通过过滤法从水样中分离粪便细菌

1. 水样的采集与处理

1. 从测试水源处采集多个1-L水样（例如 喷泉、游泳池、水库、供水系统、原污水或处理后的污水），并置于冰上运送到实验室进行微生物分析。
2. 使用前，通过高压灭菌、紫外线照射（2 分钟）或乙醇火焰灼烧对膜过滤装置组件进行灭菌或消毒。
3. 所有部件冷却后，将 manifold 正确连接至真空泵和含漂白剂的真空过滤废液瓶。
4. 用乙醇火焰灭菌一对镊子，并用其从包装中取出一张无菌带网格的膜滤器。通常使用直径为47 mm、孔径为0.45 µm的膜。然而，只要孔径能够充分截留目标微生物，且滤膜至少70%的面积为孔隙区域，也可使用其他直径和孔径的滤膜。
5. 将滤膜置于多联过滤装置的膜过滤区域中央，然后将无菌滤杯安装到装置上并固定。
6. 量取所需体积的待测水样（例如 100 毫升）并加入漏斗中（漏斗上可见100毫升刻度线）。
7. 施加部分真空（压力差为34至51 kPa），以使测试样品通过滤膜。大于滤膜平均孔径0.45 µm的总悬浮固体物质，包括细菌和腐烂的有机物，将被截留在滤膜上。较小的颗粒，包括病毒以及溶解性固体（如少量有机物和盐类），将穿过膜进入含有漂白剂的废液收集真空瓶中。
8. 样品完全通过滤膜后，用两到三次20-30 mL的无菌水冲洗漏斗内壁。
9. 关闭最终冲洗后，关闭真空泵并从多联过滤装置上取下漏斗。
10. 使用经乙醇火焰灭菌的镊子，立即从装置中取出膜滤膜，并迅速将其转移至适用于目标微生物的生长琼脂培养基上（表1 列出了每种推荐的培养基和培养条件。
11. 以滚动方式将膜滤器贴附于琼脂糖表面，确保膜与培养基完全接触，并避免截留气泡。
12. 在处理每个样本之间，更换使用过的过滤漏斗为无菌单元，并用乙醇对不锈钢多通管进行消毒，以防止交叉污染。

2. 菌落计数

1. 孵育期结束后，将培养皿从培养箱中取出进行菌落计数。
2. 理想情况下，应在低倍显微镜下使用冷白光源进行菌落计数。
3. 总大肠菌群
   1. 总大肠菌群菌落通常呈粉红色至深红色，表面具有金属光泽。该光泽可能部分或完全覆盖菌落。非典型总大肠菌群菌落形态可能为深红色、黏液状或有核而无光泽。
   2. 呈粉红色、蓝色、白色或无色且无光泽的菌落被视为非大肠菌群。
4. 粪大肠菌群
   1. 粪大肠菌群菌落呈现不同深浅的蓝色。
   2. 非粪大肠菌群菌落颜色为灰色至乳白色。
5. 粪肠球菌
   1. 粪肠球菌菌落颜色从粉红色到深红色不等。

3. 菌落验证

1. 总大肠菌群
   1. 对于有无验证，使用无菌接种环擦拭整个膜表面。对于菌落，建议至少分别验证五种典型和非典型形态的菌落。
   2. 将选定的菌落转移至含有月桂基胰蛋白胨肉汤并带有杜氏小管的玻璃容器中。将接种后的试管在35±0.5 °C下培养48小时。若出现浑浊（表明有生长）并伴随产气现象，则可确认该菌落为大肠菌群。
2. 粪大肠菌群
   1. 将呈蓝色的菌落无菌转移至含有无菌EC培养基并带有杜氏小管的玻璃容器中。将接种后的试管在44.5 ± 0.2 °C下培养24小时。若出现浑浊（表明有生长）并伴随产气现象，则可确认该菌落为粪大肠菌群。
3. 粪肠球菌
   1. 将具有粪肠球菌典型形态的菌落无菌划线接种于脑心浸出液琼脂（BHIA）平板上进行分离，并在35 ± 0.5 °C下培养24至48小时。
   2. 将BHIA 上单个分离菌落的生长物转移至两张预先清洁的玻片上。
   3. 在制备好的涂片上加入2至3滴3%过氧化氢溶液。若迅速产生气泡，则结果为“过氧化氢酶阳性”，表明该分离菌不是粪链球菌。
   4. 对过氧化氢酶阴性（未观察到气泡）的分离菌进行革兰染色。粪肠球菌为革兰阳性、卵圆形，通常成对或呈短链状排列。

粪便细菌指示剂	推荐培养基 （培养温度，时间）1
总大肠菌群	LES Endo 琼脂 (35 ± 5 °C, 24 h) M-Endo 培养基 (35 ± 5 °C, 24 h)
粪便大肠菌群	m-FC 培养基 (44.5 ± 0.2 °C, 24 h)
粪肠球菌	m Enterococcus 琼脂 (35 ± 0.5 °C, 48 h)

表1. 环境样品中粪便细菌指示菌检测常用培养基
¹ 如建议的 水和废水检测标准方法 （美国公共卫生协会和美国水工程协会，22^nd 第2版，2012年