמתואר לעיל16. למרות שהדבר אינו חובה, ניתן לבדוק את ריכוזי Wnt-3A, R-spondin ו-noggin הכלולים במדיה המותנית באמצעות ערכות ELISA הזמינות מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
- הכינו RPMI-אנטיביוטיקה (RPMI-ABX), PBS-Antibiotics (PBS-ABX), PBS-Dithiothreitol (PBS-DTT), חיץ עיכול ומדיה אורגנואידית קיבה (ראה טבלה משלימה 1 להרכב מפורט). מדיה אורגנואיד קיבה יציב במשך שבוע אחד ב 4 °C (75 °F).
- מלקחיים אוטוקלאביים, מספריים לדיסקציה עדינה וצינורות 1.5 מ"ל.
- התחילו להפשיר את מטריצת קרום המרתף (מטריג'ל) על קרח.
- התחל להפשיר את חיץ העיכול ואת טריפסין-EDTA באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
- הגדר שייקר מסלול אינקובטור ל 37 ° C ו 200 סל"ד.
2. בידוד תאים בודדים מרקמת הביופסיה
- יש לאסוף ביופסיות קיבה במהלך אנדוסקופיה עליונה17 בהתאם לפרוטוקול הקליני המוסדי, ככל הנראה תוך שימוש במלקחיים ג'מבו. השתמש במחט קהה כדי לחלץ דגימות רקמה מהמלקחיים ומקם אותן בצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל מדיה RPMI-ABX. שמור את הצינור על קרח להעברה מהירה למעבדה.
הערה: לכל הפחות, יש לאסוף 2-4 ביופסיות. - אפשרו לרקמת הביופסיה להתיישב בתחתית הצינור החרוטי. השתמש פיפטה כדי לשאוף את המדיה ולשטוף את הביופסיות פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ PBS-ABX. אין צורך בצנטריפוגה, מכיוון שחתיכות הרקמה מתיישבות באופן טבעי בצינור החרוט.
- להעביר לפחות 20 מ"ג של רקמת ביופסיה לצינור 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של PBS-DTT.
- השתמש מספריים דיסקציה עדינה לחתוך את הרקמה לחתיכות כי הם 1-2 מ"מ או פחות.
- השתמשו במיניצנטריפוגה שולחנית למשך 15 שניות כדי לצבור חתיכות רקמה בתחתית הצינור ולשאוף כמה שיותר סופרנאטנט. נפח שיורי קטן של PBS-DTT מקובל.
- הוסף 5 מ"ל של חיץ עיכול מחומם טרי לצינור חרוטי 50 מ"ל. כדי להעביר את חתיכות הרקמה הקטנות מבלי לאבד רקמה, לקחת 500 μL של חיץ העיכול ולהוסיף אותו צינור 1.5 מ"ל המכיל את הרקמה. לאחר מכן, שנה את קצה קצה פיפטה 1000 μL עם מספריים כדי להגדיל את קוטר הקצה, המאפשר שאיפה קלה והעברה של חתיכות רקמה לצינור חרוטי 50 מ"ל המכיל את חיץ העיכול.
- יש לדגור על חיץ העיכול ותערובת הרקמות בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות עם רעידות מסלוליות ב-200 סל"ד.
- הוסף 5 מ"ל של טריפסין מחומם עם 0.25% EDTA למאגר העיכול ודגור במשך 10 דקות נוספות ב 37 ° C עם רעידות מסלוליות ב 200 סל"ד.
- נטרל את חיץ העיכול והטריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיה מתקדמת (עו"ד) DMEM/F12 והעבר את התמיסה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר.
- גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1400 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C. בהתאם לגודל הראשוני של רקמת הביופסיה, כדור תא קטן עשוי להיות גלוי או לא.
- יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיה מסוג Adv. DMEM/F12 ולספור את מספר התאים הקיימים באמצעות Trypan Blue והמוציטומטר.
- גלול את התאים שוב דרך צנטריפוגה ב 1400 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant.
הערה: איור 1 מציג ייצוג סכמטי של תהליך בידוד תאים בודדים מרקמת הביופסיה.
3. שיבוץ תאים בודדים במטריצת קרום מרתף "כיפה"
- בהתבסס על המספר הנספר של תאים בני קיימא, חשב את נפח מטריצת קרום המרתף הנדרשת להשגת ריכוז סופי של 105 תאים קיימא לכל 50 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף.
- בצע את הפעולות הבאות במהירות כדי למנוע ממטריצת קרום המרתף להתפלמר לפני הציפוי. הסר את מטריצת קרום המרתף המופשרת מקרח, הוסף את הנפח שחושב קודם לכן של מטריצת קרום המרתף לתאים, וערבב בעדינות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה במשך כ -10 שניות.
הערה: חשוב להימנע מיצירת בועות במהלך שלב זה. אין לדלל את מטריצת קרום המרתף. - פיפטה 50 μL aliquots במהירות של מטריצת קרום המרתף / תערובת תאים למרכז בארות בודדות בצלחת תרבית רקמות 24 בארות.
- כסו מיד את הצלחת בעלת 24 הקידוחים, ובתנועה חלקה אחת, הפכו את הצלחת על פיה. הניחו את הצלחת ההפוכה באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37°C למשך 35 דקות כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר.
הערה: היפוך הצלחת חיוני כדי למנוע מהתאים לשקוע לתחתית הצלחת וכדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר לצורת "כיפה" תלת ממדית. - הוסף 500 μL של מדיה אורגנואיד קיבה שחומם מראש לכל באר, להבטיח כי החלק העליון של כל "כיפה" הוא שקוע לחלוטין במדיה. פזרו את המדיה בצד של כל באר כדי למנוע הפרעה ל"כיפה".
- שנה את המדיה כל 2-3 ימים.
4. מעבר שגרתי של אורגנואידים באמצעות פיצול
- ברגע שהאורגנואידים מוכנים למעבר, הסר את המדיה מכל באר ייעודית.
הערה: כדי לקבוע את הזמן המתאים למעבר, עיין בסעיף תוצאות מייצגות. - יש לפזר 1 מ"ל של מדיית Adv. DMEM/F12 קרה כקרח ישירות על "כיפה" של מטריצת קרום מרתף. זה אמור בקלות ליזום את פירוק "הכיפה". ממשיכים לשאוף ולפזר עד שכל שברי ה"כיפה" מתנתקים מהצלחת.
- העבירו הן את המדיה והן את מטריצת קרום המרתף המקוטעת לבאר הבאה, וחזרו על תהליך זה עבור כל הבארות המיועדות למעבר. לאחר פירוק מטריצת קרום המרתף הסופית "כיפה", מחלקים את המדיה ואת תערובת האורגנואידים ומטריצת קרום המרתף לתוך צינור 1.5 מ"ל.
- חבר קצה של 1000 μL לפיפטה P1000, ולאחר מכן הכנס קצה זה לקצה של 200 μL. זה ייצור קצה פיפטה בקוטר קטן מספיק כדי לשבור את האורגנואידים ועדיין לאפשר שאיפה לנפח גדול יותר.
- פיפטה נמרצת של תערובת האורגנואידים ומטריצת קרום המרתף מעלה ומטה בערך 25 פעמים כדי לפרק את האורגנואידים לחתיכות קטנות.
- צנטריפוגה את תערובת האורגנואידים המקוטעת באמצעות צנטריפוגה שולחנית ב 4 ° C במשך 30 שניות ב 2000 x גרם. התוצאה תהיה גלולה של אורגנואידים מקוטעים המופרדים ממטריצת קרום המרתף וממדיה. השתמש פיפטה כדי לשאוף את המדיה ואת מטריצת קרום המרתף supernatant. אין להשתמש בוואקום כדי לשאוף את הסופרנטנט, מכיוון שהגלולה רופפת.
- חישוב נפח ממברנת מרתף שזה עתה הופשרה נדרש כך שמספר הבארות/כיפות יפוצל ביחס של 1:2 (50 מיקרוליטר/כיפה). מוסיפים את מטריצת קרום המרתף הטרי ופיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב, תוך הקפדה להימנע מיצירת בועות.
- במהירות aliquot 50 μL של תערובת של שברי אורגנואידים ומטריצת קרום מרתף לתוך בארות בודדות של צלחת 24 בארות.
- כסו את הצלחת, הפכו אותה והניחו אותה באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר.
- הוסף 500 μL של מדיה אורגנואיד קיבה שחומם מראש לכל באר.
הערה: איור 2 מציג סקירה סכמטית של העברת אורגנואידים שמקורם בקיבה באמצעות פיצול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות המייצגות הבאות נגזרות מביופסיות שנלקחו מהאפיתל השפיר של גוף הקיבה ואזורי אנטרום קיבה בקיבתם של חמישה חולים שונים שעברו אנדוסקופיה עליונה. שתיים עד ארבע "כיפות" / בארות צופו ונותחו לכל מטופל הן עבור ביופסיות גוף קיבה והן ביופסיות אנטרום. אורגנואידים נוצרו בהצלחה מגוף הקיבה ומרקמת ביופסיית אנטרום קיבה מכל חמשת החולים. בממוצע, 41 אורגנואידים נותחו לכל "כיפה" / באר. כל התמונות הן הקרנות z שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, וכימות גודל האורגנואידים וספריותם בוצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונות מסחרית (ראה טבלת חומרים).
אורגנואידים בדרך כלל ניתנים לזיהוי בתוך 10 ימים לאחר הזריעה של תאים בודדים (איור 3A). ביום ה-20 האורגנואידים גדולים ובדרך כלל צריך לעבור אותם. בעוד שמספר האורגנואידים שנוצרים לאחר זריעה של תא בודד יכול להיות משתנה במידת מה, התוצאות הצפויות עבור מספר האורגנואידים שנוצרו מהגוף ומביופסיות קיבה אנטראליות מוצגות באיור 3B. מספר האורגנואידים בגוף ובאנטראליים מגיע לשיא ביום ה-10 שלאחר הזריעה. אמנם לא משמעותי, המספר הכולל של אורגנואידים מתחיל לרדת מיום 10 ליום 15 ויום 15 ליום 20. נראה שיש תת-אוכלוסייה של אורגנואידים קטנים שנוצרים ביום ה-10 ואז מפסיקים לגדול ומתים במהלך 10 הימים הבאים, מה שיכול להסביר את המגמה הזו. חשוב לציין, כי מספר האורגנואידים שנוצרו מרקמת ביופסיה אנטראלית גבוה משמעותית מרקמת ביופסיה מהגוף בימים 10, 15 ו -20. מספר האורגנואידים האנטראליים שנוצרו היה בממוצע גבוה פי 2 ממספר האורגנואידים שנוצרו מהגוף.
באיור 3C, מוצגות תוצאות מייצגות של גדילת אורגנואידים לאחר זריעה של תא בודד בין היום ה-10 ליום ה-20. בעוד אורגנואידים הן מביופסיות אנטראליות והן מביופסיות גוף ראו צמיחה יציבה מהיום ה-10 עד ה-20, אורגנואידים שנוצרו מרקמת ביופסיה אנטראלית הציגו קצב גדילה גדול יותר בהשוואה לאורגנואידים שנוצרו מרקמת ביופסיית הגוף. בפרט, לאורגנואידים אנטראליים היה שטח גדול כמעט פי 4 מאשר לאורגנואידים בגוף ביום ה-20.
בקרב מטופלים שונים, מגוון של מורפולוגיית אורגנואידים נצפה בדרך כלל בכל "כיפה" / באר בודדת (איור 4A). חלק מהאורגנואידים עגולים יותר או כדוריים יותר בעוד שאחרים הציגו מורפולוגיה לא סדירה יותר. אולם בממוצע, ספריות, מדידה של עד כמה אורגנואיד הוא כדורי (כאשר ציון של 1 = כדור מושלם)18, הראתה שונות קטנה בתוך ובין אורגנואידים שנוצרו מרקמת ביופסיה של הגוף או של ביופסיה אנטראלית (איור 4B). לכן, למרות שיש קצבי גדילה שונים, בדרך כלל אין הבדלים מורפולוגיים משמעותיים בין אורגנואידים שנוצרו מרקמת ביופסיה של גוף הקיבה או אנטרום.
ביום ה-20 שלאחר ההתחלה, אורגנואידים בקיבה בדרך כלל מוכנים למעבר. גודל אורגנואיד גדול (≥1500 מיקרומטר קוטר) או פנים כהה (מרמז על תחלופה תאית נרחבת) של האורגנואיד הם סימני מפתח לכך שצריך לעבור אורגנואידים (איור 5A). אורגנואידים שנותרו מעבר לנקודה זו עשויים להתחיל להתפרק לחד-שכבות דו-ממדיות (איור 5B) שאינן יוצרות מחדש אורגנואידים באופן אמין לאחר מעבר, מה שאולי מצביע על אובדן כדאיות או גבעול. לאחר העברה וזריעה מחדש של אורגנואידי קיבה באמצעות פרוטוקול הפיצול המתואר כאן, ה"כיפות" יכילו מקטעי אורגנואידים רבים (איור 5C) שיתארגנו מחדש להרבה יותר אורגנואידים ויגדלו הרבה יותר מהר בהשוואה לזריעה הראשונית של תאים בודדים (איור 5D). אם גידול אורגנואידים עדיין זקוק לאפיון ו / או סטנדרטיזציה בזמן המעבר, אורגנואידים בקיבה יכולים במקום זאת להתעכל לתאים בודדים, כפי שתואר קודם לכן19.
איור 1: יצירת אורגנואידים שמקורם בקיבה של מטופלי קיבה. סקירה סכמטית המתארת את תהליך הפקת אורגנואידים שמקורם בקיבה מביופסיות של אפיתל קיבה שפיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מעבר של אורגנואידים שמקורם בקיבה של מטופלי קיבה. סקירה סכמטית הממחישה את המעבר של אורגנואידים שמקורם בקיבה באמצעות פיצול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: היווצרות וגדילה של אורגנואידים שמקורם בקיבה של מטופלי קיבה. (A) תמונות מייצגות של הקרנת z המציגות את הצמיחה של אורגנואידים בקיבה ביום 10, 15 ו-20 לאחר הזריעה של תא יחיד. התמונות הן של אורגנואידים שנוצרו מגוף קיבה ורקמת ביופסיה של אנטרום מאותו חולה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (B) מספר ממוצע (±SD) של אורגנואידים בגוף הקיבה ובאנטרום בנקודות הזמן שצוינו לאחר הזריעה של תא יחיד. (C) שטח ממוצע (±SD) (מיקרומטר2) של אורגנואידים בגוף הקיבה ובאנטרום בנקודות הזמן שצוינו לאחר הזריעה של תא בודד. n = 5 חולים לקבוצה ולנקודת זמן. * = הבדל מובהק סטטיסטית (P ≤ 0.05) בנקודת הזמן שצוינה. n.s. = אין הבדל מובהק סטטיסטית בנקודת הזמן שצוינה. השוואות סטטיסטיות שנערכו באמצעות ANOVA דו-כיוונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מורפולוגיה של אורגנואידים שמקורם בחולה קיבה. (A) תמונות היטל Z מייצגות של מורפולוגיות אורגנואידים שונות בקיבה מ"כיפה" / באר בודדת של אורגנואידים שמקורם בגוף הקיבה ביום ה-15 שלאחר הזריעה של תא יחיד. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) ממוצע (±SD) גוף קיבה ואנטרום אורגנואיד ספריות (כאשר ערך של 1 = כדור מושלם). n = 5 חולים לקבוצה ולנקודת זמן. n.s. = אין הבדל מובהק סטטיסטית בכל נקודת זמן. השוואות סטטיסטיות שנערכו באמצעות ANOVA דו-כיוונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מעבר אורגנואיד שמקורו בחולה קיבה. (A) תמונה מייצגת של אורגנואידים המוכנים למעבר ביום ה-20 לאחר הזריעה של תא בודד. (B) תמונה מייצגת של אורגנואידים שאיחרו לעבור ביום ה-25 שלאחר הזריעה החד-תאית. (C) תמונה מייצגת של אורגנואידים מקוטעים לאחר הזריעה מחדש (קטע 1 - יום 0). (D) תמונה מייצגת של גידול אורגנואידים במשך 5 ימים לאחר הזריעה מחדש (מעבר 1 - יום 5). כל התמונות הן הקרנות z. פסי קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה משלימה 1: פתרונות ומתכוני מדיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
להלן מתואר פרוטוקול מפורט ליצירה אמינה של אורגנואידי קיבה אנושיים מתאים בודדים שבודדו מביופסיות של אפיתל שפיר מגוף הקיבה והאנטרום. השלבים הקריטיים בפרוטוקול סובבים סביב תזמון, כמו גם טיפול במטריצת קרום המרתף. כדי לשמר את הכדאיות, חיוני להתחיל את הפרוטוקול בהקדם האפשרי לאחר רכישת רקמת הביופסיה. המטרה היא להתחיל לעכל את רקמת הביופסיה תוך 30 דקות מרגע ביצוע הביופסיה. הטיפול במטריצת קרום המרתף יכול גם להיות מאתגר. כאשר מופשר על קרח, הוא נשאר נוזל; עם זאת, בטמפרטורות מעל 4 °C (75 °F), הוא מתפלמר. לכן, העברה מהירה של מטריצת קרום המרתף מקרח כדי לערבב עם תאים בודדים או שברי אורגנואיד לציפוי "כיפות" חייבת להיעשות מיד, כפי שהוא מתחיל פילמור בתוך דקה אחת. ברגע שהוא מתפלמר בצינור, לא ניתן לשאוף אותו לקצה פיפטה. אם זה קורה, ניתן להניח את הצינור על קרח עד שהמטריג'ל מתפרק בחזרה לנוזל. כאשר מעיפים בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב תאים בודדים או שברי אורגנואידים עם מטריצת קרום המרתף, חשוב גם להימנע מיצירת בועות. בעוד בועות ב"כיפה" של מטריצת קרום מרתף אינן מעכבות היווצרות אורגנואידים וצמיחה, הן יכולות לחסום ויזואליזציה. בנוסף, לאחר הכנסת מטריצת קרום המרתף/תערובת התאים לבאר(ות) של צלחת תרבית תאים, יש להפוך את הצלחת ולהכניס אותה לאינקובטור. שלב זה הוא קריטי כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר לצורת "כיפה" תלת ממדית ולמנוע מהתאים הבודדים או שברי האורגנואידים לשקוע לתחתית הצלחת.
באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לזהות אורגנואידים בקיבה תוך 10 ימים מזריעת תא בודד. הניסיון מראה כי מעט מאוד אורגנואידים חדשים בקיבה נוצרים מעבר ליום 10, ולמעשה, המספר הכולל של אורגנואידים עשוי לרדת מעט מהיום 10-20. זה נכון לגבי אורגנואידים הנוצרים הן מגוף הקיבה והן מאנטרום. עם זאת, המספר הכולל של אורגנואידים שנוצרו מביופסיות אנטראליות בקיבה גבוה משמעותית מאשר מביופסיות גוף קיבה. יתר על כן, הצמיחה של אורגנואידים אנטראליים עולה בהרבה על אורגנואידים בגוף בין ימים 10-20 לאחר זריעה של תא בודד. ניתן לייחס הבדל זה לשינויים ברגישות Wnt. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי PDOs של גוף הקיבה מפגינים צמיחה טובה יותר עם הפעלת Wnt נמוכה יותר, בעוד PDOs של אנטרום קיבה משגשגים עם הפעלת Wnt גבוהה יותר20. המיקום של ביופסיות קיבה המשמשות ליצירת PDO קיבה אינו מצוין בדרך כלל בספרות. הבדלים כאלה צריכים להילקח בחשבון במחקרים עתידיים המשתמשים ב- PDO קיבה שנוצר מביופסיות קיבה של אזורי קיבה שונים.
היבט מכריע נוסף של פרוטוקול זה הוא קביעת מספר סטנדרטי של תאים בודדים לזרע לכל "כיפה" / באר לייצור אמין של PDO קיבה. בעוד שמחקר קודם דיווח על מספר מתוקנן של בלוטות קיבה לזרעים ליצירת PDO, אף מחקר קודם שהשתמש בשיטת עיכול תא בודד לא הזכיר את מספר התאים שנזרעו או אם המספר היה עקבי על פני קווי PDO שונים. כישלון בסטנדרטיזציה של מספר התאים שנזרעו יכול לגרום למספר משתנה מאוד של תאי גזע להיזרע לכל "כיפה" / באר. מכיוון שתאי גזע הם המקור העיקרי להיווצרות אורגנואידים בקיבה, זה יכול להוביל לשיעורים משתנים של היווצרות אורגנואידים וצמיחה. לכן, שימוש במספר לא סטנדרטי של תאים בודדים יכול לבלבל פרשנויות של היווצרות או השוואות גדילה על פני קווי PDO קיבה שונים. כאן, הוכח כי סטנדרטיזציה של מספר התאים שנזרעו ל -105 תאים לכל "כיפה" / באר מייצרת באופן אמין PDOs קיבה מביופסיות של הגוף ואזורים אנטראליים של הקיבה.
פרוטוקול זה הותאם לשימוש ברקמת ביופסיית קיבה טרייה. כתוצאה מכך, ההצלחה של פרוטוקול זה עשויה להשתנות בעת שימוש ברקמה קפואה או רקמה שנשמרה באמצעים אחרים. בנוסף, אין נתונים על משך הזמן שבו ביופסיות טריות שומרות על כדאיותן, שכן רקמת הביופסיה מעובדת בהקדם האפשרי לאחר הוצאתה מקיבתו של המטופל. יש להניח שככל שהרקמה הטרייה יושבת זמן רב יותר לפני העיבוד, כך פחות תאים בני קיימא יבודדו.
העברת PDO קיבה באמצעות פיצול, כמתואר בפרוטוקול זה, מספקת שיטה קלה למעבר שגרתי. בעוד PDOs קיבה עברו בהצלחה עד 4 פעמים באמצעות טכניקה זו, לא היו ניסיונות לקבוע כמה פעמים הם יכולים לעבור תוך שמירה על צמיחה יציבה וכדאיות. דיווחים מסוימים מצביעים על כך שהצמיחה של אורגנואידים בקיבה עשויה להאט לאחר 5 מעברים או יותר21,22, בעוד שאחרים צפו בצמיחה אמינה של עד 10 מעברים23.
מצע אורגנואיד הקיבה המשמש בפרוטוקול זה מכיל Wnt-3A, noggin ו- R-spondin שמקורם במדיה מותנית של תאי L-WRN. כדי לייצר את המדיה המותנית, נעשה שימוש בפרוטוקול שתואר על ידי מיושי וסטפנבק16. לחלופין, ניתן לרכוש בנפרד Wnt-3A, noggin ו-R-spondin כחלבונים רקומביננטיים. רכישת רכיבים בודדים בנפרד היא אידיאלית כדי למנוע השפעות אצווה פוטנציאליות שעלולות להתעורר בעת שימוש במדיה מותנית מתאי L-WRN. עם זאת, רכישת החלבונים הרקומביננטיים היא יקרה ועשויה להיות יקרה עבור חוקרים שעובדים לעתים קרובות עם אורגנואידים.
בהתחשב בשימוש הגובר של PDOs קיבה ביישומים שונים, זה בזמן והכרחי להקים גישות סטנדרטיות ליצירת PDO קיבה שפיר. הפרוטוקול המתואר כאן מציע שיטה אמינה לחקירות עתידיות המשתמשות ב- PDO קיבה. מניסיוננו, פרוטוקול זה הצליח לייצר אורגנואידים מביופסיות של רירית קיבה שפירה מעל 90% מהזמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין גילויים רלוונטיים.
Acknowledgments
אוניברסיטת פנסילבניה רפואה גנומית T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), גברים ותוכנית BRCA במרכז בסר ל- BRCA (KHB, BWK), פרס מענק קרן משפחת גרגוריו (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H.
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S.
- Zhao, Z., et al.
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
