通过肺动脉干缩窄建立压力超负荷诱导的小鼠右心室肥厚与衰竭模型

摘要

我们描述了一种通过肺动脉干缩窄诱导右心室压力超负荷的小鼠模型。本文包含了气管插管、手术操作以及通过超声心动图进行表型分析的详细实验方案。气管插管和手术过程中使用了自制的器械，可实现模型的快速建立且成本低廉。

摘要

由压力超负荷引起右心室（RV）衰竭与多种心血管和肺部疾病的发病率及死亡率密切相关。右心室衰竭的发病机制复杂，目前仍未被充分理解。为了寻找治疗右心室衰竭的新策略，必须依赖可靠且可重复的动物模型。肺动脉干缩窄（PTB）模型因其能够在不受肺血管床变化干扰的情况下独立评估右心室功能，而日益受到关注。

本文介绍了一种通过肺动脉缩窄术（PTB）在5周龄小鼠中建立的右心室压力超负荷的小鼠模型。该模型可用于诱导不同程度的右心室病理改变，范围从轻度右心室肥厚到失代偿性右心室衰竭。文中包含了气管插管、PTB手术以及通过超声心动图进行表型分析的详细实验方案。此外，还提供了气管插管和PTB手术所需器械的定制方法，有助于快速且低成本地复制PTB模型。

采用钛夹结扎环扎肺动脉干，确保肺动脉干缩窄程度具有高度可重复性且不受操作者影响。根据不同的结扎夹内径对肺动脉缩窄（PTB）的严重程度进行分级（轻度：450 µm；重度：250 µm）。由此产生的右心室（RV）病理变化范围从伴有右心室功能保留的肥厚，到表现为心输出量降低及心外表现的失代偿性右心室衰竭。术后1周和3周通过超声心动图评估右心室功能。本文展示了超声心动图图像及结果示例。此外，还展示了右心导管检查以及心脏组织的组织学分析结果。

引言

右心室（RV）衰竭是一种临床综合征，由右心室功能障碍引起，表现为心力衰竭症状和体循环淤血体征¹。右心室功能障碍与多种心血管和肺部疾病的发病率及死亡率密切相关²。右心室功能障碍的病因复杂，其潜在的信号通路和调控机制尚未充分阐明。

现有疗法的观察结果表明，右心室功能的改善与后负荷降低密切相关，提示肺血管系统应作为主要治疗靶点³。这说明目前的治疗方法对右心室功能的直接影响有限，即使肺血管阻力改善后，右心室功能仍可能恶化³。因此，亟需进一步研究如何在不依赖后负荷降低的情况下改善右心室功能。

稳健且可重复的动物模型在寻找新型治疗药物的过程中至关重要。在大多数慢性右心室（RV）衰竭模型中，其根本原因是肺血管结构改变所引起的肺动脉高压^4,5,6。已有充分表征的模型包括慢性低氧模型^7,8、Sugen-低氧模型^9,10,11以及野百合碱模型^12,13。由于这些模型中的右心室衰竭继发于肺动脉高压，因此无法区分干预措施对肺血管系统的作用与对右心室的直接作用⁶。

为独立研究右心室功能而不受肺血管系统影响，肺动脉干缩窄（PTB）模型已得到广泛应用，并已在多种动物物种中建立，包括小鼠、大鼠、兔子、狗、绵羊和猪。^{6,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}在肺动脉高压（PTB）模型中，通过手术缩窄肺动脉干，导致右心室压力升高⁶应用PTB的方法有多种，包括使用结扎线或金属结扎夹对血管进行结扎缩窄^18,28在使用结扎线的模型中，肺动脉干被结扎在一根针上，随后将针抽出，使结扎线保留在原位，从而造成狭窄。 取决于针的尺寸和结的张力的血管部分^18,29在使用金属结扎夹的模型中，肺动脉干缩窄的程度可能更具可重复性。采用改良的结扎夹施加器将结扎夹闭合至预设且恒定的直径，从而使该方法不受操作者影响，并减少与肺动脉缩窄相关的疾病表型变异。^15,27,28.

已有研究表明，小鼠PTB模型可诱导右心室肥厚和功能衰竭^18,28。使用PTB模型时面临的一个主要挑战是选择合适的PTB直径，以达到预期的右心室病理程度。当试图建立失代偿性右心室衰竭模型时，这一挑战尤为突出。为此，缩窄程度需足够严重以诱导慢性右心室衰竭，但又不能过重而导致术后急性右心室衰竭和早期死亡⁶。解决这一难题的一种方法是使用断奶期或幼年动物^6,15。已有研究成功利用Wistar大鼠断奶幼鼠建立PTB模型，用于研究右心室衰竭的不同阶段^15,30。在该模型中，具有持续生长潜力的幼年大鼠接受PTB手术，并使用钛夹进行结扎。随着大鼠的生长，肺动脉狭窄逐渐加重，最终导致右心室肥厚或慢性右心室衰竭，具体表现取决于PTB的严重程度^15,30。受此模型启发，我们假设在幼年小鼠中建立PTB模型也可产生不同阶段的右心室病理改变。研究从轻度至重度的广泛右心室病理谱，可能有助于阐明疾病进展过程以及从右心室肥厚向右心室衰竭转变的机制。

本文介绍了一种通过幼年小鼠肺动脉瓣狭窄（PTB）诱导右心室压力超负荷的小鼠模型。利用该模型可产生不同程度的右心室病理变化，范围从右心室肥厚至失代偿性右心室衰竭。本研究包含了气管插管、PTB手术以及通过超声心动图进行表型分析的详细实验方案。

方案

本研究经丹麦动物实验监察局批准（授权编号：2021-15-0201-00928），并严格遵守国家实验动物相关法律法规进行。本研究使用了5周龄的雄性C57BL/6N小鼠。

1. 插管和手术器械的定制（图1）

注意：本节详细说明了如何使用廉价且易于获取的材料制备用于插管和胸腔手术的定制器械的最重要步骤。

1. 准备气管插管（图1A）。
   常见的静脉（IV）导管可用于小鼠的插管和通气。
   1. 根据小鼠体型选择合适尺寸的血管内导管。建议对5周龄小鼠（17–20 g）使用22G导管，对较大体型小鼠（>20 g）使用20G导管。
   2. 抽出针芯并解除锁定装置。将针重新插入导管，并从导管尖端起约2 mm处以45°角斜向剪断针尖。
   3. 使用砂纸将针尖磨钝，以防止损伤小鼠声带。
   4. 剪除导管一侧的翼片，以便在插管过程中获得更好的视野。
2. 准备胸廓牵开器（图1B）。
   1. 使用持针器将一段长约10 cm的柔性金属丝从中部弯成约30°角。
   2. 使用持针器小心地在金属丝两端制作宽度为5 mm的无创钩状结构。
3. 准备插管支架（图1C）。
   注：使用插管支架可在插管过程中通过鼻管持续输送麻醉气体。这可在直视下实现可控且安全的插管，降低声带和气管损伤以及导管误入食管的风险。任何金属或塑料框架均可作为插管支架的基座。本研究中使用了略微弯曲的厨房用卷纸架。
   1. 截取一段长约3 cm、适合小鼠吻部的橡胶管，并将其连接至静脉导管阀门。可在插管前通过该阀门连接吸入性麻醉装置。
   2. 用一段约5 mm长的1-0编织缝线在管口附近打一个环。该环用于固定小鼠吻部于管内。
   3. 在柔性塑料板顶部附近打一个孔，并将管插入孔中。该塑料板用于支撑小鼠在插管支架中的体位。
   4. 如图1C所示，使用胶带将各部件固定在一起。
4. 准备引导套管（图1D、E）。
   1. 将6-0单股缝线穿过一个钝头27G套管，并在缝线上打结。该结将在PTB手术中用于抓取缝线。
   2. 使用持针器将套管尖端弯成80°角。
5. 准备结扎夹施加器。
   ​注：对带有角度钳口的结扎夹施加器进行改装，加装可调节限位装置（图1F），当钳口达到预设精确间距时，该装置可停止结扎夹的进一步压缩。改装后的结扎夹施加器用于将钛合金结扎夹施加于肺动脉干。
   1. 用两枚螺钉将定制尺寸的黄铜部件固定在结扎夹施加器的手柄上。在中心位置安装一个可调节螺钉（图1F，白色箭头），用于精确控制施加器手柄压缩后的间距，从而对应钳口之间的精确距离。

图 1：插管和PTB手术所用器械。 （A）由静脉导管制成的气管内插管。（B）胸腔牵开器。（C）插管支架以及置于插管支架中、通过鼻管接受麻醉的小鼠。（D）用于PTB手术的外科器械及改良结扎夹施加器。（E）导向套管。（F）自制可调节止动装置。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 结扎夹施加器的调节

1. 根据所需右心室（RV）衰竭的严重程度选择结扎夹的内径。对于5周龄的雄性C57BL/6N小鼠（17–20 g），诱导重度右心室压力超负荷时使用内径为250 µm的夹子，诱导轻度压力超负荷时使用内径为450 µm的夹子。使用中间内径的夹子可诱导中度压力超负荷。
2. 使用金属丝或针调节结扎夹施加器。确保金属丝的直径与目标夹子的内径一致。
3. 将结扎夹装入施加器，并将校准金属丝置于结扎夹中央。在压缩施加器的同时，旋转螺钉，直至夹子的钳口紧密贴合金属丝。松开施加器后，应确保夹子仍稳固地固定在校准金属丝上。
4. 完成施加器调节后，将另一个结扎夹置于校准金属丝上，以验证设定的直径是否准确。

3. 手术前准备

1. 在诱导室中使用7%七氟烷（氧气流速为0.6 L/min，100%氧气）诱导麻醉。在插管前通过夹捏脚趾确认麻醉深度是否足够。
   注意：也可使用异氟烷，但需注意使用不同的浓度。
2. 使用22G静脉留置针为小鼠进行气管插管。在手术显微镜和插管支架的辅助下进行可视化插管操作，以准确定位声带，并通过鼻导管持续输送吸入性麻醉剂（图1C）。
3. 以每分钟175次呼吸频率、每次潮气量300 µL进行机械通气。
   注意：推荐的潮气量也可为8–10 µL/g，理想的潮气量取决于通气系统中可能存在的泄漏和死腔。
4. 将已插管的小鼠置于覆盖有保温垫（37 °C）的平台上，并在小鼠眼部涂抹保湿眼膏。
5. 维持麻醉（3.5%七氟烷，氧气流速为0.6 L/min，100%氧气），并皮下注射0.1 mg/kg布托啡诺和5 mg/kg卡洛芬以提供围手术期镇痛。使用脱毛膏去除胸部所有毛发。脱毛膏停留时间不得超过60秒，以防皮肤刺激，随后使用消毒湿巾对皮肤进行消毒。

4. 跗骨间关节融合术（PTB 手术）

1. 从胸骨角至左侧腋前线，在第二肋间隙上方的皮肤做一10 mm切口。通过钝性分离切开胸大肌和胸小肌。
2. 切开第二肋间隙的肋间肌，并钝性分离胸腺以暴露心脏、肺动脉干和主动脉。将胸腔牵开器置于肋间隙内，以保持术野开放。
   注意：切开肋间肌时必须格外小心，因为左内乳动脉位于胸骨外侧仅1-2 mm处。损伤该动脉可能导致大量出血。
3. 使用显微镊子钝性去除血管间的结缔组织，将肺动脉干与升主动脉分离。通过将小鼠下半身旋转（左腿置于右腿之上）进一步改善肺动脉干的暴露。
4. 将引导套管经肺动脉干后方穿过横窦。用镊子夹住引导套管尖端的结，并将缝线拉过引导套管。在缝线保持环绕肺动脉干的同时，小心移除引导套管。
5. 装入结扎夹施加器，并利用缝线引导肺动脉干进入结扎夹的钳口中，然后压紧结扎夹。放置结扎夹后立即松开缝线，并观察肺动脉干的充盈情况。
   注意：应用结扎夹后的最初几秒内可能出现心动过缓。
6. 用6-0单丝可吸收缝线环绕第二和第三肋骨，关闭肋间隙。在收紧缝线的同时轻压胸部，尽可能排出胸腔内的空气。
7. 最后，用6-0单丝可吸收缝线缝合皮肤。
8. 假手术组执行相同操作，但不放置结扎夹（步骤4.5）。
9. 为确保充分的术后镇痛，将丁丙诺啡（7.5 mg/L）加入饮用水中，并在术后前三天每天皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）。监测饮水量以确保摄入充足。

5. 超声心动图

1. 将小鼠置于诱导室中进行麻醉诱导（1-2 分钟，100% 氧气中含 6% 七氟烷），随后通过鼻管维持麻醉（100% 氧气中含 3.5% 七氟烷）。使用脱毛膏去除胸部和腹部的毛发，并将小鼠置于加热垫上。在眼睛上涂抹保湿眼膏，并在小鼠胸部涂抹超声耦合剂。
   注意：二维增益、聚焦深度 和 图像深度 应根据需要调整，以提高所有超声心动图测量的图像质量。
2. 调整超声探头以获得胸骨旁长轴（PLAX）切面（图 2）。在 PLAX 切面中，测量肺动脉干的内径及速度时间积分（VTI）。
   1. 选择 B 模式，并仔细在 x、y 和 z 轴方向移动加热垫，使肺动脉干位于图像中央。使用 彩色多普勒 确定肺动脉干的最大直径。使用 动态存储 功能采集一段图像序列，用于测量肺动脉干直径。
   2. 选择 彩色多普勒 和 脉冲波（PW）多普勒，并将取样线光标置于肺动脉干中央。调整 PW 角度，使虚线与血管内血流方向平行。
   3. 按下 动态存储 以测量 VTI。将光标靠近肺动脉干两侧管壁，再次按下 动态存储 以获取靠近管壁处的血流信号。
      注意：右心室（RV）内径和右心室游离壁厚度也可在 PLAX 切面中进行评估。
3. 获取胸骨旁短轴（PSAX）切面（图 3），用于测量左心室（LV）内径，该参数可用于评估室间隔膨出（D 型改变）。
   1. 选择 B 模式，将探头逆时针旋转 90°，并向外侧倾斜 20-30 度，以避免胸骨遮挡右心室；再向头侧倾斜 20-30 度，直至左心室尽可能呈圆形。随后沿头尾方向滑动探头，找到乳头肌水平、心室直径最大的位置，并按下 动态存储。
      注意：乳头肌水平的 PSAX 切面也可用于评估右心室面积变化分数。主动脉瓣水平的 PSAX 切面可用于测量右心室缩短分数或右心室游离壁厚度。
4. 使用心尖四腔（A4CH）切面（图 4）测量三尖瓣环收缩期位移（TAPSE），并评估三尖瓣反流情况。
   1. 将探头按 图 4 所示位置放置。确定心脏位置后，仅用手腕和手指进行微调，以清晰显示心脏的四个腔室及三尖瓣。
      1. 识别并维持良好的 A4CH 切面具有一定难度。操作探头的手可 resting 在加热垫上以保持稳定。轻微滑动、倾斜和旋转探头，直至获得理想图像。
      2. 每次仅在一个维度上移动探头：例如，先沿头尾方向滑动以定位心脏，再倾斜探头以显示全部四个腔室，最后旋转探头，使四个腔室和三尖瓣均位于图像视野内。如有必要，在获得理想图像前可重复上述三个步骤多次。
   2. 确定三尖瓣位置后，选择 M 模式，并将虚线置于游离壁侧的三尖瓣环处。按下 动态存储 保存测量数据。
   3. 选择 彩色多普勒 以评估三尖瓣是否存在反流。若存在反流，在收缩期可见从右心室向右心房（RA）的逆向血流束（图 5）。
      注意：在 A4CH 切面中，也可测量右心室游离壁组织多普勒及右心室流入道血流速度。

图 2：胸骨旁长轴切面（PLAX）。（A-D）超声探头的放置位置。（E， F）PLAX 切面下的正常小鼠心脏。（G， H）肺动脉瓣狭窄（PTB）后右心室扩张与肥厚。缩写：LV：左心室，RV：右心室，PV：肺动脉瓣，PT：肺动脉干，Ao：主动脉。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：胸骨旁短轴切面（PSAX）。（A-D）超声探头的位置。（E, F）PSAX切面下的正常小鼠心脏。（G, H）PTB术后PSAX切面。缩写：LV：左心室，RV：右心室，PM：乳头肌。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：心尖四腔心切面（A4CH）。（A-D）超声探头的位置摆放。（E， F）A4CH 切面下正常小鼠心脏图像。（G， H）PTB 术后右心室和右心房扩张。缩写：LV：左心室，RV：右心室，RA：右心房，LA：左心房。请点击此处查看该图的高清版本。

图 5：通过四腔心切面（A4CH）彩色多普勒显示的三尖瓣反流。（A）在舒张期，可见从右心房（RA）流向右心室（RV）的血流（箭头所示）。（B）在收缩期，可见从右心室（RV）流向右心房（RA）的一束细小射流（箭头所示）。缩写：LV：左心室，RV：右心室，RA：右心房，LA：左心房。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 数据分析

1. 在胸骨旁长轴切面（PLAX）中测量三个心动周期的肺动脉干直径，并取平均肺动脉干直径用于后续数据分析。在PLAX切面中，对三个储存的动态图像序列（分别位于肺动脉干中心及靠近血管壁处）各测量三个心动周期的血流速度-时间积分（VTI），取所有VTI测量值的平均值用于进一步分析。使用以下公式计算心输出量（CO）：
   
   ：肺动脉干半径，HR：心率
2. 在乳头肌水平的短轴切面（PSAX）测量左心室舒张末期内径指数（LVEI）。使用测量工具测量从室间隔中部至游离壁的最大左心室内径（LVid₁），然后测量与第一次测量垂直方向的左心室内径（LVid₂）。在三个心动周期中重复上述测量，利用平均左心室内径及以下公式计算LVEI：
   
3. 在四腔心切面（A4CH）中测量三个心动周期的三尖瓣环收缩期位移（TAPSE），取平均TAPSE用于后续数据分析。

7. 右心导管检查

1. 在PTB手术后3周，使用1.4F微型导管经右心导管术测量右心室（RV）压力和容积。
2. 按照步骤3.1–3.4所述方法麻醉并气管插管小鼠。将小鼠置于覆盖加热垫（37 °C）上，并以3.5%七氟烷（在0.6 L/min纯氧中）维持麻醉状态。
3. 给予2000 IU肝素（肌肉注射[i.m.]）和0.5 mL氯化钠溶液（皮下注射[s.c.]）。
4. 使用手术剪刀在剑突稍尾侧剪开腹壁，并沿胸壁切口小心剪开膈肌以进入胸腔。继续剪开膈肌和肋骨，直至充分暴露心脏。
5. 在下腔静脉周围放置结扎线。此结扎线用于在后续记录压力-容积数据时阻断血管，以降低前负荷。
6. 使用26G针头在右心室壁上小心穿刺一个小孔。确保穿刺位置尽可能靠近心尖，且针头不完全穿透心室，仅作为导电导管插入的引导。若发生出血，可用小棉签轻压止血，以尽量减少失血。
7. 识别心室壁上的小孔，并通过穿刺组织插入导管。
   注意：插入导管时，应小心避免损伤心室内壁。
8. 导管插入后，右心室压力（RVP）常在数分钟内发生变化。需等待RVP稳定后，再获取具有代表性的稳态测量值。
9. 为获得压力-容积环，使用先前放置于下腔静脉周围的结扎线。轻柔牵拉结扎线以阻断血管，从而逐步降低前负荷。
10. 记录到具有代表性的压力-容积环后，拔出导管，并通过心脏切除法处死小鼠。此时采集血液和组织样本用于进一步分析。

结果

将C57BL/6N小鼠（雄性，5周龄，17–20 g）随机分为重度肺动脉缩窄（sPTB，250 µm，n = 12）、轻度肺动脉缩窄（mPTB，450 µm，n = 9）或假手术组（sham，n = 15）。术后1周和3周通过超声心动图评估心脏功能。术后3周进行右心导管检查，随后实施安乐死。称量各器官重量，并制备心脏组织用于组织学分析。

术后1周的超声心动图显示，与轻度PTB组和假手术组相比，重度PTB组出现右心室（RV）压力升高和右心室功能障碍的征象。右心室功能障碍表现为心输出量（CO）和三尖瓣环收缩期位移（TAPSE）降低（图6A、B）。左心室偏心性指数（LVEI）降低提示右心室压力升高（图6C）。因此，在重度PTB模型中，可在术后1周即开始评估逆转干预的效果。轻度PTB组术后1周与假手术组相比，超声心动图显示右心室压力升高（LVEI降低），但未见右心室功能障碍的征象（图6）。

图6：术后1周的超声心动图测量结果。（A）心输出量（CO）。（B）三尖瓣环收缩期位移（TAPSE）。（C）左心室偏心指数（LVEI）。缩写：mPTB：轻度肺动脉干缩窄（PTB）；sPTB：重度PTB。数据以散点图表示，误差线代表均值±标准差。*p < 0.05，**p < 0.001。 请点击此处查看该图的放大版本。

术后3周，sPTB组的PTB手术效应更加明显，与假手术组相比，心输出量进一步降低，TAPSE持续下降（图7A，B）。术后3周，mPTB组与假手术组之间的超声心动图参数未见显著差异（图7A，B）。

右心导管检查显示，与假手术组相比，两种PTB组在术后3周时右心室收缩压（RVSP）均升高（图7C）。sPTB组的右心室舒张功能受到影响，表现为右心室舒张末期顺应性（Eed）增加，这是反映右心室僵硬度的负荷无关性指标（图7D）。与假手术组相比，sPTB组的右心室收缩功能（以收缩末期弹性模量Ees评估）也升高，而mPTB组则表现为无统计学意义的升高（图7E）。

解剖学测量显示，随着肺动脉分支结扎（PTB）严重程度的增加，右心室肥厚（RV hypertrophy）逐渐加重，表现为右心室重量与体重比值（RV/BW）呈逐步升高趋势（图7F）。右心室收缩压（RVSP）与右心室肥厚程度呈线性正相关（图7G）。右心室心肌细胞横截面积（CSA）分析证实，与假手术组（sham）相比，重度PTB（sPTB）组右心室肥厚增加了40%，而中度PTB（mPTB）组与假手术组相比无显著增加（图8A-D）。与假手术组相比，sPTB组右心室和右心房（RA）的纤维化程度高出七倍。mPTB组未观察到右心室纤维化的增加（图8E-H）。

在sPTB组中，术后1周观察到64%的三尖瓣反流（TR），3周时升至91%，而在假手术组和mPTB组中未发现三尖瓣反流（数据未显示）。sPTB组出现不同程度的肝脏变色，提示存在心外失代偿（图9）；mPTB组和假手术组则未见变色现象。

总之，我们揭示了条带直径与疾病严重程度之间的相关性。mPTB 组模拟了早期疾病阶段，表现为轻度右心室肥厚但无右心室功能障碍；而 sPTB 组则表现出右心室功能障碍和衰竭的迹象。

图 7：术后 3 周的超声心动图、有创压力-容积及解剖学测量结果。 （A）心输出量（CO）。（B）三尖瓣环平面收缩期位移（TAPSE）。（C）右心室收缩压（RVSP）。（D）舒张末期弹性（Eed）。（E）收缩末期弹性（Ees）。（F）右心室重量与体重的比值（RV/BW）。（G）术后 3 周时右心室收缩压（RVSP）与 RV/BW 比值之间的相关性。图中显示了线性回归分析结果。校正后 R² = 0.75，p < 0.001。缩写：mPTB：轻度肺动脉干缩窄（PTB）；sPTB：重度 PTB。正态分布数据以均值 ± 标准差的散点图表示；非正态分布数据以箱形图表示，其中心线代表中位数，箱体范围为四分位距（IQR），须线表示距离第一四分位数（Q1）和第三四分位数（Q3）1.5 倍 IQR 范围内的数值。*p < 0.05，**p < 0.001。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8：右心室组织的组织学分析。（A）右心室横截面积。（B-D）HE染色的右心室组织，分别来自（B）假手术组、（C）中度肺动脉缩窄组（mPTB）和（D）重度肺动脉缩窄组（sPTB）。（E）右心室组织中相对于健康组织的间质纤维化百分比。（F-H）Picrosirius红染色的右心室组织，分别来自（F）假手术组、（G）mPTB组和（H）sPTB组。比例尺：（B-D）= 50 µm，（F-H）= 250 µm。数据以箱形图表示，中位数、四分位距（IQR）以及须线分别代表距离第一四分位数（Q1）和第三四分位数（Q3）1.5 × IQR范围内的数值。*p < 0.05，**p < 0.001。请点击此处查看该图的放大版本。

图 9：不同程度的肝脏变色。 变色程度评分为 0–3 分，评分依据为肝脏组织斑点样外观的程度及颜色。图片通过显微镜拍摄，因此组织颜色比在环境光线下显得更浅。(A) 0 分：正常肝脏；(B) 1 分：轻度斑点，无变色；(C) 2 分：中度斑点和轻度变色；(D) 3 分：严重斑点和变色（槟榔肝）。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种由压力超负荷诱导的小鼠右心室肥厚与衰竭的动物模型。我们证明了以下几点：（i）在幼年小鼠中进行肺动脉缩窄术（PTB）可诱导不同程度的右心室病理改变，范围从轻度右心室肥厚到伴有失代偿性心外表现及经组织学证实的右心室纤维化的右心室衰竭。（ii）通过超声心动图可在PTB手术后1 周和3 周观察并量化右心室功能障碍的征象。（iii）右心室肥厚的程度与PTB的严重程度及其引起的右心室压力升高呈正比。该模型有助于阐明继发于右心室压力超负荷的右心室衰竭的发病机制，因为我们发现PTB模型适用于研究右心室病理改变的不同阶段。

为确保小鼠PTB模型的成功建立及可重复性，需特别注意以下步骤。（i）选择合适的结扎夹直径。合适的夹子直径取决于多个因素，如期望的右心室压力负荷程度和术后随访时间。小鼠的年龄和体重也是需要考虑的重要因素。因此，可根据当前的科学问题对实验方案进行相应调整。为此，我们建议在术后相关时间点进行预实验手术及超声心动图检查，以评估所选结扎夹直径的适用性。（ii）精确调节结扎夹施夹器对于确保病理结果的可重复性至关重要。我们建议使用外径明确的金属丝或套管作为参考，以校准结扎夹施夹器。（iii）术中出血是PTB手术期间最常见的严重并发症，也是围手术期和术后死亡的主要原因。为减少出血，应尽可能使用钝头显微外科器械和钝性分离技术。仅在实验方案明确要求时使用手术剪。（iv）围手术期死亡的另一原因是心律失常。在肺动脉干分离及结扎夹放置过程中，可能出现短暂的 bradycardia（心动过缓）。为降低心脏骤停风险，应尽量缩短对肺动脉干的操作时间。一旦观察到心动过缓，应暂停对肺动脉干的操作，直至心率恢复正常。（v）超声心动图评估的可重复性可能具有挑战性，需经过训练才能获得可重复的结果。由于右心室体积较小，在假手术小鼠中通过PLAX和A4CH切面清晰显示右心室尤其困难。（vi）超声心动图检测过程中心率可能显著波动。为减少变异，应密切监测心率，并在确保足够麻醉深度的前提下使用低剂量麻醉剂。

小鼠肺动脉缩窄（PTB）模型的一个局限性在于需要使用手术器械并具备相应的操作技能。应始终通过预实验手术进行培训，并根据本地可用的设备对方法进行调整。我们使用了钛夹结扎法，该方法已被证明在诱导右心室压力超负荷方面具有高度可重复性¹⁵。此外，与手术缝线结扎相比，使用结扎夹可显著降低围手术期死亡率，并改善术后恢复情况³¹。

评估右心室（RV）功能的超声心动图存在一些局限性，因其结果依赖于操作者，且不同操作者之间以及同一操作者在不同时间的操作差异可能影响超声心动图的结果。在本研究中，超声心动图由两名操作者完成。为避免观察者间变异带来的偏倚，两名操作者对各组小鼠均进行了数量相等的检测。此外，小鼠超声心动图本身也存在技术挑战，尤其在体型较小且相对健康的小鼠中更为明显，这一点从第1周时较大的心输出量（CO）和三尖瓣环收缩期位移（TAPSE）测量变异（图5）相较于第3周（图6）更为显著即可得到印证。为获得更准确的CO测量值，我们在肺动脉干的三个不同位置（肺动脉干中心及靠近血管壁处）分别测量了肺动脉干内的速度-时间积分（VTI），并取三个心动周期的平均值。此外，已有研究表明，在接受肺动脉缩窄（PTB）处理的大鼠中，超声心动图测得的CO值较磁共振成像（MRI）存在高估现象³²。MRI是测量小鼠CO的金标准，因此在使用本模型时可考虑采用MRI³²。另一个挑战在于，对于右心室压力无明显升高的小鼠，其右心室体积较小，难以获得理想的四腔心切面（A4CH视图），从而影响如TAPSE等参数的测量。这可能导致假手术组和轻度PTB组部分小鼠的TAPSE值被低估。尽管存在上述技术挑战，重度PTB组与假手术组及轻度PTB组相比，CO和TAPSE仍达到了统计学显著性差异。这表明在本模型中，CO和TAPSE是评估右心室功能的有用指标，但也凸显了在开展小鼠超声心动图评估前对研究人员进行充分培训的必要性。

所有动物模型的一个固有局限性是，由于遗传和生理差异，研究结果无法直接外推至人类。

据我们所知，这是唯一一种在幼年小鼠中建立的肺动脉缩窄（PTB）模型。该方法此前已在大鼠中应用，随着大鼠的生长，后负荷逐渐缓慢增加。这种较慢的疾病诱导过程更能模拟慢性右心室衰竭的发展过程¹⁵。

本方案包含两组小鼠，其右心室功能障碍程度不同。据我们所知，目前尚无其他已发表的小鼠PTB模型包含仅表现为轻度右心室肥厚而无右心室功能障碍、血流动力学损害或纤维化迹象的组别。这一疾病早期阶段因此在很大程度上被忽视。研究该疾病发展的早期阶段，可能有助于加深我们对慢性肺动脉高压患者中从右心室肥厚逐步进展为右心室衰竭过程的理解¹⁷。

在此模型中，慢性右心室衰竭的病理变化在术后3周内出现，使其成为最省时的慢性右心室衰竭模型之一⁶。其他小鼠肺动脉缩窄（PTB）模型的研究周期为1 至8 周^{17,18,33,34,35}。我们在sPTB术后1周即观察到右心室功能障碍的迹象。然而，这种仅3周随访时间的高效方法也存在局限性。小鼠在8周龄时尚未完全发育成熟，更长的随访时间可能导致肺动脉干狭窄程度逐渐加重，进而引发更为严重的右心室衰竭。

转基因小鼠容易获得，且新的转基因品系在小鼠中可相对较快且高效地构建³⁶。与使用大鼠或其他大型哺乳动物的模型相比，这是小鼠创伤性脑损伤模型的主要优势。

综上所述，我们建立了一种可重复的幼年小鼠压力超负荷诱导的右心室肥厚及右心室衰竭模型。本文包含了气管插管、手术操作以及通过超声心动图进行表型分析的详细实验方案。气管插管和手术过程中使用了自制的器械，使该模型能够快速且低成本地复制。该模型可用于研究右心室在压力超负荷条件下适应性反应的调控机制，以及最终导致右心室衰竭的病理过程。此外，该模型还可用于评估治疗右心室衰竭的新靶点的有效性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Biosyn 6-0，单丝可吸收缝线	Covidien	UM-986
钝头套管针，27G 0.4×0.25，	Sterican	292832
Bupaq Multidose vet 0.3 mg/ml（丁丙诺啡）	Salfarm Danmark	VNR 472318
C57BL/6NTac 小鼠	Taconic Biosciences	C57BL/6NTac
Dagrofil 1，编织不可吸收缝线	B Braun	C0842273
脱毛膏	Veet	3132000
消毒棉签（82% 乙醇 + 0.5% 氯己定）	Mediq	3340122
一次性手术刀片，11号	Swann-Morton	11708353
Dräger Vapor 2000 七氟烷	Dräger	M35054
中性眼药膏，"Ophta"	Actavis	MTnr.: 07586 Vnr: 53 96 68
Horizon 结扎夹	Teleflex Medical	5200 (IPN914931)
Horizon 开放式结扎夹施夹器，弯型，6"（15 cm）	Teleflex Medical	537061
厨房纸巾架	n.a.	n.a.
不同粗细的金属丝	n.a.	n.a.
显微外科器械套装	Thompson	n.a.
MiniVent 呼吸机	Hugo Sachs	型号 845
MS505S 传感器	Visual Sonics	n.a.
Rimadyl Bovis vet. 50 mg/ml（卡洛芬）	Zoetis	MTnr: 34547, Vnr: 10 27 99,
Baxter 七氟烷 100%	Baxter Medical	MTnr: 35015
硅胶管	n.a.	n.a.
软质塑料片	n.a.	n.a.
体视显微镜，"Opmi Pico"	Carl Zeiss Surgicals GmbH	n.a.
超声探头支架/导轨	Visual Sonics	11277
加热板	Visual Sonics	11437
Venflon ProSafety，22G，0.9 × 25 mm	Becton Dickinson	393222