通过肺动脉干缩窄建立压力超负荷诱导的小鼠右心室肥厚与衰竭模型

摘要

我们描述了一种通过肺动脉干缩窄诱导右心室压力超负荷的小鼠模型。本文包含了气管插管、手术操作以及通过超声心动图进行表型分析的详细实验方案。气管插管和手术过程中使用了自制的器械，可实现模型的快速建立且成本低廉。

摘要

由压力超负荷引起右心室（RV）衰竭与多种心血管和肺部疾病的发病率及死亡率密切相关。右心室衰竭的发病机制复杂，目前仍未被充分理解。为了寻找治疗右心室衰竭的新策略，必须依赖可靠且可重复的动物模型。肺动脉干缩窄（PTB）模型因其能够在不受肺血管床变化干扰的情况下独立评估右心室功能，而日益受到关注。

本文介绍了一种通过肺动脉缩窄术（PTB）在5周龄小鼠中建立的右心室压力超负荷的小鼠模型。该模型可用于诱导不同程度的右心室病理改变，范围从轻度右心室肥厚到失代偿性右心室衰竭。文中包含了气管插管、PTB手术以及通过超声心动图进行表型分析的详细实验方案。此外，还提供了气管插管和PTB手术所需器械的定制方法，有助于快速且低成本地复制PTB模型。

采用钛夹结扎环扎肺动脉干，确保肺动脉干缩窄程度具有高度可重复性且不受操作者影响。根据不同的结扎夹内径对肺动脉缩窄（PTB）的严重程度进行分级（轻度：450 µm；重度：250 µm）。由此产生的右心室（RV）病理变化范围从伴有右心室功能保留的肥厚，到表现为心输出量降低及心外表现的失代偿性右心室衰竭。术后1周和3周通过超声心动图评估右心室功能。本文展示了超声心动图图像及结果示例。此外，还展示了右心导管检查以及心脏组织的组织学分析结果。

引言

右心室（RV）衰竭是一种临床综合征，由右心室功能障碍引起，表现为心力衰竭症状和体循环淤血体征¹。右心室功能障碍与多种心血管和肺部疾病的发病率及死亡率密切相关²。右心室功能障碍的病因复杂，其潜在的信号通路和调控机制尚未充分阐明。

现有疗法的观察结果表明，右心室功能的改善与后负荷降低密切相关，提示肺血管系统应作为主要治疗靶点³。这说明目前的治疗方法对右心室功能的直接影响有限，即使肺血管阻力改善后，右心室功能仍可能恶化³。因此，亟需进一步研究如何在不依赖后负荷降低的情况下改善右心室功能。

稳健且可重复的动物模型在寻找新型治疗药物的过程中至关重要。在大多数慢性右心室（RV）衰竭模型中，其根本原因是肺血管结构改变所引起的肺动脉高压^4,5,6。已有充分表征的模型包括慢性低氧模型^7,8、Sugen-低氧模型^9<....

方案

本研究经丹麦动物实验监察局批准（授权编号：2021-15-0201-00928），并严格遵守丹麦国家实验动物相关法律法规进行。本研究使用了5周龄的雄性C57BL/6N小鼠。

1. 插管和手术器械的定制（图1）

注意：本节详细说明了如何使用廉价且易于获取的材料制备用于插管和经皮气管切开术（PTB）手术的定制器械的最重要步骤。

1. 准备气管插管（图1A）。
   常见的静脉（IV）导管可用于小鼠的插管和通气。
   1. 根据小鼠体型选择合适尺寸的血管内导管。建议5周龄小鼠（17–20 g）使用22G导管，较大体型小鼠（>20 g）使用20G导管。
   2. 抽出针芯并解除锁定装置。将针芯重新插入导管，并从导管尖端起约2 mm处以45°角斜向剪断针尖。
   3. 使用砂纸将针尖磨钝，以避免损伤小鼠声带。
   4. 剪除导管一侧的翼片，以便插管时获得更好的视野。
2. 准备胸腔牵开器（图1B）。
   1. 使用持针器将一段长约10 cm的柔性金属丝从中部弯成....

结果

将C57BL/6N小鼠（雄性，5周龄，17–20 g）随机分为重度肺动脉缩窄（sPTB，250 µm，n = 12）、轻度肺动脉缩窄（mPTB，450 µm，n = 9）或假手术组（sham，n = 15）。术后1周和3周通过超声心动图评估心脏功能。术后3周进行右心导管检查，随后实施安乐死。称量器官重量，并制备心脏组织用于组织学分析。

术后1周的超声心动图显示，与轻度PTB组和假手术组相比，重度PTB组出现右心室（RV）压力升高和右心室功能障碍的征象。右心室功能障碍表现为心输出量（CO）和三尖瓣环平面收缩偏移（TAPSE）降低（图6A、B）。左心室偏心性指数（LVEI）降低提示右心室压力升高（图6C）。因此，在重度PTB模型中，可能在术后1周即可开始评估逆转干预的效果。轻度PTB组术后1周与假手术组相比，超声心动图显示右心室压力升高（LVEI降低），但未见右心室功能障碍的征象（图6

讨论

本文介绍了一种由压力超负荷诱导的小鼠右心室肥厚与衰竭的动物模型。我们证明了以下几点：（i）在幼年小鼠中进行肺动脉缩窄术（PTB）可诱导不同程度的右心室病理改变，范围从轻度右心室肥厚到伴有失代偿性心外表现及经组织学证实的右心室纤维化的右心室衰竭。（ii）通过超声心动图可在PTB手术后1 周和3 周观察并量化右心室功能障碍的征象。（iii）右心室肥厚的程度与PTB的严重程度及其引起的右心室压力升高呈正比。该模型有助于阐明继发于右心室压力超负荷的右心室衰竭的发病机制，因为我们发现PTB模型适用于研究右心室病理改变的不同阶段。

为确保小鼠PTB模型的成功建立及可重复性，需特别注意以下步骤。（i）选择合适的结扎夹直径。合适的夹子直径取决于多个因素，如期望的右心室压力负荷程度和术后随访时间。小鼠的年龄和体重也是需要考虑的重要因素。因此，可根据当前的科学问题对实验方案进行相应调整。为此，我们建议在术后相关时间点进行预实验手术及超声心动图检查，以评估所选结扎夹直径的适用性。（ii）精确调节结扎夹施夹器对于确保病理结果的可重复性至关重要。我们建议使用外径明确的金属丝或套管作为参考.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Biosyn 6-0，单丝可吸收缝线	Covidien	UM-986
钝头套管针，27G 0.4×0.25，	Sterican	292832
Bupaq Multidose vet 0.3 mg/ml（丁丙诺啡）	Salfarm Danmark	VNR 472318
C57BL/6NTac 小鼠	Taconic Biosciences	C57BL/6NTac
Dagrofil 1，编织不可吸收缝线	B Braun	C0842273
脱毛膏	Veet	3132000
消毒棉签（82% 乙醇 + 0.5% 氯己定）	Mediq	3340122
一次性手术刀片，11号	Swann-Morton	11708353
Dräger Vapor 2000 七氟烷	Dräger	M35054
中性眼药膏，"Ophta"	Actavis	MTnr.: 07586 Vnr: 53 96 68
Horizon 结扎夹	Teleflex Medical	5200 (IPN914931)
Horizon 开放式结扎夹施夹器，弯型，6"（15 cm）	Teleflex Medical	537061
厨房纸巾架	n.a.	n.a.
不同粗细的金属丝	n.a.	n.a.
显微外科器械套装	Thompson	n.a.
MiniVent 呼吸机	Hugo Sachs	型号 845
MS505S 传感器	Visual Sonics	n.a.
Rimadyl Bovis vet. 50 mg/ml（卡洛芬）	Zoetis	MTnr: 34547, Vnr: 10 27 99,
Baxter 七氟烷 100%	Baxter Medical	MTnr: 35015
硅胶管	n.a.	n.a.
软质塑料片	n.a.	n.a.
体视显微镜，"Opmi Pico"	Carl Zeiss Surgicals GmbH	n.a.
超声探头支架/导轨	Visual Sonics	11277
加热板	Visual Sonics	11437
Venflon ProSafety，22G，0.9 × 25 mm	Becton Dickinson	393222