通过过滤水样粪便细菌的分离

膜过滤和随后对收集的细菌进行培养是评估水源质量和清洁度的有用技术。

由于水传播疾病爆发的可能性，用于农业、娱乐或家庭环境的水质非常重要。如果水被动物或人类的粪便污染，那么致病性寄生虫、细菌或病毒可能会在摄入后传播给新的宿主。因此，监测水源中是否存在此类致病生物对于确保公众健康至关重要。

水源中可能存在的粪口病原体的数量和种类之多，使得独立和定期地对每种病原体进行检测是不切实际的。相反，常见的水质微生物检测使用大肠菌群指示菌。有关此过程的更多信息，请参阅此集合中有关指示生物体的视频。

本视频将说明对环境水样进行膜过滤的过程，演示如何培养多种类型的粪便指示菌，包括总大肠菌群、粪大肠菌群和粪肠球菌，并介绍如何验证粪便污染的存在。

膜过滤技术利用负压将水样吸入过滤器并捕获细菌。该过滤器是一种专用膜，最小平均孔径为 0.45 μm，可捕获通常约为 1 μm 的细菌。过滤后，将膜涂在琼脂糖生长培养基上，并在适合培养目标微生物的条件下孵育。

该技术最适合于低浊度来源，如饮用水、游泳池或湖泊和水库。颗粒物含量高的水会导致过滤器结垢或堵塞，从而限制可处理的体积。此外，膜过滤对于含有大量背景或非大肠菌群（如未经处理的污水）的水源不切实际，因为这会增加在培养和孵育时计数目标大肠菌群的难度。

一旦细菌样品被捕获在过滤器中，就可以将它们转移到生长板中，以确定水样品中存在的指示菌类型。在不同的培养基类型上铺板可选择不同的细菌类型，并且可以进行快速鉴定。

在培养物特异性平板上生长后，可以使用诸如将菌落挑取到液体培养基中并使用 Durham 管捕获气体等技术进一步确认指示菌的身份，这些气体只能在粪大肠菌群或总大肠菌群存在下产生。此外，疑似粪肠球菌可通过革兰氏染色阳性和过氧化氢-过氧化氢酶试验阴性的组合来确认。

现在我们已经熟悉了水样膜过滤背后的原理，让我们来看看这个过程是如何进行的。

要开始该程序，首先从感兴趣的测试水源收集水样。确保将样品收集在无菌的 1 L 瓶中。采集完成后，将样品放在冰上，然后运送到实验室进行微生物分析。

要开始分析，首先对膜过滤歧管进行消毒。接下来，将歧管连接到真空泵和过滤含有漂白剂的废液瓶。

对镊子进行乙醇火焰灭菌，并从包装中取出无菌网格膜。将过滤器放在歧管膜过滤区域的中心，将无菌过滤漏斗套在装置上，然后固定到位。

量出所需体积的测试水进入漏斗。施加部分真空以将测试样品吸入过滤器。大于 0.45 μm 的悬浮固体材料（包括细菌和其他有机物）将被截留在过滤器上或过滤器内，而较小的颗粒、病毒和溶解的固体将进入装有漂白剂的废瓶。

样品通过过滤器后，用 25 mL 无菌水冲洗漏斗内部 3 次，使其通过过滤器。最后一次冲洗完成后，断开真空并从歧管中取出漏斗。

接下来，对镊子进行乙醇火焰灭菌，并立即从装置中取出膜过滤器。以滚动方式将其放置在适合目标微生物的生长板上，以确保与表面完全接触并避免捕获气泡。

对于每个后续样品的处理，请对不锈钢歧管进行消毒，并使用无菌漏斗以防止交叉污染。最后，将板放入培养箱中适当的孵育时间。

孵育期结束后，从培养箱中取出板进行计数。如果可能，使用冷白光源在低倍放大倍率下进行菌落计数。要测定总大肠菌群，请鉴定和计数呈粉红色至深红色的菌落，并且具有完全或部分覆盖菌落的金属表面光泽。非典型总大肠菌群菌落可能呈深红色、粘液状或无光泽的有核。

呈蓝色、白色、无色或粉红色且无光泽的菌落被视为非大肠菌群，不应包含在大肠菌群总数中。

粪大肠菌群菌落将显示为各种深浅不一的蓝色，这些应算作一个单独的类别。非粪便大肠菌群菌落通常为灰色至奶油色，也应单独记录。最后，粪便肠球菌菌落的颜色范围从粉红色到深红色，应单独计数。

为了验证总大肠菌群集落，将灭菌和冷却的接种环应用于单个目标菌落。将选定的菌落转移到装有月桂基胰蛋白酶肉汤和 Durham 管的玻璃容器中。接下来，将培养物放入培养箱中。Durham 管捕获的浊度和气体产生的存在验证了菌落是总大肠菌群。

对于粪大肠菌群验证，在无菌条件下将蓝色菌落转移到装有无菌 EC 培养基和 Durham 管的玻璃容器中。将接种的试管放入培养箱中。孵育后，浑浊接种物与气体产生一起确认菌落为粪大肠菌群。

为了确认粪肠球菌，将具有正确形态的可疑菌落无菌转移到 Brain-Heart Infusion 琼脂板上，并孵育。接下来，将生长物从 BHIA™ 上的孤立菌落转移到两个无菌载玻片上。

向其中一个载玻片中加入 2-3 滴 3% 过氧化氢。快速产生气体表明存在过氧化氢酶阳性细菌，例如柠檬酸杆菌。粪肠球菌过氧化氢酶阴性;因此，不会观察到冒泡。对于未显示气泡的过氧化氢酶阴性菌落，进行革兰氏染色。作为粪肠球菌，这些应该呈革兰氏阳性，呈卵形，并且主要成对或短链分组。

在水源中发现任何这些指示菌都表明存在污染。如果在一个月内发现超过 5% 的样品受到污染，则该来源可能被认为不适合人类食用。

膜过滤常用于许多生物应用，粪便指示生物也可以通过其他实验程序进行检测。此处探讨了其中一些应用程序。

膜过滤也可用于从水样中捕获病毒。由于病毒通常以非常低的水平存在，因此必须浓缩水样才能捕获它们进行分析。然后可以从过滤器中释放捕获的病毒，并使用细胞培养感染性测定或 PCR 等技术进行鉴定。

膜过滤还用于生产工业或实验室用的高纯水。许多行业的运营过程都需要高度纯净的水，而膜过滤可以去除污染物，包括水中不需要的溶解金属和盐。也可用于盐水的脱盐，生产饮用水。

您刚刚观看了 JoVE 关于通过膜过滤识别水中指示生物的介绍。您现在应该了解如何对水样进行膜过滤，如何从膜中培养几种类型的粪便指示菌，以及如何确认这些细菌是指示生物。感谢观看！