斑马鱼早期胚胎和肿瘤细胞电活动的可视化研究

该程序的总体目标是创建转基因斑马鱼系，允许在胚胎发生、幼虫运动和肿瘤发生过程中观察细胞电变化。这种方法可以帮助回答发育生物学、生理学和癌细胞生物学领域的关键问题，例如细胞电信号在胚胎发生过程中和肿瘤细胞中的基本作用是什么？这种技术的主要优点是它允许我们在体内实时跟踪细胞电信号。

根据文本方案制备 Tol2 转座酶 mRNA 和注射液后，在注射前的下午，设置四到六个繁殖池，至少有两只雄性和两只雌性。为了减少鱼类废物的数量并诱导繁殖反应，请避免在下午喂鱼。第二天早上，从零下 80 摄氏度的冰箱中取出准备好的注射液，并将其放在冰上。

拉动鱼类养殖箱中的隔板，让鱼交配。一般来说，鱼会在 20 到 30 分钟内产卵。等待时，使用具有以下参数的微量移液器拉拔器，从毛细管玻璃中拉出针头。

使用实验室擦拭布打破针头的末端并形成斜边。较小的直径是降低胚胎死亡率的首选。鱼产卵后，将它们收集在直径为 10 厘米的培养皿中。

立即在解剖显微镜下，去除所有异常胚胎和鱼类废物。然后将受精胚胎移液到准备好的 3% 琼脂糖注射模具中。去除多余的水以帮助将胚胎保持在原位。

一旦所有行都充满了活的胚胎，将它们排列起来，使单个细胞都相对于针头水平 45 度角。这将使以后的注射变得更加容易。接下来，戴上手套，使用 20 微升加载移液器吸头从冰上的试管中取出 5 微升准备好的构建体。

小心地将移液器吸头插入破损的毛细管后端，使其开始逐渐变细，使试剂尽可能靠近吸头并将其排入毛细管中。如果仍有气泡，请摇晃针头，确保不要折断针头。将针头径直插入微量注射针架，并小心拧紧，直到针头保持在原位。

然后将角度调整到大约 45 度。准备好针头并连接后，打开显微镜和气压罐。通过使用大约 0.5 PSI 的保持和 30 PSI 的喷射来调整注射体积。

检查踩下踏板时溶液是否从针头中弹出。使用装有一滴矿物油的载物台千分尺，将溶液的体积和流量调整至直径约 10 微米。确保背压允许少量溶液从针头中滴出。

如果背压不足，毛细管作用将导致液体进入针头并破坏 mRNA。校准针头后，使用凝胶缺口的边缘将针头插入受精胚胎的单个细胞中，以提供支撑，将胚胎保持在原位，并允许针头在不移动胚胎的情况下施加压力。一旦针尖进入单个细胞，踩下踏板以释放所需量的溶液。

重要的是将溶液注入细胞中，而不是卵黄中，以产生转基因斑马鱼。对所有胚胎重复此过程。完成后，使用一次性 3.4 毫升移液管和鱼系统水将注射的胚胎从琼脂糖缺口冲洗出来，将其转移到标记的培养皿中。

将胚胎存放在 28.5 摄氏度的培养箱中，让它们发育。全天回来检查以去除死鱼胚胎，并用鱼水中 0.1% 亚甲蓝代替水。注射后约 6 到 8 小时，使用 10 个注射的鱼胚胎和 hotshot 方法制备基因组 DNA。

第二天早上，使用带有荧光光源的解剖显微镜分选出在非卵黄组织中显示 GFP 的胚胎。这些胚胎应包含注射的构建体。如前所述，进行 Tol2 切除测定以检查转座子活性。

如果可以检测到切除的血浆，请保留注射的鱼胚胎并饲养它们。否则，重复 Tol2 mRNA 合成和微量注射过程，直到 Tol2 excise 测定获得阳性结果。为了对斑马鱼胚胎进行成像，将多个 F2 代创始鱼与野生型鱼单独成对杂交。

根据斑马鱼分期指南收集处于不同所需发育阶段的鱼胚胎。对于鱼系统水中的早期鱼胚胎，在解剖镜下，用一把镊子小心地去皮并去除绒毛膜。使用一次性移液管将一些胚胎转移到含有 3% 甲基纤维素的凹形载玻片中。

然后在解剖镜下使用针头，将胚胎调整到所需位置以查看细胞 GFP 活性。对于小于 12 体节阶段的胚胎，使用带有兼容相机和软件的落射荧光复合显微镜进行成像。对于超过 12 体节阶段的胚胎，使用荧光解剖显微镜。

要对肿瘤细胞电压进行成像，首先要识别患有恶性周围神经鞘瘤或 MPNST 的鱼。将鱼放入直径为 10 厘米的培养皿中，并进行整片成像。最后，在成像后，在查看肿瘤细胞电活动之前解剖出肿瘤。

在成功的注射中，超过 50% 的注射胚胎将在体细胞中显示一定程度的 GFP，并且其中大多数将在 Tol2 转座子切除测定中显示出阳性结果。在这里，检查了斑马鱼早期胚胎发育过程中整个细胞周期的膜电位变化。从这个延时视频中可以看到，细胞在形成卵裂沟之前发生了超极化。

此外，不同的组织在 1 至 3 日龄的鱼胚胎中表现出多种膜电位。例如，与邻近组织和器官相比，体节和 notocord 通常是超极化的。在这个两天大的鱼胚胎中，神经肌肉电活动在运动过程中显示，颜色密度变化对应于电信号转导。

在具有易发生自发性 MPNST 的 RPL35 突变体的 ASAP1 报告鱼杂交的胚胎中检查癌细胞的生物电特性。与周围组织相比，肿瘤细胞更加两极分化。一旦掌握，如果执行得当，这种显微注射技术可以在大约三个小时内完成。

在尝试此程序时，重要的是要记住斑马鱼胚胎应该处于一个细胞阶段以获得理想的结果。随着它的发展，这项技术为发育生物学和细胞生物学领域的研究人员探索斑马鱼和其他模式生物体内的电信号变化铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何通过显微注射创建转基因斑马鱼系有了很好的了解。