Name: 移植嵌合斑马鱼胚胎生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-17T16:04:00.000+00:00
Duration: 21 min 1 s
Description: 学习在囊胚期或原肠胚期移植细胞生成嵌合斑马鱼胚胎的技术。该方法利用Danio rerio研究基因功能与细胞互作，帮助区分细胞自主性与非自主性基因功能，为发育生物学和神经科学研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Moens实验室成员在撰写本文过程中提供的有益建议。H.K. 是由美国国立卫生研究院/儿童健康与人类发展研究所（NIH/NICHD）资助项目（资助号：5R01HD037909-08）支持的博士后研究员。C.B.M. 是霍华德·休斯医学研究所的研究员。

通过囊胚期或原肠胚期移植产生靶向嵌合体斑马鱼胚胎的逐步指南。
研究复杂发育过程最强大的工具之一是嵌合胚胎的分析。嵌合体是指包含来自多个个体细胞的生物体；其中嵌合体的一种类型为嵌合子，其细胞来源于多种基因型，通常为野生型与突变型细胞的混合。在斑马鱼中，可通过在适当胚胎发育阶段将供体胚胎的细胞移植到宿主胚胎中，从而便捷地制备嵌合体。通过在单细胞期胚胎中注射谱系标记物（如荧光染料），可获得标记的供体细胞。利用安装在复式显微镜或解剖显微镜上的油控玻璃微量移液管，将标记的供体细胞从供体胚胎中取出，并注入未标记的宿主胚胎中。在某些情况下，可根据已确立的细胞命运图谱，选择宿主胚胎中的特定移植位点，从而将供体细胞定向移植至囊胚期或原肠胚期宿主胚胎的特定区域或组织。
第1部分：在单细胞阶段向斑马鱼胚胎显微注射。
<ol>
<li>单细胞期胚胎的酶法去壳。
 为进行蛋白酶消化去壳，将处于单细胞期的胚胎在0.5 mg/ml的蛋白酶溶液中孵育约1–5分钟，具体操作如《斑马鱼手册》1所述。密切观察去壳过程，一旦发现卵壳开始明显塌陷，立即用含青霉素/链霉素的胚胎培养基（Pen/Strep EM）淹没胚胎。一旦脱离卵壳，囊胚期和原肠胚期的胚胎将变得非常脆弱，若暴露于空气中，容易黏附在塑料表面或发生解体。因此，应始终保持去壳后的胚胎浸没在含青霉素/链霉素的胚胎培养基中，使用宽口火焰抛光玻璃移液管在培养皿间转移，并将胚胎维持在涂有琼脂的塑料培养皿（含1.2%琼脂糖的Pen/Strep EM）或经高压灭菌的玻璃培养皿中。 </li>
<li>向去壳胚胎注射谱系标记物。
 制备注射用培养皿：取一玻璃载片，以45度角斜插入一个装有约四分之三体积、由Pen/Strep EM配制的1.2%琼脂糖的培养皿最宽处。待琼脂糖凝固后取出载片，即可形成一个斜面槽。将去壳后的胚胎转移至充满Pen/Strep EM的注射槽中。使用精确校准的火焰拉制玻璃注射毛细管和压力注射装置，向胚胎注射1 nl体积的谱系标记物，具体方法参见《斑马鱼手册》1。在1至4细胞期之间，将染料或小分子量谱系示踪剂直接注射到去壳胚胎的卵黄中。使用3%的荧光葡聚糖溶液足以在嵌合胚胎发育数天后仍可检测到供体来源的细胞。若谱系标记物为编码荧光蛋白的mRNA（例如GFP或RFP），则应直接注射至早期单细胞期胚胎的细胞质内。 </li>
<li>向未去壳胚胎注射谱系标记物。
 通过在EM中制备含模具的1.2%琼脂糖，使琼脂糖围绕模具形成若干孔洞，孔径大致与卵壳直径相同，从而制备多孔注射培养皿。将未去壳的胚胎转移至半充满Pen/Strep EM的多孔注射培养皿中，并吸除多余液体。胚胎由此被固定，可如上所述注射1 nl体积的谱系标记物。 </li>
<li>培养用于移植的注射后胚胎。
 将胚胎以较低密度（每皿40–50枚）在新鲜的Pen/Strep EM中培养。用于移植的供体与受体胚胎应尽可能匹配发育时期。对于盾板期移植，建议供体胚胎略微滞后于受体；需注意注射后的胚胎通常会略有发育延迟。通过在不同温度（25°C、28°C和31°C）下孵育胚胎，使其发育进程错开，从而延长可进行移植操作的时间窗口。 </li>
</ol>
第二部分：通过移植制备嵌合体斑马鱼胚胎。
 <ol style="list-style-type:none;">
 <li>囊胚期在体视显微镜下的移植</li>
</ol>
 <ol style="list-style-type:upper-alpha;">
 <li>囊胚移植装置的描述
 用于斑马鱼囊胚细胞移植的装置由一个由微米驱动器控制的汉密尔顿注射器（10 μl–50 μl）组成，通过一段柔性管路经三通旋塞连接至矿物油储液罐和微移液管支架。组装好移植装置后，需用矿物油充满整个系统，并注意彻底排除所有气泡。系统中若存在气泡，将会影响对吸力和压力的精确控制。应使用具有较高放大倍数和优良光学性能的体视显微镜（理想情况下放大倍数至少为80倍）。微移液管支架及针头的位置可通过纳立西格（Narishige）手动显微操作器进行调控，如同注射操作；然而，若体视显微镜底座过宽导致显微操作器难以接近，则可从纳立西格公司购买可安装于体视显微镜镜体的适配器。显微操作器的安装必须非常稳固，以避免将振动传递至移植针头；使用磁性底座可有效实现稳定固定。 </li>
<li>准备移植移液管
 移植针由玻璃毛细管移液器制成（参见下方试剂表中的两种选项），使用电极拉制仪将其拉成平缓的锥形。在解剖显微镜下，用直边剃须刀片在针尖处将其折断，折断位置应选择在毛细管内径略大于待移植细胞的位置。将刀片保持轻微角度，以形成斜面，并尽可能使断裂面平滑，无锯齿状边缘。对于囊胚期移植，针的外径应约为50–60 mm。 </li>
<li>在琼脂模具中固定胚胎以进行移植
 通过将带有楔形突起排布的塑料模具漂浮在盛有半量熔融1.2%琼脂糖EM培养基的培养皿中制备注射用培养皿。待琼脂糖凝固后，移除模具模板，留下含有成排三角形小孔的琼脂糖模具，每个小孔大小恰好可容纳一个胚胎。用含青霉素/链霉素的EM培养基填充移植模具，并用火焰抛光的玻璃移液管将囊胚期胚胎逐个装入各小孔中，使供体胚胎置于其中一列，受体胚胎置于相邻的一列。 </li>
<li>移植细胞
 将胚胎侧向放置于移植孔中；在移植过程中，根据需要使用移植移液管重新调整位置，注意避免刺破卵黄。将培养皿置于显微操作台上，使移植针进入胚胎时能将其推向孔的后壁。使用显微操作仪，以较陡的角度将移植针插入培养皿中。理想情况下，移植针应以约45度角进入胚胎。当针尖进入胚胎培养液表面以下后，通过旋转控制Hamilton注射器的微米驱动器，吸取少量胚胎培养液进入针内。为实现最精确的控制，矿物油与胚胎培养液的界面应保持在针的细长锥形部分，但不宜过于接近针尖。用针轻柔地调整供体胚胎的位置，随后将针稍向后撤，从预定位置刺入胚胎的囊胚帽。快速而有力地刺入可穿透胚胎而不引起其滚动。缓慢而小心地将供体细胞吸入针内。若吸取得过快，细胞可能受到剪切损伤。同时应避免将卵黄吸入针内，因其会与矿物油结合，进而导致细胞死亡。当吸入所需数量的细胞后，轻微逆转压力以停止负压，然后将针从胚胎中取出。通过移动移植培养皿，将受体胚胎移至合适位置。只要注意不接触卵黄，可使用移植针轻柔转动受体胚胎，进行微调。在将供体细胞注入受体胚胎时，应避免带入大量胚胎培养液或任何矿物油，以免干扰胚胎发育或导致其死亡。细胞在动-植轴上的位置会影响其对三个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的贡献2,3。因此，在原肠胚形成开始前，靠近边缘区移植的细胞倾向于分化为内胚层和中胚层，而靠近动物极移植的细胞则主要参与外胚层命运，最常见的是表皮外胚层、前脑和眼睛。因此，即使在囊胚阶段，也可实现一定程度的组织靶向。完成细胞移植后，将供体-受体配对转移至24孔板中涂有琼脂的孔内，继续培养发育。 </li></ol>
 <ol style="list-style-type:none;">
 <li>原肠胚阶段在复式显微镜下进行移植</li>
</ol>
 <ol style="list-style-type:upper-alpha;">
 <li>移植装置的描述
 在体视显微镜下进行细胞移植操作时，使用三轴油压微操作仪可精确控制移液针的位置。该微操作仪用于调控移植移液管的细微移动，而移液管内的吸力则由微米驱动的Hamilton注射器控制，其原理与囊胚移植所用的注射器相同。进行细胞移植时，建议使用具有固定载物台的直立式复式显微镜，因为调焦过程中此类显微镜不会导致胚胎相对于移液管发生位移。然而，若必须使用可调载物台的复式显微镜，则可将微操作仪安装于载物台上，而非显微镜主体上，以达到相同效果。Narishige公司还提供适配器，支持将微操作仪安装于不同厂商生产的复式显微镜的载物台或镜体上。

关键词：细胞移植，体视显微镜，三轴油压微操作仪，移液管，Hamilton注射器，固定载物台，可调载物台，适配器，Narishige </li>
<li>准备移植移液管
 移植针的制备方法基本如上所述；进行原肠胚期移植时，理想的针孔直径为30-40 mm。在盾形结构形成后，外胚层（EVL）的黏附性增强，导致移植针难以穿透胚胎。为便于针头进入，可使用微加工仪在针尖末端拉制倒钩。首先，将针尖靠近微加工仪的加热丝以使其顶端平滑；然后旋转针头，使斜面的前沿接触加热丝。一旦针尖前沿接触加热丝，迅速将其拉离，以形成倒钩或鱼叉状结构。为避免损伤细胞，倒钩应保持笔直，针尖不应弯曲。 </li>
<li>在甲基纤维素中固定胚胎以进行移植
 对于体视显微镜下的移植操作，将胚胎置于凹面载玻片上，并用溶解于胚胎培养基中的3%甲基纤维素（Sigma）溶液进行封片。首先，在玻璃凹面载玻片的凹槽内涂抹一条垂直的甲基纤维素条带，然后加入足量的胚胎培养基将其覆盖。使用火焰抛光的移液管，将一个供体胚胎和三个盾形期宿主胚胎转移至凹面载玻片上甲基纤维素一侧的胚胎培养基液面下。选择略比宿主胚胎更早期的供体胚胎（30–50%外包阶段）。利用一段短的2磅测试鱼线两端粘接于毛细管末端制成的小环工具，轻轻地将供体与宿主胚胎沿甲基纤维素条带向上滚动，并将其压入甲基纤维素中固定。若需将移植细胞靶向特定区域，则必须了解盾形期胚胎的命运图谱3,4以及目标组织相对于盾结构的位置，以便正确摆放宿主胚胎。在将宿主胚胎置入甲基纤维素时，应将其滚动至合适位置，使目标区域朝上，因为在移植过程中，注射针将沿切线方向进入胚胎，以递送供体细胞而不损伤卵黄。 </li>
<li>移植细胞
 将移植针移至胚胎的焦平面。首先使用10倍物镜对供体胚胎进行调焦。然后将胚胎移至一侧，在不调整焦平面的情况下，利用显微操作仪的控制装置将移植针尖端调至清晰对焦。将微吸管固定器和针头置于较浅的角度，使针头尽可能接近水平，但受限于载玻片凹槽边缘的允许范围。若胚胎在甲基纤维素中安装得当，当移植针进入时胚胎不会滚动，除非胚胎过老导致针头难以顺利穿透。随着胚胎发育，外包层似乎变得更坚韧，因此原肠胚阶段的移植最好在盾形期形成后立即进行。囊胚期之后，卵黄位于胚盘帽细胞正下方，并随着外包运动的进行，胚盘帽逐渐变薄。为避免刺破卵黄，针头进入胚胎时的焦平面应略深于外层细胞层（EVL）的焦平面。当从供体胚胎中吸取大量细胞时，应在吸取细胞的同时轻微移动针头，以避免意外将卵黄吸入针内。若需将同一供体胚胎的细胞移植至多个受体胚胎，最好仅用针头进入供体胚胎一次，以尽量减少损伤。随后可将供体细胞转移至最多三个受体胚胎的指定位置。当需将两个或以上供体胚胎的细胞移植至一个受体胚胎时，建议先将各供体胚胎的细胞依次吸入同一移植针内，再移植至受体胚胎。此方法可最大限度减少对受体胚胎的损伤，并确保所有细胞被转移至胚胎的同一区域，以便比较其行为。移植针内不同供体来源的细胞之间混合极少，因此当使用多个供体时，应将细胞转移至同一个受体胚胎。为提高供体细胞贡献于目标组织的可能性，应在将针头穿过目标区域的同时缓慢推出细胞，而非将细胞一次性集中沉积。完成细胞转移后，将整个载玻片放入培养皿中，并小心加入含青霉素/链霉素的胚胎培养基（Pen/Strep EM）。在接下来的数小时内，甲基纤维素将逐渐溶解，释放出胚胎。 </li></ol> 
<img src="/files/ftp_upload/1394/fig1.jpg" alt="用于光子学研究的显微镜光学装置；图C显示了微阵列芯片的尺寸。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1：制备嵌合胚胎的显微镜装置。A：解剖显微镜下的移植装置由一个充满油的Hamilton注射器与微米驱动装置（a）组成，该注射器通过三通旋塞（d）连接至一个充油储液器（b）和移植移液管（c）。移植移液管安装在一个粗调微操作器（e）上，该微操作器通过磁性底座（f）固定在金属基板上（未显示）。移植操作在体视显微镜（g）的载物台上进行，该显微镜配备底部照明以获得最佳光学效果。B：复合显微镜下的移植装置包含类似的充油Hamilton注射器和微米驱动装置（a, b），但在此情况下，移植移液管安装在移液管夹持器（c）上，其X、Y和Z方向的移动可通过粗调（d）或精细（e）微操作器控制。本示例中，微操作器安装在固定载物台显微镜的镜体上，但也可安装在常规显微镜的载物台上。胚胎被固定在凹面载玻片上的甲基纤维素中，并使用10倍物镜（f）进行观察。C：用于在体视显微镜下移植时固定胚胎的模具。去壳胚胎被单独放入在90 mm培养皿中用琼脂糖浇铸此模具所形成的孔穴中。图中显示了孔穴的尺寸。
<img src="/files/ftp_upload/1394/fig2.jpg" alt="静息平衡示意图；甲基纤维素实验装置，显示毛细管操作过程。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 2"> 图2：原肠胚阶段移植胚胎的固定方法。A：理想的原肠胚移植移液管形状。带有锋利尖端的斜面有助于刺入胚胎。B：在甲基纤维素中固定供体与受体胚胎。将一条甲基纤维素置于凹面载玻片的孔中，并加入足量胚胎培养液。将胚胎加入培养液中，再用细小的环将其轻轻滚动至甲基纤维素表面（C）。D–G 为图1B中胚胎的放大图。D：将供体胚胎定向，以便移液管最易进入，因为此阶段的细胞尚未决定其发育命运。E–G：将盾板期的受体胚胎定向，使目标区域位于最上方。移植到方框区域的细胞将分别贡献于来自左侧（E）和右侧（G）的背侧后脑及颅神经嵴，或腹侧后脑与脊髓（F）。
<img src="/files/ftp_upload/1394/fig3.jpg" alt="斑马鱼基因表达的荧光显微镜图像；GFP与罗丹明染色组织。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 图3：嵌合胚胎的代表性图像。 （A-C）在盾期进行细胞移植所获得的18小时受精后（hpf）嵌合胚胎，呈背侧观，左侧为头端。 （A, B）通过嵌合胚胎分析揭示细胞表面受体EphA4的细胞分选功能。左图：罗丹明标记（rhod.）的供体细胞（红色）与在特定后脑节段中表达的转基因GFP（绿色）的合并图像。（A）野生型（WT）细胞贡献于对照嵌合胚胎的整个后脑。（B）EphA4缺失的供体细胞被排除在野生型宿主后脑的特定节段之外。（C）在盾期移植中，供体细胞被靶向至神经管不同区域。供体细胞（红色）分别靶向至野生型宿主的前脑/中脑（左图）或后脑/脊髓（右图），并用EfnB2a抗体进行共染色，该抗体标记前脑、中脑-后脑边界以及后脑的中间节段（绿色）。比例尺：50μm。

<ol><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 3rd Ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+and+developmental+potential+of+cells+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell lineage and developmental potential of cells in the zebrafish embryo.</a> Trends Genet. 4, 68-74 (1988).</li>
<li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ-cell+development%3A+the+zebrafish+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Primordial germ-cell development: the zebrafish perspective.</a> Nat Rev Genet. 4, 690-700 (2003).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124, 3157-3165 (1997).</li>
<li>Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+nanos-related+gene+is+essential+for+the+development+of+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A zebrafish nanos-related gene is essential for the development of primordial germ cells.</a> Genes Dev. 15 (21), 2877-2885 (2001).</li>
<li>Weidinger, G., Wolke, U., Koprunner, M., Klinger, M., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tissues+and+patterning+events+required+for+distinct+steps+in+early+migration+of+zebrafish+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of tissues and patterning events required for distinct steps in early migration of zebrafish primordial germ cells.</a> Development. 126 (23), 5295-5307 (1999).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+by+attraction+towards+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of zebrafish primordial germ cell migration by attraction towards an intermediate target.</a> Development. 129 (1), 25-36 (2002).</li>
<li>Ciruna, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+maternal-zygotic+mutant+zebrafish+by+germ-line+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14919-14924 (2002).</li>
<li>Waskiewicz, A. J., Rikhof, H. A., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+zebrafish+pbx+proteins+reveals+a+hindbrain+ground+state%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Eliminating zebrafish pbx proteins reveals a hindbrain ground state.</a> Dev Cell. 3, 723-733 (2002).</li>
<li>Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dead+end%2C+a+novel+vertebrate+germ+plasm+component%2C+is+required+for+zebrafish+primordial+germ+cell+migration+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival.</a> Curr Biol. 13, 1429-1434 (2003).</li>
<li>Blaser, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
</ol>

利用移植技术产生特定嵌合体的简便性，是斑马鱼作为脊椎动物模型的重要优势之一。上述方案未提及的一种改进方法可用于分析在合子发育中具有关键作用的基因的母源功能。由于这些突变型鱼无法存活至成年，必须将突变的生殖系转移到遗传背景为野生型的宿主胚胎中，从而创建突变细胞的“生殖系克隆”。构建生殖系嵌合体需要将突变供体的原始生殖细胞（PGCs）移植到野生型宿主胚胎中。与其他所有胚胎细胞谱系不同，生殖细胞谱系在发育早期即通过母源决定因子的遗传而被特化5,6。因此，构建生殖系嵌合体的首要挑战是在供体胚胎中识别原始生殖细胞（PGCs）。在中囊胚阶段，PGCs位于胚层边缘7,8，因此从带有谱系标记的供体胚胎边缘随机采集50–100个细胞，通常可成功转移PGCs。当这些细胞被移植至未标记宿主胚胎的动物极时，原始生殖细胞会主动迁移至未来的性腺区域，并在发育24小时后凭借其特有的位置、较大的体积以及因增殖缓慢而保留染料的特性被明确识别9–11。与此同时，来源于供体的非PGCs将根据其在宿主中的位置决定其命运：若移植至囊胚期动物极，则主要发育为前脑和眼睛组织。向宿主胚胎注射靶向敲低dead e...

<table><tbody><tr><td>注射装置</td><td>应用科学仪器公司</td><td>MPPI-3</td><td>脚踏开关可单独订购</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td>蛋白酶类型 XIV&amp;#8221;</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>100倍浓缩液</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-0387</td><td></td></tr><tr><td>荧光葡聚糖</td><td>分子探针，Life Technologies</td><td>各种</td><td>例如，可与赖氨酸交联的罗丹明葡聚糖（D7162）</td></tr><tr><td>注射移液管（1.2 mm × 0.94 mm × 10 cm）</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-94-10</td><td></td></tr><tr><td>移植移液选项 1</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>移植移液选项 2</td><td>VWR 国际公司</td><td>#53508-400</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige International</td><td>UMJ-3FC (?)</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪磁力支架</td><td>Narishige International</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>移植装置</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MI-10010</td><td></td></tr><tr><td>精细显微操作器</td><td>Narishige International</td><td>MMO-203</td><td></td></tr><tr><td>抑郁症切片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12560A</td><td></td></tr><tr><td>用于注射和移植的琼脂模具</td><td>AL-AN Mfg, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;试剂：&lt;/strong&gt; 这些实验所用多种试剂的配方详见《斑马鱼手册》（The Zebrafish Book），该书可于网络在线获取完整版 &lt;a href=&quot;http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html&quot;&gt;http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html&lt;/a&gt;提供了制备鱼水、含或不含抗生素的胚胎培养基、脱膜用蛋白酶、荧光葡聚糖及甲基纤维素的配方。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

通过移植生成嵌合体斑马鱼胚胎

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

研究复杂发育过程最有力的工具之一是嵌合胚胎分析。嵌合体是指包含来自多个个体细胞的生物体；其中嵌合体的一种类型为镶嵌体，其由两种或以上不同基因型的细胞混合而成，通常为野生型与突变型细胞的混合。在斑马鱼中，可通过在适当胚胎发育阶段将供体胚胎的细胞移植到宿主胚胎中，简便地制备嵌合体。通过在单细胞期胚胎中注射谱系标记物（如荧光染料），可获得带标记的供体细胞。利用安装在复式显微镜或解剖显微镜上的油控玻璃微量移液管，可将标记的供体细胞从供体胚胎中取出，并注入未标记的宿主胚胎中。在某些情况下，可根据已确立的命运图谱，选择宿主胚胎中的特定移植位点，从而将供体细胞靶向移植至囊胚期或原肠胚期宿主胚胎的特定区域或组织。

关键词：嵌合胚胎，镶嵌体，斑马鱼，细胞移植，谱系标记，荧光染料，囊胚期，原肠胚期，命运图谱

通过囊胚期或原肠胚期移植，生成特定嵌合斑马鱼胚胎的逐步操作指南。

研究复杂发育过程最强大的工具之一是嵌合胚胎分析。嵌合体是指一个……

大家好，我是来自塞西莉亚·欧文斯实验室的希拉里·肯普。这位是塞西莉亚·欧文斯。我和希拉里都在西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心的基础科学部工作。今天我们将向您展示一种制备嵌合型斑马鱼胚胎的技术，也称为遗传嵌合体。该方法使我们能够评估基因功能在发育过程中的细胞基础。我们可以探究特定基因的作用是发生在具有突变表型的细胞内部（即细胞自主性功能），还是发生在这些细胞所处的环境之中（即细胞非自主性功能）。我们通过在囊胚期或早期原肠胚期将细胞在野生型与突变型胚胎之间移植来制备这些嵌合体。随后，通过观察供体来源细胞在宿主环境中的表型和基因型来评估基因功能。现在让我们开始吧。在本实验步骤中，将谱系示踪染料注入供体胚胎，以便在移植后追踪供体来源细胞的命运。也可利用该技术注射多种类型的核酸，但若在操作胚胎前注射DNA，则省略染色步骤。在开始工作前，通过将一块载玻片以45度角插入培养皿最宽处，制备注射用培养皿，皿中加入含青霉素-链霉素的1.2%琼脂胚胎培养基，加至培养皿容量的四分之三满。在农杆菌凝固后取出载玻片，形成斜面槽。用含青霉素-链霉素的胚胎培养基填充斜面槽。随后开始对单细胞期胚胎进行酶解处理。将处于单细胞阶段的胚胎在0.5毫克/毫升的蛋白酶溶液中孵育1至5分钟。密切观察去壳过程。一旦观察到绒毛膜开始明显塌陷，立即将胚胎浸入系统水中，此时所有绒毛膜都会被冲走，而胚胎则停留在弯头底部。至关重要的是，胚胎不能再接触水面一次，此时大多数胚胎的绒毛膜已经脱落。仍有少量胚胎在外部旋转，其绒毛膜尚未脱去。如果任何胚胎仍处于其卵膜内，则通过如此移液操作可使其脱离卵膜，从而释放胚胎，使其不会接触水面。操作包被的胚胎时，必须使用经过火焰抛光以使边缘光滑的移液管。使用宽口火焰抛光玻璃移液管，轻柔地将脆弱的去壳包被胚胎转移至注射培养皿的槽中。然后将单个文件加载到此槽中。现在，胚胎已准备好使用经过精确校准的火焰拉制玻璃注射毛细管和压力注射装置注入谱系标记物。我们将使用一皿充满胚胎培养基的器皿来打断针尖，另用一皿充满油的器皿来校准针尖。这仅是一种常规的标准实验室级矿物油。我们取一把锋利的钟表匠镊子，在通过目镜观察以确定合适尺寸的同时，将镊子置于针头两侧，然后轻轻折断芯片。如果不通过观察，我实际上无法完成这一操作。在开始之前，需确定所递送染料或核糖核苷酸的体积。在矿物油培养皿中测量液滴体积。应折断针头，使微量注射器脉冲一到两次即可递送一纳升的液滴。可通过目镜测微尺测量液滴直径，并据此计算其体积。在包被胚胎的一细胞期至四细胞期之间，将一纳升浓度为1%至3%的荧光葡聚糖溶液直接注入卵黄中。我将把胚胎置于针尖正下方，轻轻将针头插入卵黄中心，然后踩下脚踏板。注射时，必须将染料注入卵黄流中，以确保染料被运输至细胞内。该注射足以在嵌合胚胎发育的数天过程中追踪细胞。理想情况下，我们应在细胞达到四细胞期之前完成注射，并将注射后的胚胎置于含新鲜青霉素-链霉素胚胎培养基的包被培养皿中，以低密度培养。请注意，注射后的胚胎发育速度通常稍慢，因此将胚胎分别置于25、28和31摄氏度下培养，以错开发育时相，从而延长可进行移植操作的时间窗口。斑马鱼囊胚期细胞移植所用装置由一个由驱动装置控制的Hamilton注射器组成，该注射器通过一段柔性管路连接三通旋塞，分别与矿物油储液器和显微注射针持针器相连。务必排除系统中的所有气泡，因为气泡会影响对吸力和压力的控制，导致操作失败。使用具有高质量光学元件的体视显微镜，放大倍数至少为 DX。为控制微量移液器支架和针头的位置，建议使用 NARA shige 手动显微操作器。务必通过磁性底座将其固定在实验台上，以防止振动传递至移植操作。针移植所用的针由玻璃毛细移液管制成，需在电极拉制仪上拉成平缓的锥形。有关在解剖显微镜下拉制移液管并折断其尖端的具体操作，请参见 Miriam Goodman 实验室的 JoVE 方案。对于囊胚期的移植，针的外径应约为 50 至 60 微米；而对于原肠胚期的移植，则应为 30 至 40 微米。为了改善胃部注射时的穿透效果，在微锻炉上首先需要用微锻炉将针尖末端拉出一个锋利的倒钩，通过将针尖靠近微锻炉的加热丝来使针尖变光滑。然后旋转针头，使针斜面的前缘接触加热丝。一旦针的前缘接触到加热丝，迅速将其拉开，以形成倒钩。为避免损伤细胞，针尖应保持平直，且针头末端不应弯曲。在准备好显微操作装置和移植针后，即可开始制备嵌合胚胎。囊胚期移植适用于在不需要精细命运图谱信息时，将细胞在胚胎之间进行移植。除原始生殖细胞外，大多数细胞在此阶段通常尚未决定其发育命运。囊胚的命运图谱使得我们能够区分将发育为外胚层的细胞和将发育为中胚层的细胞。中胚层和内胚层的前体细胞位于囊胚期胚胎的边缘附近，而将发育为神经系统和表皮的外胚层前体细胞则位于距离胚胎边缘较远的位置。因此，当我们向囊胚期胚胎移植细胞时，可以将这些细胞精准地植入预定中胚层或预定外胚层区域。但我们无法将细胞靶向到外胚层或中胚层的任何特定区域，因为我们尚不清楚。在囊胚期，胚胎的背侧位置尚未明确。提前准备好注射用培养皿：将带有成对楔形突起的塑料模具漂浮在已注入一半熔融的含有1.2%琼脂糖的胚胎培养基的培养皿中。待琼脂糖凝固后，移除模具，留下若干排三角形小孔，每个小孔的大小恰好可容纳一个胚胎。用青链霉素胚胎培养基填充移植模具，使用火焰抛光的玻璃移液管将囊胚期胚胎逐个加入每个孔中。随后将胚胎转移至移植孔中，最初使其侧向放置。排列胚胎时，将供体胚胎放置在一列，受体胚胎放置在相邻的一列。将培养皿放置在载物台上，使得移植针进入胚胎时，针头能将胚胎推向其所在孔的后壁。使用显微操作仪，以较陡的角度将移植针下降至培养皿中。理想情况下，移植针应以约45度角进入胚胎。当针尖进入胚胎培养基表面以下后，通过旋转控制汉密尔顿注射器的微米驱动装置，将少量胚胎培养基吸入针内。为了实现最精确的控制，矿物油与胚胎培养基的界面应保持在针头细锥形部分，不宜过于接近针尖。用针轻轻定位供体胚胎，然后将针回撤，并在所需位置刺入胚胎的囊胚帽区域。快速而有力地刺入可穿透胚胎，同时避免其发生滚动。缓慢而小心地将供体细胞吸入针头，以避免细胞受到剪切损伤。在吸入所需数量的细胞后，避免将卵黄吸入针头内。轻微反转压力以停止抽吸，并将针头从宿主胚胎移开以使其到位。通过移动移植培养皿，可利用移植针轻轻转动宿主胚胎，从而对其位置进行微调，但需注意避免触碰卵黄。将供体细胞注入宿主胚胎时，应避免将卵黄吸入胚胎内，否则会损伤并杀死供体细胞。单个供体胚胎的细胞可在完成细胞转移后移植至多个宿主。将供体与受体配对转移到24孔板的包被孔中继续培养。囊胚期细胞通常未定向特定命运，但原始生殖细胞是一个例外。原始生殖细胞在发育早期即被确定，并已定向为原始生殖细胞的命运状态。在发育的很早期，原始生殖细胞位于囊胚和原肠胚阶段胚胎的边缘附近。因此，如果移植实验的目标是移植原始生殖细胞，那么供体胚胎中细胞的来源位置非常重要，而细胞在宿主胚胎中的移植位置则不重要。因此，其原则是：对于体细胞而言，它们在宿主胚胎中的迁移位置将决定其命运，这一点至关重要。对于原始生殖细胞而言，它们在供体胚胎中的来源位置非常重要，因为其命运已经确定。如果目标是移植原始生殖细胞，则必须从供体胚胎的边缘区域获取这些细胞。在该发育阶段（即囊胚期或高阶段），这些细胞位于胚胎边缘附近，呈四个小簇分布，每簇由三到四个细胞组成。操作时必须格外轻柔地拾取这些细胞，以避免意外吸入卵黄。好的，我刚刚已完成上述操作，现在将转入宿主胚胎。原始生殖细胞会自行迁移并定位于所在胚胎的生殖嵴区域，因此无需将这些原始生殖细胞移植至边缘部位，它们会自主到达目标位置。因此，我只是将它们重新移植回原肠胚的任意位置。生殖细胞移植的关键——与其他类型的移植截然相反——在于供体细胞的来源位置。将细胞移植到原肠胚期的受体中，可使实验者利用斑马鱼命运图谱，该图谱在胚胎盾结构变得可见时即显现出来。可以区分不同的组织类型以及预定中枢神经系统内的各个区域。在原肠胚阶段的胚胎之间进行细胞转移时，实验方案存在一些变化，但总体步骤与将囊胚固定在载玻片上进行操作类似。首先，用移液管在玻璃凹面载玻片的凹槽内涂抹一条垂直的甲基纤维素条带，然后使用经火焰抛光的移液管加入足量的含青霉素-链霉素的胚胎培养基。选择一个供体和三个处于盾片期的宿主进行移植操作。供体胚胎应略早于宿主胚胎。需要使用一种新工具来操作胃部胶状物，即将一段短的2磅拉力钓鱼线的末端插入毛细管的末端。从而形成一个小环。用该环轻轻将供体和受体胚胎卷起，移至甲基纤维素条的顶部，并将其推入甲基纤维素中直至固定。滚动胚胎使其定位，使目标区域朝上。由于在移植过程中，针头需以切线方向进入胚胎，将供体细胞注入而不损伤卵黄。胃泡期的移植最好在固定阶段的复式显微镜下进行。使用显微操作仪的控制装置，将移植针的尖端调至焦点位置。将微量移液器支架和针头置于较浅的角度，使针头尽可能接近水平，但需以载玻片凹槽边缘允许的范围为限。接着刺入供体胚胎。如果胚胎固定得当，在移植针进入时不会发生滚动，除非胚胎过于成熟，导致针头难以顺利穿透。为避免刺破卵黄，针头应进入略深于EDL焦平面的胚胎位置。一旦刺入，可从供体中取出大量细胞，供最多三次宿主细胞注射使用。吸取细胞时，若需要，可在吸取细胞的同时移动针头，避免吸入卵黄。在将细胞注入宿主胚胎之前，可使用同一根针收集更多胚胎以获取额外细胞；在将细胞注入宿主胚胎时，应在针头穿过靶区域的过程中逐出细胞，而不是将细胞集中沉积为单一团块。此操作可提高供体细胞贡献于目标组织的可能性。完成细胞移植后，将整个载玻片放入培养皿中，并小心地用青霉素-链霉素胚胎培养基淹没。在接下来的几个小时内，甲基纤维素将逐渐溶解，释放出胚胎。移植的细胞数量取决于实验的具体目的。单个供体的细胞可在移植后的第二天早晨移植到三至四个受体中。可通过检查受体以确定供体细胞的靶向移植是否成功。将囊胚期的原始生殖细胞成功移植后，可在卵黄与卵黄延伸部分交界处的腹侧观察到荧光标记的细胞。至此，我们已向您展示了如何进行原肠胚期和囊胚期的移植操作。进行该技术操作时，为希望靶向的组织选择合适的移植方法至关重要。例如，囊胚期移植足以确定细胞是进入中胚层还是外胚层。此外，您还可以利用该技术靶向原始生殖细胞。如果希望进行更精细的定位，最好采用胃期移植技术，此时胚胎的背侧已确定。利用该技术，可将细胞靶向移植至神经系统的不同区域，特别是前脑、中脑、后脑以及脊髓。以上就是全部内容。非常感谢您的观看，祝您所有实验顺利成功。

generating-chimeric-zebrafish-embryos-by-transplantation

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

移植嵌合斑马鱼胚胎生成

斑马鱼细胞移植技术能够结合遗传学与胚胎学方法，生成组织特异性的嵌合体。本视频展示了囊胚期阶段的细胞移植操作，该技术使我们的实验室得以研究前脑联合纤维形成过程中星形胶质细胞群体及特定导向信号分子的作用。...

组织靶向胚胎嵌合体：斑马鱼原肠胚细胞移植

我们演示了一种用于生成嵌合体斑马鱼胚胎的实验方案，以在胚胎发育过程中对细胞行为进行活体成像观察。...

移植表达GFP的卵裂球用于嵌合斑马鱼胚胎视网膜和脑发育的活体成像

由于青鳉胚胎具有坚硬的卵壳和柔软的胚胎组织，其操作比斑马鱼更为复杂。本视频逐步展示了青鳉胚胎操作的各项技术，包括脱膜处理、琼脂糖包埋用于成像以及细胞移植以制备嵌合体。这些技术对于在实验室中充分利用青鳉与斑马鱼在脊椎动物基因组功能遗传解析方面的互补优势至关重要。...

青鳉胚胎去壳及用于嵌合体制备的细胞移植

关键词：青鳉，胚胎去壳，细胞移植，嵌合体，发育生物学，模式生物

本方案详细介绍了如何制备具有不同遗传背景的嵌合型斑马鱼胚胎。结合斑马鱼胚胎无与伦比的成像能力，该方法为研究目的基因的细胞自主性与非细胞自主性功能提供了极为强大的手段。...

通过手术融合发育中的囊胚生成连体斑马鱼胚胎

在不同遗传背景下对单个野生型视网膜前体细胞进行活体追踪，可评估细胞非自主性信号在神经发生过程中的作用。本文结合基因敲低、通过胚胎移植构建嵌合体以及 体内...

体内成像嵌合体斑马鱼胚胎中单个视网膜前体细胞的转基因表达以研究细胞非自主性影响

在此，我们展示了构建细胞电位报告斑马鱼品系的过程，以可视化胚胎发育、运动及斑马鱼肿瘤细胞 体内.

斑马鱼早期胚胎和肿瘤中细胞电活动的可视化

胚胎学操作（如细胞切除和移植）是研究早期发育的重要工具。本方案描述了一种简单且有效的移植装置，可用于斑马鱼胚胎的此类操作。...

一种用于斑马鱼胚胎移植的简单高效装置

本研究描述了一种模块化Tol2转基因系统方案，该方法基于Gateway克隆技术，用于构建转基因载体并将其注射到斑马鱼胚胎中。...

斑马鱼 Tol2 系统：一种基于 Gateway 的模块化与可变转基因方法

本文介绍了一种在受精后至少1至7天内的任何阶段，对斑马鱼胚胎和幼鱼进行细胞移植的实验方案，可实现高时空分辨率的移植操作。...

高分辨率细胞移植在胚胎期和幼体期斑马鱼中的应用

本文中，我们展示了一种在成年斑马鱼中进行造血干细胞移植（HCT）的方法。...

成年斑马鱼全肾髓移植

学习在囊胚期或原肠胚期移植细胞生成嵌合斑马鱼胚胎的技术。该方法利用Danio rerio研究基因功能与细胞互作，帮助区分细胞自主性与非自主性基因功能，为发育生物学和神经科学研究提供重要工具。

通过移植生成嵌合体斑马鱼胚胎

探索更多视频