6.9: 斑块测定:确定病毒性皮石为斑块形成单位（PFU）的方法

1. 设置

1. 在开始任何涉及微生物的工作之前，请确保工作空间已消毒（例如，用 70% 乙醇擦拭）。始终穿着实验室外套和手套，保持长发绑在背上，并确保任何伤口都特别好保护。
2. 完成后，对所有表面进行消毒，彻底清洗/消毒手和手腕。

2. 议定书

1. LB 介质准备
   注意:根据宿主细菌菌株和噬菌体的不同，不同的液体介质可能更适合于宿主细菌菌株的初始培养，或者不同的固体介质可能更适合后续生长。莱索根汤 （LB） 用于此协议中的肉汤和琼脂。
   1. 混合 4 g LB 在 200 mL 蒸馏水中，在三重，为 LB 肉汤， 固体底部琼脂， 和软顶部琼脂.所有解决方案都应在容器中制备，其容量应为最终体积的两倍，以防止高压灭菌时溢出。
      注意:如果以三重分法执行测定，则准备将 LB 底部琼脂的量翻倍。
   2. 根据需要，使用 NaOH 或 HCl 将所有三种解决方案的 pH 量调整为 7.4。
   3. 在底部琼脂瓶中加入 3 g 的琼脂能量，为固体琼脂制作 1.5% 的琼脂溶液
   4. 在顶部琼脂瓶中加入 1.2 g 的琼脂能量，使软琼脂的琼脂溶液为 0.6%。
   5. 将装有半紧固盖的瓶子放入设定为 121°C 的高压灭菌器中 20 分钟，对溶液进行消毒。运行完成后立即关闭盖子，以防止污染。
   6. 当 LB 介质温度达到约 45-50°C 时，在 200 mL LB 溶液中加入 450 μL 无菌 1 M CaCl_2，最终浓度为 2.25 mM。
   7. 将固体琼脂介质的15 mL等分倒入无菌培养皿中（避免晃动以防止发泡），让琼脂在室温下凝固数小时或过夜（图4A）。板材可在4°C上下倒存储数天。
2. 宿主细胞的培养
   1. 在测定前一天，将10μL的大肠杆菌培养剂加入10 mL的LB汤中。
   2. 在摇动的培养箱中，在37°C下以160rpm在160rpm下孵育细菌。
   3. 在测定的早晨，将0.5 mL的过夜培养添加到10 mL的新鲜LB中。
      注意:如果要在三次测定中执行测定，请准备此区域性的两倍。
   4. 在摇动的培养箱中以160rpm在37°C下孵育，直到细菌培养处于对数阶段生长。这可以通过 0.5-0.7 的 OD600 分光度来确定。
   5. 将培养物保持在室温下，直到细菌被添加到顶部 LB 琼脂。
3. 噬菌体10倍的连续稀释
   1. 将 180μL 的 LB 肉汤添加到 a 第一行的 7 口井中，以 96 孔板
      注意:建议对三联产品进行稀释，以提高其统计可靠性。为此，在板的第二行和第三行准备噬菌体的额外稀释剂。
   2. 小心地涡涡原噬菌体样品，以确保均匀性，并将20μL转移到第一口井中。
   3. 通过移液和向下混合样品。
   4. 将产生的悬浮液的 20 μL 转移到第二口井中。
   5. 继续连续稀释，将第二口井中的20μL溶液转移到第三口井，等等，直到第六口井，留下第七口和负对照，不会添加噬菌体悬浮液。这将创建 10^{-1 -10-6}的稀释范围。
4. 电镀
   1. 用名称、日期和简短的样品描述（包括噬菌体样品稀释因子）标记培养皿的底座（以前在步骤 2.1.7 中准备）。在测定前一小时在37°C培养箱中预热培养皿。
   2. 融化凝固的软琼脂介质（通常使用微波进行;凝固的琼脂在85°C下熔化），并让它接近45°C。加热介质可置于 45°C 水浴中，约 1 小时，达到适当的温度。它应该足够热，以保持液体形式，但足够凉爽，不杀死添加的细菌。
   3. 将 4 mL 细菌培养物（从步骤 2.2 起）与 35 mL LB 软琼脂混合（在 45°C 下）。旋转均匀分布细胞，但避免晃动，以防止发泡 （图4A）。
   4. 为每个连续稀释步骤标记一个无菌试管，为控制样品标记一个无菌试管，总共标记 7 个试管。将细菌培养剂/软琼脂混合物的5 mL等分从步骤2.4.3放入7管中。通过步骤 2.4.6 快速工作，因为这种小体积的基于琼脂的介质将在室温下迅速凝固。
   5. 将 100 μL 的控制样本（从步骤 2.3）添加到控制试管中，并小心旋转。丢弃用过的移液器尖端，并将相同的体积从每个序列稀释的噬菌体样品（步骤 2.3）传输到各自的试管，旋转混合。
   6. 立即将 5 mL 混合物转移到贴有标签的预热固体琼脂板上（图4A）。轻轻旋转板，甚至分散混合物。
      注意:如果要在三重中执行测定，请重复步骤 2.4.3-6 两次。
   7. 用实验室薄膜密封每个板，并在室温下（约15分钟）使两层正确凝固，然后再将其从37°C培养箱上侧放置，刺激细菌和噬菌体的生长，持续24小时或直到斑块发育，它通常需要大约1-5天的斑块出现（图4B），但时间差异很大，取决于孵育条件，培养和细菌物种。

3. 数据分析和结果

1. 计数斑块
   1. 确保标有"控制"的板中看不到斑块，因为这将表示病毒污染。
   2. 从^标有10-6的板开始，含有最稀释的噬菌体样本。在不取下盖子的情况下对斑块进行计数，在进行标记时用笔标记它们，以指示哪些斑块已计数。
   3. 计算剩余的盘子。有些盘子的斑块可能太少或太多，无法计数。使用带有 10-150 块板的板进行进一步分析。
2. 计算 PFU
   1. 将斑块数量除以稀释系数（例如，最稀释样品的10-6），以获得100μL噬菌体混合物中的斑块形成单位（PFU）数量。
      注意:如果以三联形式执行测定，则使用三个板的平均斑块数。
   2. 要确定原始样品的浓度（以PFU/mL为单位），再乘以10的额外稀释系数，因为只镀了100μL的样品。（即）
   3. 计算具有 10 到 150 块斑块的所有稀释液的 PFU/mL 的平均值，以获得更可靠的结果。

噬菌体，也称为噬菌体，是专门感染细菌的病毒，我们可以使用称为噬菌斑测定的工具确认它们的存在并对其进行定量。噬菌体通过首先附着在细菌细胞壁上并注射其遗传物质来感染其易感宿主。然后，它们劫持细胞的生物合成机制来复制它们的 DNA 并产生许多后代噬菌体颗粒，然后通过裂解和杀死宿主细胞来释放这些噬菌体颗粒。

这种裂解活性是广泛使用的噬菌体计数技术的基础，称为噬菌斑测定或双琼脂层测定。在这里，首先在含有低浓度琼脂的熔融营养液中制备噬菌体混合物。混合物中使用的所有细菌都应该是活的，并在其生长的对数阶段积极分裂，这将确保很大一部分细菌是活的，并且能够在斑块周围形成密集的草坪。接下来，将这种熔融的细菌-噬菌体琼脂混合物铺布在更固体、更浓缩的琼脂营养培养基上，该培养基已经在培养皿上凝固。在室温下孵育时，低浓度琼脂噬菌体细菌肉汤也会凝固，形成柔软的琼脂覆盖层。

在这里，细菌细胞可以从底层获取额外的营养物质，并且应该迅速繁殖以产生融合的细菌草坪。然而，由于噬菌体颗粒也存在于软层中，这些颗粒会在细菌内感染和复制它们的遗传物质，最终导致细胞裂解，从而释放多个后代。然后，这些噬菌体后代感染邻近的细胞，因为细菌-噬菌体层的半固态限制了它们向位于更远的宿主细胞移动。这种感染和裂解的循环持续多轮，杀死局部区域的大量细菌。相邻细胞被破坏的效果是产生一个圆形的透明区域，称为斑块，可以用肉眼看到，有效地放大噬菌体的细菌裂解活性并使其计数。

培养皿上的噬菌斑数量称为噬菌斑形成单位或 PFU，如果初始噬菌体浓度足够稀释，则应直接与原始样品中感染性噬菌体颗粒的数量相对应。该技术还可用于表征噬菌斑形态，帮助鉴定噬菌体类型或分离噬菌体突变体。在本实验中，您将学习如何以大肠杆菌的 T7 噬菌体为例，进行噬菌斑测定以计数噬菌体。

首先，确定用于培养宿主细菌细胞和噬菌体的合适培养基。在这里，溶原肉汤或 LB 培养基用于培养大肠杆菌和 T7 噬菌体。接下来，取三个干净的玻璃瓶，用培养基、名称标记，然后第一个作为 LB-Broth，第二个作为 LB-Bottom 琼脂，第三个作为 LB-Top 琼脂。现在，将 4 克预先配制的 LB 粉末分成三组称量，然后将一组称重的干燥培养基转移到每个瓶子中。在第一个瓶子中加入 200 毫升水。使用磁力搅拌棒混合内容物。

然后，使用 pH 计并不断搅拌，通过添加氢氧化钠或盐酸将最终 pH 值降至 7.4。对其余两个瓶子也重复加水和 pH 值调整。现在，称取 3 克琼脂粉，加入第二个瓶子中，制成 1.5% 的底部琼脂。最后，称重 1。2 克琼脂，加入第三个瓶子中，制成 .6% LB 顶部琼脂。瓶子 1 中的肉汤条件不需要添加琼脂。半密封瓶盖，然后在 121 摄氏度下高压灭菌 20 分钟，对培养基进行消毒。完成后，从高压灭菌器中取出培养基瓶，并立即扭动瓶盖以将其完全关闭，以防止污染。将 LB-Broth 和 LB-Top 琼脂培养基放在工作台上以备后用。将 LB-Bottom 琼脂放入预设为约 45 摄氏度的水浴中冷却。

当 LB-Bottom 琼脂达到约 45 摄氏度时，将其转移到工作台上。接下来，使用 70% 乙烯醇对工作区进行消毒。接下来，将 450 微升无菌一摩尔氯化钙添加到熔融底部琼脂中，使最终浓度为 2.25 毫摩尔。轻轻旋转瓶子以混合。然后，摆出七个干净的培养皿。在底部标记每个培养皿，标明培养基名称和制备日期。然后，将 15 毫升底部琼脂倒入 7 个培养皿中的每一个中。让板在室温下凝固几个小时或过夜。凝固后，如果需要，可以将培养板在 4 摄氏度下倒置储存数天，以尽量减少冷凝。在测定前一小时将培养皿从 4 摄氏度冰箱转移到 37 摄氏度的培养箱中。

在进行检测的前一天，应培养大肠杆菌。在这里，将 10 μL 大肠杆菌培养物接种到 10 mL LB 肉汤中。将细菌放入设置为 37 摄氏度、160 RPM 的振荡培养箱中生长过夜。然后，在检测当天，从培养箱中取出细菌培养物。将新鲜的 10 毫升新鲜 LB 肉汤与 0.5 毫升过夜培养物一起接种。将这些细胞放入设置为 37 摄氏度、160 RPM 的摇动培养箱中生长。接下来，使用分光光度计检查该培养物何时达到对数期生长，光密度为 0.5 至 0.7。一旦 OD 达到此水平，将细胞培养物转移到工作台上以停止孵育。它们现在可直接用于噬菌体覆盖测定。

噬菌体滴度在不同噬菌体类型和样品中可能呈指数级变化。因此，为了有效地计数，应稀释它们以产生各种浓度的噬菌体。在检测当天，采用 10 倍稀释技术，生成一系列浓度从十分之一到百万分之一浓度的噬菌体稀释液。为了获得具有统计学意义和准确的数据，请一式三份进行连续稀释。

接下来，使用微波炉熔化凝固的 LB 顶部琼脂。然后，将其放入预设为 45 摄氏度的水浴中一小时。一小时后，从培养箱中收集含有底部琼脂层的培养皿。用噬菌体浓度和测定日期标记板。然后，放置 7 个干净的试管。用连续噬菌体稀释号标记每个试管，并指定一个作为对照。

当 LB 顶部琼脂达到 45 摄氏度时，将其转移到工作台上。现在，将 450 微升 1 摩尔氯化钙添加到 200 毫升琼脂中，使最终浓度为 2.25 毫摩尔。轻轻旋转瓶子以混合。接下来，将 35 毫升 LB 顶部琼脂和 4 毫升细菌悬浮液添加到无菌锥形管中。轻轻旋转以均匀分布细胞，但避免摇晃以防止起泡。

现在，将 5 毫升这种细菌顶部琼脂混合物分装到七个试管中的每一个中。然后，将 100 微升连续稀释的噬菌体样品和对照培养基（应该是没有噬菌体的简单培养基）转移到贴有标签的试管中。轻轻旋转混合物以确保正确混合。轻轻地将 5 毫升噬菌体混合物转移到相应的培养皿板上。轻轻旋转培养皿，将混合物均匀地涂抹在整个表面上。

将所有培养皿与混合物分层后，在室温下孵育 15 分钟，使顶层凝固。完成这些步骤后，使用剩余的两组噬菌体稀释液对第二组和第三组培养皿重复该过程。用封口膜密封每个培养皿，并在室温下孵育 15 分钟。将培养板在合适的温度下倒置 24 小时或直到出现空斑。在这里，将板置于 37 摄氏度的培养箱中一天，这是刺激大肠杆菌和 T7 噬菌体生长的条件。

孵育 1 到 5 天后会出现斑块，具体取决于细菌种类、孵育条件和培养基的选择。在这里，在 37 摄氏度下孵育一天后可以看到斑块。首先检查标记为对照的板，并确保这些板中没有形成噬菌斑，因为这表明病毒污染。要确定原始样品中的噬菌体滴度，首先从含有最稀释噬菌体样品的板开始，在不取下盖子的情况下对噬菌斑进行计数，标记它们以表明哪些噬菌斑已被计数。对每组中的每一个板重复计数。有些盘子的斑块可能太多或太少，无法计数。考虑 10 到 150 个作为理想的斑块计数。

接下来，生成一个表格，列出不同稀释度和重复样的空挂斑编号值。然后，计算包含理想噬菌斑计数数的稀释板的平均噬菌斑数值。在这个例子中，这些是在 10 到负 3 和 10 到负 4 稀释板中形成的噬菌斑的平均数量。现在，通过将获得的平均噬菌斑值除以相应的噬菌体稀释因子来调整噬菌体稀释因子。在这里，将形成的 10 到负 3 和 10 到负 4 稀释板的平均噬菌斑数量除以它们各自的稀释因子，以获得 100 微升噬菌体混合物中噬菌斑形成单位或 PFU 的数量。要将该值转换为每毫升 PFU，请将生成的值乘以 10，因为在噬菌体覆盖制备步骤中仅使用了 100 μL 噬菌体稀释混合物，从而产生 10 的额外稀释因子。最后，计算从不同稀释板获得的值的平均值。这将给出每毫升的平均 PFU 数量。PFU 的数量对应于原始样品中感染性噬菌体颗粒的数量。