移植嵌合斑马鱼胚胎生成

大家好，我是来自 Cecilia Owens 实验室的 Hillary Kemp。我是 Cecilia Owens。Hillary 和我在西雅图 Fred Hutchinson 癌症研究中心的基础科学部门工作。

今天，我们将向您展示一种制作嵌合斑马鱼胚胎的技术，也称为基因马赛克。该程序使我们能够评估发育过程中基因功能的细胞基础。我们可以询问给定的基因是否在具有称为细胞自主功能的突变表型的细胞中发挥作用，还是在称为细胞不自主的细胞环境中发挥作用。

我们通过在囊胚或早期胃阶段的野生型突变胚胎之间移植细胞来制作这些马赛克。随后，我们通过观察宿主环境中供体来源细胞的表型和基因型来评估基因功能。那么让我们开始吧。

在方案的这一部分，将谱系染料注射到供体胚胎中，以便在移植后可以跟踪供体衍生细胞的命运。使用这种技术也可以注射任何种类的核酸，但是，在与胚胎合作之前注射 DNA 时省略修饰步骤，通过在培养皿最宽的部分以 45 度角插入载玻片来准备注射皿。四分之三在笔式链球菌胚胎培养基中充满 1.2%aros。

固后取下载玻片，形成一个斜槽。用笔链球菌胚胎培养基填充槽。现在继续进行一个细胞期胚胎的酶促装饰。

将胚胎在一个细胞阶段以 0.5 毫克/毫升的浓度孵育 1 到 5 分钟。链霉蛋白酶溶液。密切监控装饰。

一旦冠状体开始明显塌陷，将胚胎浸入系统水中，这将从所有真皮中倾泻而出，胚胎留在喙曲线的底部。而且，胚胎不要再碰到水面，而且大多数胚胎都脱落了冠状体，这一点非常重要。外面有一些漩涡，但不是。

如果它的冠状体中还有任何东西，那么像这样移液它们的动作会把它们弄出来，然后释放胚胎，这样它们就不会碰到水面。使用经过火抛光以使其边缘光滑的移液器处理涂层胚胎非常重要。使用大口径火焰抛光玻璃移液器将脆弱的 dec 涂层胚胎轻轻转移到注射皿的槽中。

然后我们将单个文件加载到这个槽中。现在，胚胎已准备好使用精确校准的火焰、拉玻璃注射移液管和压力注射装置注射谱系标记。我们将使用一个装满胚胎培养基的培养皿来折断针头，用一个装满油的培养皿来校准针头。

这只是一种普通的标准实验室级矿物油。我们拿一对磨尖的制表师镊子，然后通过目镜观察以确定合适的尺寸，我们将镊子放在针的两侧，然后轻轻地折断芯片，我实际上不能不看来确定染料或核糖核苷酸的体积被输送。在开始之前。

测量一盘矿物油中的团块大小。应折断针头，以便通过微型注射器的一个或两个脉冲输送 1 纳升的推注。推注的体积可以根据目镜千分尺测量的直径计算出来。

将 1 纳升 1 至 3% 的荧光葡聚糖溶液直接注射到一到四个细胞阶段之间的包被胚胎的 ylk 中。我要做的是将胚胎放在针头的正下方。我要轻轻地将针头刺入蛋黄的中心，然后踩下脚踏板。

注射后，重要的是注射到卵黄流中，以便将染料运输到细胞中。这种注射足以在几天的发育中跟踪嵌合胚胎中的细胞。理想情况下，我们在细胞达到四个细胞阶段之前进行此作，在装满新鲜笔链球菌胚胎的涂层培养皿中以低密度培养注射的胚胎。中等。

请注意，注射胚胎的发育速度往往略慢，在不同的温度（25、28 和 31 摄氏度）下孵育胚胎，以错开其发育并最大限度地延长可以进行移植的时间窗口。用于斑马鱼囊胚细胞移植的装置由一个驱动控制的 Hamilton 注射器组成，该注射器通过三通旋塞连接到矿物油储液器和微量移液器支架上，通过一段软管。消除系统中的所有气泡，因为它们会破坏您控制吸力和压力的能力。

使用具有至少 DX 放大倍率的高质量光学元件的体视显微镜。为了控制微量移液器支架和针头的位置，我们建议使用 NARA shige 手动微量作器。确保使用磁性底座将其固定在工作台上，以防止振动转移到移植物上。

针状移植针由玻璃毛细管移液器制成，这些移液管在电极极性上被拉至柔和的锥度。有关在解剖显微镜下拉动移液器的详细信息，请参阅 Miriam Goodman 实验室的 JoVE 协议，将拉出的针头尖端折断。对于囊胚期移植，针头的外径应约为 50 至 60 微米或 30 至 40 微米（用于胃阶段移植）。

为了提高渗透性，需要先使用微草料在针头末端拉出锋利的倒钩，将针尖靠近微锻造的细丝，使其光滑。然后转动针头，使斜面的前缘可以与细丝接触。一旦针的前缘接触到细丝，迅速将其拉开以形成倒钩。

为避免损坏细胞，倒钩应笔直，针尖不应弯曲准备好钻机和移植针，您就可以制作嵌合胚胎了。囊胚移植用于在不需要精细命运图信息时在胚胎之间移植细胞。除了原始生殖细胞外，大多数细胞在这个阶段通常不会决定命运。

囊胚的命运图是这样的，我们可以区分将产生外胚层的细胞和将产生中胚层的细胞。中胚层和内胚层位于囊胚期胚胎的边缘附近，而将产生神经系统和表面真皮的真皮祖细胞则位于离胚胎边缘更远的地方。因此，当我们将细胞移植到囊胚期胚胎中时，我们可以将这些细胞靶向推定的中胚层或推定的外胚层。

但是我们不能将细胞靶向外胚层或中胚层的任何特定区域，因为我们不知道。在胚胎背面所在的囊胚阶段，通过在培养皿中漂浮带有成对楔形突起的塑料模具来提前准备注射皿，培养皿中一半装满胚胎培养基中的熔融 1.2%aros。一旦 aros 凝固，取出模板，留下一排排三角形的孔，每个孔的大小刚好足以容纳一个胚胎。

用笔链球菌胚胎培养基填充移植模具，并用火焰抛光玻璃移液器将囊胚期胚胎单独加载到每个孔中。现在将胚胎转移到移植井中，最初让它们侧卧。排列胚胎，使供体胚胎放置在一列下，宿主胚胎放置在相邻列的下。

将培养皿放在载物台上，以便当移植针进入胚胎时，针将胚胎推向其孔的后壁。使用微型纵器，以相当陡峭的角度将移植针放入培养皿中。理想情况下，移植针应以大约 45 度角进入胚胎。

一旦针尖低于胚胎培养基的表面，通过扭转控制 Hamilton 注射器的千分尺驱动器，将少量胚胎培养基吸入针头中。为了最精确的控制，矿物油和胚培养基之间的界面应保持在针头的薄锥形部分，不要太靠近末端。用针头轻轻定位供体胚胎，然后将针头拉回并在所需位置进入胚胎的囊胚帽。

快速的重击会穿透胚胎而不会导致它滚动。缓慢而小心地将供体细胞吸入针头中，以避免剪切细胞。避免在所需数量的细胞被吸收后将蛋黄向上吸入针头中。

稍微反转压力以停止抽吸并将针头从宿主胚胎就位处取下针头。通过移动移植皿，只要注意不要接触蛋黄，就可以用移植针轻轻转动宿主胚胎，对宿主胚胎的位置进行小幅调整。将供体细胞排出到宿主胚胎中时，避免将 ylk 向上带入胚胎，因为这会损坏和杀死来自单个供体胚胎的供体细胞，在细胞转移完成后可以移植到多个宿主。

将供体宿主对转移到 24 孔板的包被孔中以继续显影。细胞在囊胚阶段不被赋予特定命运的规则的一个例外是原始生殖细胞。原始生殖细胞在发育的早期就被指定，并致力于其原始生殖细胞状态的命运。

从非常早期开始，原始生殖细胞就位于囊胚和 gast 期胚胎的边缘附近。因此，如果移植实验的目标是移植原始生殖细胞，那么细胞在供体胚胎中的来源非常重要，而它们进入宿主胚胎的哪个位置并不重要。所以规则是，对于体细胞来说，它们在宿主胚胎中的去向很重要，这将决定它们的命运。

对于原始生殖细胞，它们在供体胚胎中的来源很重要，因为它们的命运已经确定。如果目标是移植原始生殖细胞，那么，需要从供体胚胎的希望边缘拾取细胞，它们位于胚胎边缘附近，在这个片上，每个细胞有三个或四个细胞的四个小簇，这个矛状阶段或发育高阶段。而且你必须非常小心地拿起它们，以免不小心开始吸吮蛋黄。

好的，这就是我在那里所做的，现在我要转向寄主胚胎。现在，原始生殖细胞将磨练到它们所在的任何胚胎的生殖器脊区域。因此，没有必要将这些原始生殖细胞移植到它们自己到达那里的边缘。

所以我只是把它们移植回任何旧的地方，放回胚胎后。生殖细胞移植的关键与任何其他类型的移植完全相反，它的关键在于供体细胞的来源很重要。将细胞移植到胃阶段宿主中，实验者可以利用胚胎盾牌可见时出现的斑马斑马鱼命运图。

可以区分不同的组织类型以及假定的中枢神经系统内的结构域。在胃列表阶段在胚胎之间转移细胞时，协议会有一些变化，但一般程序类似于使用 blastos 安装胃。首先在玻璃凹陷玻片的凹陷处涂抹一条垂直的甲基纤维素条带，然后使用火抛光移液器转移液用大量的笔链球菌胚胎培养基淹没。

一个供体和三个盾牌阶段宿主到凹陷滑坡。选择比宿主略年轻的供体胚胎。需要一种新工具来纵胃胶，将一根两磅短的测试钓鱼线的末端插入毛细管的末端。

从而形成一个小循环。使用环轻轻地将供体和宿主胚胎卷到甲基纤维素条的顶部，然后将它们塞入甲基纤维素中直至固定。将它们滚动到位，使目标区域位于最上方。

由于在移植过程中，针头会切向进入胚胎以输送供体细胞而不会损坏 ylk。胃阶段移植最好在固定阶段复合显微镜上进行。使用微型纵器的控件使移植针的尖端聚焦。

将微量移液器支架和针头放置在相当浅的角度，使针头在载玻片上凹陷边缘允许的情况下尽可能接近水平。接下来刺穿供体胚胎。如果安装得当，它不会在移植针进入时滚动，除非胚胎太老而无法让针头轻易穿透。

为避免刺穿 ylk，针头应在比 EDL 焦平面稍深的焦平面进入胚胎。穿刺后，可以从供体中取出大量细胞，最多可注射 3 次宿主细胞。抽取细胞时，如果需要，在细胞被吸收时移动针头，避免吸起蛋黄。

在将细胞喷射到宿主中之前，可以使用同一针头为更多细胞收获额外的胚胎，在细胞喷射到宿主胚胎中时，当针头穿过目标区域时，将细胞排出，而不是将细胞沉积在单个团块中。这将增加供体细胞对所需组织做出贡献的可能性。细胞转移完成后，将整个载玻片放入培养皿中，并小心地用笔链球菌胚胎淹没。中等。

在接下来的几个小时内，甲基纤维素会溶解并释放胚胎。转移的细胞数量取决于实验的具体目标。来自单个供体的细胞可以在移植后的早晨移植到三个或四个宿主中。

可以检查宿主以确定供体细胞靶向是否成功。从囊胚胚龄成功移植原始生殖细胞导致荧光标记的细胞，腹侧位于 ylk 和 ylk 延伸之间的交界处附近。我们刚刚向您展示了如何进行原肠胚和囊胚期移植。

在进行这项技术时，重要的是要为您希望用细胞靶向的目标组织选择正确的移植方法类型。因此，囊胚期移植足以确定细胞进入真皮与外胚层。您还可以使用此技术来靶向原始生殖细胞。

进行更精细的标测，最好在已经确定背侧的情况下使用胃龄移植。因此，通过这项技术，您可以将细胞靶向神经系统的各个部分，特别是前脑、中脑、后脑和脊髓。就是这样。

非常感谢您的观看，祝您所有的实验好运。