噬菌斑实验：以噬菌斑形成单位（PFU）测定病毒滴度的方法

1. 设置

1. 在开始任何涉及微生物的操作之前，确保工作区域已灭菌（例如用70%乙醇擦拭）。始终穿着实验服并佩戴手套，长发应束起，确保任何伤口均得到充分保护。
2. 操作结束后，对所有表面进行灭菌，并彻底清洗或消毒双手及手腕。

2. 实验方案

1. LB培养基制备
   注意：根据宿主菌株和噬菌体的不同，可能需要使用不同的液体培养基来初始培养宿主菌，或使用不同的固体培养基进行后续生长。本实验方案中，液体培养和琼脂均使用Lysogeny broth（LB）。
   1. 分别取4 g LB溶于200 mL蒸馏水中，共三份，用于制备LB液体培养基、底层固体琼脂和上层软琼脂。所有溶液均应置于可容纳最终体积两倍的容器中，以防止灭菌时溢出。
      注意：若实验需设三个重复，则底层琼脂的制备量应加倍。
   2. 根据需要使用NaOH或HCl将上述三种溶液的pH值调节至7.4。
   3. 向底层琼脂瓶中加入3 g琼脂粉，配制成1.5%的琼脂溶液，用于制备固体琼脂。
   4. 向上层软琼脂瓶中加入1.2 g琼脂粉，配制成0.6%的琼脂溶液，用于制备软琼脂。
   5. 将瓶盖稍拧松后放入高压灭菌锅中，在121°C下灭菌20分钟。灭菌程序结束后立即拧紧瓶盖，以防污染。
   6. 当LB培养基冷却至约45–50°C时，向每份200 mL LB溶液中加入450 μL无菌的1 M CaCl₂，使终浓度为2.25 mM。
   7. 将15 mL固体琼脂培养基分装至无菌培养皿中（避免振荡以防止起泡），室温下静置数小时或过夜使其凝固（图4A）。平板可倒置存放于4°C，保存数天。
2. 宿主细胞的培养
   1. 实验前一天，取10 μL E. coli 菌液加入10 mL LB液体培养基中。
   2. 将细菌置于37°C摇床中，以160 rpm振荡培养过夜。
   3. 实验当天早晨，取0.5 mL过夜培养物加入10 mL新鲜LB培养基中。
      注意：若实验设三个重复，则该菌液的制备量应加倍。
   4. 将菌液在37°C、160 rpm条件下于摇床中继续培养，直至细菌进入对数生长期。可通过分光光度法测定OD600值在0.5–0.7之间来判断。
   5. 将菌液置于室温下，待后续加入上层LB软琼脂时使用。
3. 噬菌体的10倍系列稀释
   1. 在96孔板的第一行七个孔中，每孔加入180 μL LB液体培养基。
      注意：建议进行三个重复稀释，以提高统计可靠性。为此，可在96孔板的第二行和第三行中额外制备两组噬菌体稀释液。
   2. 轻轻涡旋原始噬菌体样品以确保均匀，取20 μL加入第一孔中。
   3. 通过移液器反复吹打充分混匀样品。
   4. 取20 μL上述混合液转移至第二孔。
   5. 继续进行系列稀释：将第二孔中的20 μL溶液转移至第三孔，依此类推，直至第六孔。第七孔作为空白对照，不加入任何噬菌体悬液。最终可获得10^-1至10^-6的稀释梯度。
4. 涂布平板
   1. 在培养皿底部（即步骤2.1.7中预先制备的平板）标记实验者姓名、日期及简要样品信息（包括噬菌体样品的稀释倍数）。实验前1小时将培养皿置于37°C培养箱中预热。
   2. 将凝固的软琼脂培养基融化（通常使用微波炉加热；琼脂在85°C时熔化），待其温度降至约45°C。可将加热后的培养基置于45°C水浴中约1小时以达到适宜温度。温度应足够高以保持液态，但又不能过高以免杀死后续加入的细菌。
   3. 取4 mL菌液（来自步骤2.2）与35 mL温度为45°C的LB软琼脂混合，轻轻旋转混匀细胞，避免振荡以防起泡（图4A）。
   4. 为每个系列稀释梯度及对照样品各准备一支无菌试管，共7支，并做好标记。将步骤2.4.3中得到的菌液-软琼脂混合物每管分装5 mL。操作需迅速完成步骤2.4.6，因为小体积的琼脂基质在室温下会迅速凝固。
   5. 向对照试管中加入100 μL对照样品（来自步骤2.3），轻轻旋转混匀。弃去移液枪头后，用新枪头从各系列稀释的噬菌体样品（步骤2.3）中分别取相同体积加入对应试管中，每加一次均需轻轻旋转混匀。
   6. 立即将各5 mL混合液转移至已标记并预热的固体琼脂平板上（图4A），轻轻旋转平板使混合物均匀铺展。
      注意：若实验设三个重复，则需重复步骤2.4.3至2.4.6两次。
   7. 用实验室封口膜密封每个平板，室温下静置约15分钟，待两层琼脂完全凝固后倒置放入37°C培养箱中，培养24小时或直至噬菌斑出现。通常噬菌斑的形成需要1–5天（图4B），但具体时间因培养条件、培养基及细菌种类而异。

3. 数据分析与结果

1. 计数噬斑
   1. 确保标记为“control”的平板中无可见噬菌斑，否则表明存在病毒污染。
   2. 从标记为10的培养皿开始^-6，包含最稀释的噬菌体样品。在不打开培养皿盖的情况下计数噬菌斑，用笔标记已计数的噬菌斑以避免重复计数。
   3. 统计剩余的平板。部分平板上的噬菌斑可能过少或过多而无法计数。选择含有10–150个噬菌斑的平板用于后续分析。
2. 计算PFU
   1. 将噬斑数量除以稀释因子，（例如. 10^-6 对于最稀释的样品），以确定100 μL噬菌体混合液中的噬菌斑形成单位（PFU）数量。
      注意： 若进行三复孔实验，使用三个孔中蚀斑数的平均值。
   2. 为确定原始样品的浓度（PFU/mL），需再乘以10倍的稀释因子，因为仅接种了100 μL样品。 )
   3. 计算所有产生10到150个噬斑的稀释度的PFU/mL平均值，以获得更可靠的结果。