斑马鱼早期胚胎和肿瘤中细胞电活动的可视化

本实验的总体目标是构建一种转基因斑马鱼品系，使其能够在胚胎发育、幼体运动以及肿瘤发生过程中观察细胞电学变化。该方法有助于回答发育生物学、生理学和癌症细胞生物学领域中的一些关键问题，例如：细胞电信号在胚胎发育和肿瘤细胞中的基本作用是什么？该技术的主要优势在于，它能够让我们在活体中实时追踪细胞电信号活动。

根据文本方案制备 Tol2 转座酶 mRNA 和注射溶液后，在注射前一日下午，设置四到六个繁殖缸，每缸至少放入两条雄鱼和两条雌鱼。为减少鱼类排泄物并诱导繁殖反应，下午不要喂食。次日早晨，从零下 80 摄氏度冰箱中取出已制备的注射溶液，并置于冰上。

拉开鱼繁殖缸中的隔板，让鱼进行交配。通常情况下，鱼会在20至30分钟内产卵。在等待期间，使用具有以下参数的微电极拉制仪，从毛细玻璃管中拉制针头。

使用实验室擦拭纸折断针头末端，形成斜面边缘。为降低胚胎死亡率，宜选用直径较小的针头。鱼类产卵后，将其收集至直径10厘米的培养皿中。

在解剖显微镜下立即移除所有异常胚胎和鱼类排泄物。然后用移液器将受精胚胎转移至预先准备好的3%琼脂糖注射模具中。去除多余水分以帮助固定胚胎位置。

当所有行都填入有活力的胚胎后，调整其位置，使单细胞相对于注射针水平方向呈45度角。这将使后续的注射操作更加容易。接下来，在佩戴手套的情况下，使用20微升上样移液器吸头从冰上的离心管中吸取5微升已制备好的构建物。

将移液器吸头小心插入断裂的毛细管后端，直至其开始变细的部位，使试剂尽可能接近尖端，然后将其排入毛细管中。如果仍有气泡，轻轻振荡针头，注意不要折断尖端。将针头笔直插入显微注射针头夹持器中，并小心拧紧，直至针头固定不动。

然后将角度调整至约45度。针头制备并安装完毕后，打开显微镜和气体压力罐。通过调节压力来控制注射体积，持针压力约为0.5 PSI，喷射压力为30 PSI。

按下踏板时，检查溶液是否能从针头中喷出。使用带有矿物油液滴的载物台测微尺，将溶液的体积和流速调整至直径约10微米。确保背压使少量溶液从针头滴出。

如果背压不足，毛细作用会导致液体进入针尖并破坏mRNA。针尖校准后，利用凝胶切口的边缘作为支撑，将针插入受精胚胎的单个细胞中，以固定胚胎位置，使针尖施加压力时胚胎不会移动。当针尖进入单个细胞后，踩下脚踏板，释放所需量的溶液。

为了获得转基因斑马鱼，必须将溶液注射到细胞中而非卵黄内。对所有胚胎重复此操作。完成后，使用一次性3.4毫升移液管，配合斑马鱼系统用水，将注射后的胚胎从琼脂糖凹槽中冲洗出来，并转移至已标记的培养皿中。

将胚胎置于28.5°C的培养箱中孵育，使其发育。在当天不同时段定期检查，移除死亡的鱼胚胎，并用含0.1%亚甲蓝的鱼水更换培养液。注射后约6至8小时，取10条已注射的鱼胚胎，采用Hotshot法提取基因组DNA。

次日早晨，使用带有荧光光源的解剖显微镜筛选在非卵黄组织中显示 GFP 荧光的胚胎。这些胚胎应含有已注射的构建体。按照之前所述方法进行 Tol2 切除实验，以检测转座子活性。

如果能够检测到切除的质粒，则保留已注射的鱼胚胎并进行培育。否则，重复 Tol2 mRNA 合成和显微注射过程，直至 Tol2 切除检测获得阳性结果。为观察斑马鱼胚胎，将多条 F2 代 Founder 鱼分别与野生型鱼进行单对交配。

根据斑马鱼发育分期指南，收集处于不同目标发育阶段的鱼胚胎。在解剖显微镜下，将早期鱼胚胎置于鱼系统水中，用一对镊子小心剥离并去除卵膜。使用一次性转移移液管将少量胚胎转移至含有3%甲基纤维素的凹面载玻片中。

然后在解剖显微镜下用针将胚胎调整至所需位置，以观察细胞内的GFP活性。对于少于12个体节阶段的胚胎，使用配备兼容相机和成像软件的落射荧光复合显微镜进行成像；对于超过12个体节阶段的胚胎，则使用荧光解剖显微镜。

为了成像肿瘤细胞的电压，首先鉴定患有恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的斑马鱼。将斑马鱼放入直径为10厘米的培养皿中，进行整体成像。最后，在成像完成后，解剖取出肿瘤，以观察肿瘤细胞的电活动。

在成功的显微注射中，超过50%的注射胚胎将在体细胞中表现出一定程度的绿色荧光蛋白（GFP）表达，且大多数胚胎在Tol2转座子切除实验中呈现阳性结果。本研究观察了斑马鱼早期胚胎发育过程中细胞周期各个阶段的膜电位变化。如该延时视频所示，细胞在分裂沟形成之前发生超极化。

此外，不同组织在一至三日龄的鱼胚胎中表现出多种膜电位。例如，与相邻的组织和器官相比，体节和脊索通常处于超极化状态。在此两天龄的鱼胚胎中，运动期间的神经肌肉电活动通过颜色密度的变化反映出来，该变化对应于电信号转导。

通过将ASAP1报告基因鱼与易发生自发性恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的RPL35突变体鱼杂交，对其胚胎中的癌细胞生物电特性进行了检测。与周围组织相比，肿瘤细胞的极性更强。若操作熟练，该显微注射技术在正确实施的情况下约需三小时即可完成。

进行该操作时，重要的是要记住，斑马鱼胚胎应处于单细胞阶段，以获得理想结果。随着该技术的发展，将为发育生物学和细胞生物学领域的研究人员探索斑马鱼及其他模式生物体内电信号变化提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过显微注射创建转基因斑马鱼品系。