Name: 斑马鱼早期胚胎和肿瘤细胞电活动的可视化研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学习利用转基因斑马鱼技术实时追踪胚胎发育与肿瘤细胞中的电信号变化。该方法为发育生物学和癌症研究提供了重要的活体成像工具。

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本出版物中报告的研究工作由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所资助，资助编号为 R35GM124913，同时得到普渡大学 PI4D 激励计划以及普渡大学兽医学院内部竞争性基础研究基金项目的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表资助机构的官方观点。我们感谢 Koichi Kawakami 提供 Tol2 载体，Michael Lin 提供 ASAP1 载体，以及 Leonard Zon 通过 Addgene 提供的 ubi 启动子载体。

斑马鱼饲养在经AAALAC认证的动物实验设施中，所有实验均按照普渡大学动物护理与使用委员会（PACUC）批准的方案进行。
1. Tol2 转座子质粒构建体制备
注意：Tol2 是一种在青鳉鱼中发现的转座子，已在斑马鱼研究领域得到广泛应用8,9。该系统已成功整合到基于 Gateway 位点特异性重组的克隆系统中，被称为 Tol2 工具包10。Tol2 工具包能够更便捷地构建定制表达载体，同时提高转基因效率。因此，采用该系统并利用已验证的泛素启动子驱动 ASAP1 表达，建立一种普遍表达 ASAP1 的斑马鱼品系，是一个顺理成章的选择11。
<ol>
	<li>创建一个中间载体 ASAP1 构建体：pDONR221-ASAP1
	<ol>
		<li>获取基因编码的电压传感器 ASAP1 构建体，&#160;pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1（质粒编号#52519），来自Addgene。为扩增ASAP1编码区，使用在引物5'端带有attB序列的定制引物（attB1-ASAP1F和attB2-ASAP1R）进行PCR扩增图1). 选择Phusion DNA聚合酶因其具有高扩增效率，并根据先前发表的实验方案优化了PCR反应条件12.</li>
		<li>将50 µL PCR产物使用带200 µL吸头的常规移液器加入1% TAE琼脂糖凝胶中，在水平电泳槽中以160 V电压电泳约30分钟。</li>
		<li>在353 nm紫外透射仪下观察凝胶，参照先前发表的方法，在紫外透射仪下使用刀片或解剖刀切下目标条带13,14并将含有DNA的凝胶样品放入干净的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>对ASAP1的PCR产物进行凝胶纯化。使用商品化的DNA凝胶回收试剂盒，按照制造商说明书回收切下的凝胶中的DNA，并用20 µL水洗脱DNA。取1 µL样品，使用分光光度计测定DNA浓度。以水作为空白对照，按照软件操作说明进行测定15.</li>
		<li>取100 ng纯化的PCR产物与150 ng pDONR221质粒，在10 µL TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA pH 8.0）中混合16加入2 µL BP Clonase II，室温孵育过夜。</li>
		<li>第二天，向反应体系中加入1 µL蛋白酶K，37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>进行转化。将反应物转移并与50 µL Top10感受态细胞混合 E. coli 细胞并在冰上孵育30分钟。然后将反应管转移至42 °C水浴中1分钟。立即取出试管，再于冰上孵育2分钟。接着将试管放入37 °C摇床中，孵育1小时。</li>
		<li>取出离心管，将细胞接种于含卡那霉素的LB平板上。随后，在37 °C条件下倒置培养平板过夜（16–18 h）。</li>
		<li>挑取单个且分离良好的菌落，接种于含3 mL LB培养基的14 mL细胞培养管中。在37 °C摇床中以250 rpm（每分钟转数）的转速振荡培养过夜。</li>
		<li>使用商业质粒小提试剂盒，按照其说明书进行质粒小提17.</li>
		<li>使用 M13F 和 M13R 测序引物对 3-4 个质粒进行 Sanger 测序，以鉴定含有 pDONR221-ASAP1 的阳性克隆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建用于显微注射的 Tol2 载体：pDestTol2-ubi-ASAP1
	<ol>
		<li>选择经测序验证的 pDONR221-ASAP1 克隆，并使用分光光度计测定其 DNA 浓度&#160;使用水作为空白对照的软件操作说明15.</li>
		<li>取100 µg pDONR221-ASAP1，与100 µg Tol2试剂盒5'端质粒（pENTR5'_ubi，Addgene #27320）、100 µg p3E-polyA（Tol2试剂盒#302）以及150 µg pDestTol2pA2（Tol2试剂盒#394）混合。在1.5 mL微量离心管中用TE缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 8.0）调节总体积至8 µL，并通过短暂涡旋2–5秒充分混匀。随后加入2 µL LR Clonase II Plus，于室温孵育过夜。</li>
		<li>第二天，使用10 µL移液器向反应体系中加入1 µL蛋白酶K，37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>按照上述方法进行转化并鉴定阳性克隆（步骤1.1.7-11）。</li>
		<li>测定经测序验证的 pDestTol2-ubi-ASAP1 克隆的 DNA 浓度（图1B使用分光光度计15通常浓度约为200 ng/µL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备 Tol2 转座酶 mRNA 和注射溶液
<ol>
	<li>使用无菌接种环将含有 pCS2FA-转座酶质粒（Tol2 试剂盒 #396）的 E. coli 甘油菌株划线接种于 LB 琼脂平板（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）上。将平板置于 37 °C 培养箱中过夜培养。次日，挑取单个菌落，使用无菌的 10 µL 移液枪头将其接种至 3 mL LB 液体培养基（含 100 µg/mL 氨苄青霉素）中，在 37 °C 摇床中以 250 rpm 振荡培养过夜。</li>
	<li>使用商业质粒小提试剂盒，按照说明书对 E. coli 培养物进行质粒提取。以 14,000 rpm 离心 1 分钟，将质粒 DNA 洗脱至 30–50 µL TE 缓冲液中，并使用&#160;分光光度计测定 DNA 浓度。</li>
	<li>使用 Not I 限制性内切酶对 1–2 µg 质粒进行线性化处理，随后按照说明书使用 DNA 纯化试剂盒对经 Not I 消化后的 DNA 进行纯化。以 14,000 rpm 离心 1 分钟，将 DNA 洗脱至 5 µL 水中。预期浓度约为 200–300 ng/µL。</li>
	<li>以经 Not I 线性化的 pCS2FA-转座酶质粒作为 DNA 模板，使用商业 SP6 体外转录试剂盒进行体外转录反应。</li>
	<li>反应完成后，按照生产商说明书使用商业 RNA 纯化试剂盒纯化 Tol2 转座酶 mRNA。最后将 mRNA 洗脱至 20 µL 无 RNA 酶的水中，并使用分光光度计测定 RNA 浓度。预期浓度约为 1–3 µg/µL。如需长期保存，可将样品置于 -80 °C 超低温冰箱中。</li>
	<li>在微量离心管中，通过移液将 20 ng/µL 的 pDestTol2-ubi-ASAP1 与 Tol2 转座酶 mRNA（100 ng/µL）混合，配制显微注射溶液。为避免因反复冻融导致核酸降解，可将溶液分装为每管 6 µL，储存于 -80 °C 超低温冰箱中以备后续使用。</li>
</ol>
3. 显微注射
<ol>
	<li>在注射前一个下午设置4-6个繁殖缸，每缸至少放入2条雄鱼和2条雌鱼。这些鱼在下午不要喂食。此步骤可减少鱼类排泄物，节省第二天早晨清理时间，同时有助于诱导产卵反应。</li>
	<li>次日早晨，从-80 °C冰箱中取出预先准备好的注射溶液（pDestTol2-ubi-ASAP1质粒和Tol2 mRNA），并置于冰上。</li>
	<li>移除繁殖缸中的隔离板，让鱼进行交配。通常情况下，移除隔离板后20-30分钟内鱼会产卵。若未产卵，可再等待1-2小时。部分鱼可能完全不产卵，在此情况下需重复实验以收集鱼胚胎。</li>
	<li>等待期间，确保已准备好针头，使用镊子以一定角度折断针尖，形成斜面边缘，或在精细擦拭纸上折断。
	<ol>
		<li>使用显微拉针仪从毛细玻璃管拉制针头，参数设置如下：加热545；拉力60；速度80；时间250；压力500。在解剖显微镜下（使用目镜标尺估算直径），用镊子以约45°角夹住针头并折断。所需针头直径可根据显微注射仪设置而变化，但较小直径更佳，有助于降低胚胎死亡率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鱼产卵后，将卵收集至直径10 cm的培养皿中，并转移至解剖显微镜下。去除所有异常胚胎和鱼排泄物。</li>
	<li>用移液器将受精胚胎转移至预先准备的3%琼脂糖注射模具中。去除多余水分，以帮助固定胚胎位置。</li>
	<li>当所有行均被有活力的胚胎填满后，调整其排列方向，使所有单细胞朝向同一方向面对针头，水平方向约呈45°角。这将使后续注射操作更加容易。</li>
	<li>戴手套后，使用20 µL上样移液枪头，从冰上的管中吸取5 µL预先准备的构建物溶液。</li>
	<li>小心将枪头插入折断的毛细管后端，直至其开始变细处，以使试剂尽可能靠近针尖。若仍有气泡，轻轻晃动针头，注意不要折断针尖。</li>
	<li>将针头垂直插入显微注射针头夹持器中，小心拧紧直至针头固定不动。调整针头角度至约45°。</li>
	<li>针头准备并安装完毕后，打开显微镜和气体压力罐。商用CO2气罐通常适用于此目的。注射体积通过维持压力和喷射压力调节：维持压力约0.5 psi，喷射压力约30 psi。务必检查踩下脚踏开关时是否有溶液排出。</li>
	<li>使用带有矿物油液滴的载物台测微尺，调节溶液流出的体积和流速，使其直径约为150 µm（约2 nL）。确保背压能使少量液体从针尖缓慢滴出。若背压不足，毛细作用会导致液体进入针内，破坏mRNA。</li>
	<li>针头校准完成后，开始将构建物注射入受精胚胎的单细胞中。 
	注意：由于细胞膜较难刺穿，此步骤需要大量练习、耐心和精细操作。为获得转基因斑马鱼，必须将溶液注入细胞内而非卵黄中，这与吗啉代寡核苷酸注射不同。只要构建物进入细胞，针头从哪一侧进入细胞并不重要。若将溶液注入卵黄而非细胞，转基因成功率将极低。必须在单细胞阶段进行注射，否则会产生体细胞嵌合体鱼，从而降低转基因进入生殖细胞的可能性。</li>
	<li>利用凝胶凹槽边缘作为支撑，固定胚胎位置，使针头施加压力时胚胎不会移动。当针尖进入单细胞后，踩下脚踏开关释放所需量的溶液。对所有胚胎重复此过程。</li>
	<li>注射完成后，用鱼用系统水和一次性3.4 mL移液管冲洗出琼脂糖凹槽中的胚胎，转移至标记好的培养皿中。将胚胎置于28.5 °C培养箱中培养发育。全天定期检查，移除死亡胚胎，并用含0.1%亚甲蓝的鱼用水更换培养液。</li>
	<li>注射后约6-8小时，取10个单独的注射胚胎，采用Hotshot法提取基因组DNA18。</li>
	<li>次日早晨，使用配备荧光光源的解剖显微镜筛选出非卵黄组织中显示GFP荧光的胚胎。这些胚胎应含有已注射的构建物。</li>
	<li>进行Tol2切除实验以检测转座子活性，方法如前所述19。若能检测到切除的质粒，则保留注射后的胚胎并继续培育。若无法检测到切除的质粒，则需重复Tol2 mRNA合成及显微注射过程，直至Tol2切除实验获得阳性结果。</li>
</ol>
4. 建立转基因 ASAP1 鱼株 Tg(ubi:ASAP1)
<ol>
	<li>按照斑马鱼手册中先前所述的方法，将显微注射后的鱼（F0 代）培育至成年20。该过程通常需要约 4 个月。</li>
	<li>选取一条成年 F0 鱼，与一条性别相反的野生型鱼进行交配。在当天晚些时候收集受精卵。将收集到的鱼胚胎置于含 0.1% 亚甲蓝的鱼水中，在 28.5 °C 的培养箱中培养。</li>
	<li>在第三天，使用配备 GFP 滤光片的荧光体视显微镜观察鱼胚胎。若存在绿色荧光的鱼胚胎，则将其挑选出来，并作为 F1&#160; 代转基因鱼 Tg(ubi:ASAP1) 培育至成年。 
	注意：由于大多数亲代 F0 鱼为生殖系遗传嵌合体，因此不会符合孟德尔分离比。</li>
	<li>将单条 F1 代成年鱼与野生型鱼交配并收集鱼胚胎。挑选出绿色荧光的鱼胚胎，并将其培育至成年，获得 F2 代鱼。 
	注意：若仅含有单个转基因，则绿色与非绿色鱼胚胎的比例应接近 1:1。</li>
	<li>为观察类似恶性外周神经鞘瘤（MPNST）等肿瘤中的电势变化，可将 F2 代 Tg(ubi:ASAP1) 鱼与 rpl35hi258/wt 鱼进行杂交。已知在 6 至 8 月龄的成年鱼中开始出现可见肿瘤21,22。</li>
</ol>
5. 成像
<ol>
	<li>为了成像斑马鱼胚胎，选取多个F2代创始人鱼，分别与野生型鱼进行配对交配。根据斑马鱼发育阶段指南23，收集处于不同目标发育阶段的鱼胚胎。</li>
	<li>对于早期阶段的鱼胚胎，在直径为10 cm的培养皿中，使用解剖显微镜和镊子小心剥离并去除胚胎的绒毛膜。</li>
	<li>使用3.4 mL一次性移液管，将少量鱼胚胎转移至含有3%甲基纤维素的凹面载玻片上。在荧光解剖显微镜下，用针调节胚胎至所需位置，以观察细胞内的GFP活性。</li>
	<li>对于运动阶段的鱼胚胎（大于12体节期），在转移至载玻片前，使用0.05%甲磺酸三卡因对胚胎进行麻醉。简言之，将鱼胚胎浸入含0.05%甲磺酸三卡因的鱼水中，直至其停止游动并丧失身体平衡。同时，在载玻片上的甲基纤维素中加入一滴0.05%甲磺酸三卡因。</li>
	<li>对于小于12体节期的鱼胚胎，使用配备兼容相机和软件的落射荧光复合显微镜进行成像；对于大于12体节期的鱼胚胎，则使用荧光解剖显微镜。</li>
	<li>为了成像肿瘤细胞电压，首先识别患有MPNST肿瘤的鱼，然后用0.05%甲磺酸三卡因麻醉该鱼。对于整体成像，将鱼放入直径为10 cm的培养皿中。如需观察肿瘤细胞的电活动，可在整体成像后将肿瘤组织解剖取出。</li>
</ol>

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<li>Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+in+cell+cycle+and+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+Series+B%22%5BJournal%5D)">Potassium channels in cell cycle and cell proliferation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094(2014).</li>
<li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Imaging+of+Voltage+and+Calcium+Signals+Reveals+Neural+Processing+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li>
<li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管胚胎发育和人类疾病过程中的细胞与组织水平电活动早在很久以前就被发现， 体内 动态电学变化及其生物学作用在很大程度上仍不清楚。其中一个主要挑战在于如何可视化并量化这些电学变化。膜片钳技术在追踪单个细胞方面具有突破性意义，但其在脊椎动物胚胎中的应用受到限制，因为胚胎由大量细胞组成。目前使用的化学电压染料也存在不足，主要表现为灵敏度、特异性和毒性方面的问题。近年来在基因编码电压指示剂（GEVIs）研发方面的努力，为我们提供了可视化细胞电活动的新途径。 体内 并实时观察。在此，我们展示了创建斑马鱼电活动报告基因品系 Tg(ubi:ASAP1
利用这种报告基因鱼系，我们展示了可以在斑马鱼胚胎中监测到的细胞电活动。细胞膜电位的变化与早期胚胎发育过程中的细胞周期密切相关。我们观察到，在卵裂沟形成/细胞分裂之前会发生超极化现象（图3），这与目前普遍认为在细胞分裂前发生去极化的观点相反26。因此，其他动物和人类&#160;细胞在细胞周期...

生物电是指由细胞膜上的离子通道和离子泵介导的内源性电信号1细胞膜上的离子交换及其伴随的电位和电流变化，对可兴奋的神经细胞和肌肉细胞的信号传导过程至关重要。此外，生物电和离子梯度还具有多种其他重要生物学功能，包括能量储存、生物合成以及代谢物的转运。生物电信号还被发现可调控胚胎模式形成，如体轴建立、细胞周期以及细胞分化。1因此，理解此类信号通路的异常调控对认识许多人类先天性疾病至关重要。尽管膜片钳技术已被&#160;广泛用于记录单个细胞，但在胚胎发育过程中同时监测多个细胞方面仍远未达到理想状态 体内此外，电压敏感的小分子也并非理想选择 体内 因其特异性、敏感性和毒性而具有应用价值。
多种基因编码的荧光电压指示剂（GEVIs）的开发为解决这一问题提供了新机制，并使得研究胚胎发育过程变得更加便捷，尽管这些指示剂最初是为监测神经细胞而设计的2,3。目前可用的GEVIs之一是动作电位加速传感器1（ASAP1）4。ASAP1由电压敏感磷酸酶的电压感应结构域的一个胞外环和一个环状重排的绿色荧光蛋白组成。因此，ASAP1能够可视化细胞电势的变化（极化状态：亮绿色；去极化状态：暗绿色）。ASAP1具有2 ms的响应和恢复动力学，可追踪亚阈值电位变化4。因此，这一遗传工具在活细胞实时生物电监测方面实现了更高水平的有效性。进一步理解生物电在胚胎发育以及多种人类疾病（如癌症）中的作用，将有助于揭示其潜在机制，这对于疾病的治疗与预防至关重要。
斑马鱼已被证实是研究发育生物学和人类疾病（包括癌症）的有力动物模型5,6它们与人类共享70%的直系同源基因，并具有相似的脊椎动物生物学特征7斑马鱼具有易于饲养、产卵量大、遗传操作简便、易于转基因以及胚胎体外发育透明等优势，使其成为一种优越的研究系统 体内 成像5,6拥有大量现有的突变鱼系和已完成全基因组测序的资源，斑马鱼将提供一个相对&#160;无限的科学发现范围。
为了研究 体内 细胞的实时电活动，我们利用斑马鱼模型系统和ASAP1。本文描述了如何通过Tol2转座子转基因技术将荧光电压生物传感器ASAP1整合到斑马鱼基因组中，并在胚胎发育、幼鱼运动以及活体肿瘤中可视化细胞的电活动。

<table><tbody><tr><td>14 mL 细胞培养管</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td>大肠杆菌培养</td></tr><tr><td>琼脂糖电泳槽</td><td>Thermo Scientific</td><td>Owl B2</td><td>DNA 电泳</td></tr><tr><td>Agarose RA</td><td>Amresco</td><td>N605-500G</td><td>用于制备显微注射凝胶</td></tr><tr><td>Attb1-ASAP1-F 引物</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA&lt;br /&gt;GCAGGCTTCACCATGGAGACGA&lt;br /&gt;CTGTGAGGTATGAACA</td><td>用于亚克隆的 ASAP1 编码区扩增</td></tr><tr><td>Attb2-ASAP1-R 引物</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAA&lt;br /&gt;GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC&lt;br /&gt;AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td><td>用于亚克隆的 ASAP1 编码区扩增</td></tr><tr><td>明场解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>去壳、显微注射、样品固定</td></tr><tr><td>彩色相机</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc</td><td>鱼胚胎图像记录</td></tr><tr><td>凹面载玻片</td><td>VWR</td><td>48336-001</td><td>在成像过程中固定鱼胚胎</td></tr><tr><td>一次性移液管（3.4 mL）</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>转移鱼胚胎和水</td></tr><tr><td>内切核酸酶 Not I</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td>用于线性化质粒 DNA</td></tr><tr><td>落射荧光复合显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager.A2</td><td>鱼胚胎成像</td></tr><tr><td>落射荧光体视解剖显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Discovery.V12</td><td>鱼胚胎成像</td></tr><tr><td>荧光光源</td><td>Lumen dynamics</td><td>X-cite seris 120</td><td>荧光显微镜的光源</td></tr><tr><td>#5 镊子</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>去壳和折断注射针</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II 酶混合物</td><td>Thermo Scientific</td><td>11789020</td><td>Gateway BP 重组克隆</td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Plus 酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>12538120</td><td>Gateway LR 重组克隆</td></tr><tr><td>凝胶 DNA 回收试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td>DNA 凝胶纯化</td></tr><tr><td>上样尖端</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>用于将注射溶液装入毛细玻璃针</td></tr><tr><td>甲基纤维素（1600 cPs）</td><td>Alfa Aesar</td><td>43146</td><td>鱼胚胎固定</td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>抑制培养皿中的真菌爆发</td></tr><tr><td>显微注射模具</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>制备用于注射过程中固定鱼胚胎的琼脂糖模具托盘</td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>WPI</td><td>Pneumatic Picopump PV820</td><td>显微注射装置</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>WPI</td><td>Microinjector MM3301R</td><td>显微注射操作</td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter instrument</td><td>P-1000</td><td>用于制备毛细玻璃针</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Amresco</td><td>J217-500ml</td><td>用于校准注射体积</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1340</td><td>mRNA 体外转录</td></tr><tr><td>单色相机</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm</td><td>鱼胚胎图像记录</td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4020</td><td>制备少量质粒 DNA</td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>在成像过程中固定鱼或鱼胚胎</td></tr><tr><td>RNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>体外转录后 mRNA 的纯化</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>用于测定 DNA 和 RNA 浓度</td></tr><tr><td>阶段测微尺</td><td>Am Scope</td><td>MR100</td><td>显微注射体积校准</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>基因克隆中的 DNA 扩增</td></tr><tr><td>薄壁玻璃毛细管</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>制作毛细玻璃针的原材料</td></tr><tr><td>Tol2-exL1 引物</td><td>IDT DNA</td><td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td><td>Tol2 切除检测</td></tr><tr><td>Tol2-exR 引物</td><td>IDT DNA</td><td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td><td>Tol2 切除检测</td></tr><tr><td>TOP10 化学感受态大肠杆菌</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404006</td><td>基因克隆中用于转化</td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>用于麻醉鱼或鱼胚胎</td></tr><tr><td>302 nm 紫外透射仪</td><td>UVP</td><td>M-20V</td><td>DNA 可视化</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Thermo Scientific</td><td>2853</td><td>用于基因克隆中的转化过程</td></tr></tbody></table>

斑马鱼早期胚胎和肿瘤中细胞电活动的可视化

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

生物电是指由细胞膜上的离子通道和离子泵介导的内源性电信号，在可兴奋的神经细胞和肌肉细胞的信号传导以及其他多种生物学过程中（如胚胎发育模式形成）发挥着重要作用。然而，目前仍缺乏在脊椎动物胚胎发育过程中进行体内电活动监测的有效手段。基因编码的荧光电压探针（GEVIs）的进展为此挑战提供了可能的解决方案。本文以已建立的电压探针 ASAP1（动作电位加速感应器1）为例，介绍如何构建转基因电压指示斑马鱼。本研究选用了 Tol2 工具包以及一个泛表达的斑马鱼启动子ubi。我们还详细说明了&#160;Gateway 位点特异性克隆、基于 Tol2 转座子的斑马鱼转基因技术，以及利用常规落射荧光显微镜对早期胚胎和斑马鱼肿瘤进行成像的操作流程。通过该转基因鱼系，我们发现斑马鱼胚胎发育及幼鱼运动过程中存在细胞电位的变化。此外，在部分斑马鱼恶性外周神经鞘瘤中观察到，与周围正常组织相比，肿瘤细胞普遍呈现极化状态。

在成功的显微注射中，超过50%的注射鱼胚胎将在体细胞中表现出一定程度的绿色荧光，并且大多数个体在Tol2转座子切除实验中呈阳性（图2）。经过与野生型鱼杂交2至4代（直至荧光鱼比例达到预期的孟德尔分离比50%），将转基因鱼用于成像实验，以追踪胚胎发育过程中的细胞膜电位变化。首先，检测了斑马鱼早期胚胎发育阶段整个细胞周期中的膜电位变化。观察到，在卵裂沟形成之前，细胞发生超极化（图3A-3C，以及补充视频1）。此外，在1至3日龄的鱼胚胎中，不同组织表现出多样化的膜电位（图3D-3G）。例如，与邻近组织或器官相比，体节和脊索通常处于超极化状态。当斑马鱼胚胎具备运动能力后，我们还能检测到神经肌肉的电活动（图4，补充视频2</str...

在此，我们展示了构建细胞电位报告斑马鱼品系的过程，以可视化胚胎发育、运动及斑马鱼肿瘤细胞 体内.

生物电，即由细胞膜上的离子通道和离子泵介导的内源性电信号，在信号传导中发挥着重要作用……

本实验的总体目标是构建一种转基因斑马鱼品系，使其能够在胚胎发育、幼体运动以及肿瘤发生过程中观察细胞电学变化。该方法有助于回答发育生物学、生理学和癌症细胞生物学领域中的一些关键问题，例如：细胞电信号在胚胎发育和肿瘤细胞中的基本作用是什么？该技术的主要优势在于，它能够让我们在活体中实时追踪细胞电信号活动。根据文本方案制备 Tol2 转座酶 mRNA 和注射溶液后，在注射前一日下午，设置四到六个繁殖缸，每缸至少放入两条雄鱼和两条雌鱼。为减少鱼类排泄物并诱导繁殖反应，下午不要喂食。次日早晨，从零下 80 摄氏度冰箱中取出已制备的注射溶液，并置于冰上。拉开鱼繁殖缸中的隔板，让鱼进行交配。通常情况下，鱼会在20至30分钟内产卵。在等待期间，使用具有以下参数的微电极拉制仪，从毛细玻璃管中拉制针头。使用实验室擦拭纸折断针头末端，形成斜面边缘。为降低胚胎死亡率，宜选用直径较小的针头。鱼类产卵后，将其收集至直径10厘米的培养皿中。在解剖显微镜下立即移除所有异常胚胎和鱼类排泄物。然后用移液器将受精胚胎转移至预先准备好的3%琼脂糖注射模具中。去除多余水分以帮助固定胚胎位置。当所有行都填入有活力的胚胎后，调整其位置，使单细胞相对于注射针水平方向呈45度角。这将使后续的注射操作更加容易。接下来，在佩戴手套的情况下，使用20微升上样移液器吸头从冰上的离心管中吸取5微升已制备好的构建物。将移液器吸头小心插入断裂的毛细管后端，直至其开始变细的部位，使试剂尽可能接近尖端，然后将其排入毛细管中。如果仍有气泡，轻轻振荡针头，注意不要折断尖端。将针头笔直插入显微注射针头夹持器中，并小心拧紧，直至针头固定不动。然后将角度调整至约45度。针头制备并安装完毕后，打开显微镜和气体压力罐。通过调节压力来控制注射体积，持针压力约为0.5 PSI，喷射压力为30 PSI。按下踏板时，检查溶液是否能从针头中喷出。使用带有矿物油液滴的载物台测微尺，将溶液的体积和流速调整至直径约10微米。确保背压使少量溶液从针头滴出。如果背压不足，毛细作用会导致液体进入针尖并破坏mRNA。针尖校准后，利用凝胶切口的边缘作为支撑，将针插入受精胚胎的单个细胞中，以固定胚胎位置，使针尖施加压力时胚胎不会移动。当针尖进入单个细胞后，踩下脚踏板，释放所需量的溶液。为了获得转基因斑马鱼，必须将溶液注射到细胞中而非卵黄内。对所有胚胎重复此操作。完成后，使用一次性3.4毫升移液管，配合斑马鱼系统用水，将注射后的胚胎从琼脂糖凹槽中冲洗出来，并转移至已标记的培养皿中。将胚胎置于28.5°C的培养箱中孵育，使其发育。在当天不同时段定期检查，移除死亡的鱼胚胎，并用含0.1%亚甲蓝的鱼水更换培养液。注射后约6至8小时，取10条已注射的鱼胚胎，采用Hotshot法提取基因组DNA。次日早晨，使用带有荧光光源的解剖显微镜筛选在非卵黄组织中显示 GFP 荧光的胚胎。这些胚胎应含有已注射的构建体。按照之前所述方法进行 Tol2 切除实验，以检测转座子活性。如果能够检测到切除的质粒，则保留已注射的鱼胚胎并进行培育。否则，重复 Tol2 mRNA 合成和显微注射过程，直至 Tol2 切除检测获得阳性结果。为观察斑马鱼胚胎，将多条 F2 代 Founder 鱼分别与野生型鱼进行单对交配。根据斑马鱼发育分期指南，收集处于不同目标发育阶段的鱼胚胎。在解剖显微镜下，将早期鱼胚胎置于鱼系统水中，用一对镊子小心剥离并去除卵膜。使用一次性转移移液管将少量胚胎转移至含有3%甲基纤维素的凹面载玻片中。然后在解剖显微镜下用针将胚胎调整至所需位置，以观察细胞内的GFP活性。对于少于12个体节阶段的胚胎，使用配备兼容相机和成像软件的落射荧光复合显微镜进行成像；对于超过12个体节阶段的胚胎，则使用荧光解剖显微镜。为了成像肿瘤细胞的电压，首先鉴定患有恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的斑马鱼。将斑马鱼放入直径为10厘米的培养皿中，进行整体成像。最后，在成像完成后，解剖取出肿瘤，以观察肿瘤细胞的电活动。在成功的显微注射中，超过50%的注射胚胎将在体细胞中表现出一定程度的绿色荧光蛋白（GFP）表达，且大多数胚胎在Tol2转座子切除实验中呈现阳性结果。本研究观察了斑马鱼早期胚胎发育过程中细胞周期各个阶段的膜电位变化。如该延时视频所示，细胞在分裂沟形成之前发生超极化。此外，不同组织在一至三日龄的鱼胚胎中表现出多种膜电位。例如，与相邻的组织和器官相比，体节和脊索通常处于超极化状态。在此两天龄的鱼胚胎中，运动期间的神经肌肉电活动通过颜色密度的变化反映出来，该变化对应于电信号转导。通过将ASAP1报告基因鱼与易发生自发性恶性周围神经鞘瘤（MPNST）的RPL35突变体鱼杂交，对其胚胎中的癌细胞生物电特性进行了检测。与周围组织相比，肿瘤细胞的极性更强。若操作熟练，该显微注射技术在正确实施的情况下约需三小时即可完成。进行该操作时，重要的是要记住，斑马鱼胚胎应处于单细胞阶段，以获得理想结果。随着该技术的发展，将为发育生物学和细胞生物学领域的研究人员探索斑马鱼及其他模式生物体内电信号变化提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过显微注射创建转基因斑马鱼品系。

visualization-cellular-electrical-activity-zebrafish-early-embryos

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

斑马鱼早期胚胎和肿瘤细胞电活动的可视化研究

在本视频中，我们演示了一种利用共聚焦显微镜在单细胞分辨率下对活体斑马鱼胚胎中发育中的脊椎动物大脑进行分析的方法。该方法包括对单细胞斑马鱼胚胎进行显微注射，随后对发育中的大脑进行固定和成像的技术流程。...

活体斑马鱼胚胎大脑的共聚焦显微镜成像

本方案描述了在活体斑马鱼胚胎中对单个神经元或神经嵴细胞进行成像的方法。该方法利用荧光共聚焦延时显微镜观察细胞行为及肌动蛋白的定位。...

斑马鱼胚胎中单个神经元和神经嵴细胞的活体成像及肌动蛋白细胞骨架观察

本视频展示了一种方法，该方法结合了电穿孔技术和共聚焦显微镜技术，用于对发育中的斑马鱼前脑中的单个神经前体细胞进行活体成像。体内水平上对前脑神经前体细胞在克隆水平的发育过程分析可通过此方法实现。...

延时活体成像观察发育中斑马鱼前脑内克隆相关神经前体细胞

来源：Williams, A. L., et al. 利用多光子延时成像技术实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移的神经嵴细胞的可视化. J. Vis. Exp.

利用多光子延时成像技术观察斑马鱼胚胎中神经嵴细胞的迁移

本文介绍了一种记录幼年斑马鱼前脑细胞外场电位的简单方法。该方法可提供癫痫样活动的稳定体内读数。该技术可用于携带癫痫相关基因的转基因斑马鱼幼鱼，或通过给予致惊厥药物诱发癫痫的模型。...

幼年斑马鱼前脑电生理记录

介绍了对幼年斑马鱼脑血管发育进行成像的方法。同时提供了促进三维成像以及利用化学处理手段调控脑血管发育的技术。...

斑马鱼胚胎中脑血管结构的成像与三维重建

此处描述的实验方案通过采用斑马鱼胚胎，能够在最接近生理状态且侵入性最小的条件下研究可兴奋细胞的电学特性。 体内...

在活体斑马鱼胚胎中检测运动神经元膜电位

本文描述了对斑马鱼胚胎和幼鱼脊髓神经元进行电生理记录的方法。该制备方法可维持神经元 原位 并且通常涉及最少的解剖操作。这些方法可用于对多种脊髓神经元进行电生理学研究，从早期幼体阶段开始即可记录其初始的电兴奋性。...

斑马鱼脊髓感觉和运动神经元电生理记录的 in situ 脊髓制备

活体成像是一种强大的工具，可用于研究神经系统发育背后的细胞机制。本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜实时观察斑马鱼发育过程中大量多色Brainbow标记细胞的技术。...

利用Brainbow技术和活体斑马鱼延时共聚焦成像可视化大脑发育过程

本文介绍一种对斑马鱼胚胎大脑进行活体成像的方法，可观察至幼虫期和稚鱼期。该方法借鉴电生理学技术，属于微创操作，能够获取成熟神经元的细胞及亚细胞结构细节，并可与光遗传学及神经药理学研究相结合，用于表征脑功能及药物干预效果。...

通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼虫和幼鱼全脑组织的活体成像

本文介绍了一种详细的实验方案，利用共聚焦显微镜检测表达GCaMP钙指示剂的转基因斑马鱼脑区中神经活动的方法。...

体内 共聚焦荧光成像技术用于观察部分固定幼年斑马鱼在感觉刺激下诱导的神经活动

学习利用转基因斑马鱼技术实时追踪胚胎发育与肿瘤细胞中的电信号变化。该方法为发育生物学和癌症研究提供了重要的活体成像工具。

斑马鱼早期胚胎和肿瘤中细胞电活动的可视化

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