Drosophila Burrowing and Tunneling Assay: een methode om weefselhypoxie bij vlieglarven te beoordelen

- Om de embryo-verzamelkooi op te zetten, gebruikt u druivensap agarplaten aangevuld met verse gistpasta en plaatst u de platen op kooien met mannelijke en vrouwelijke Drosophila-vliegen van het juiste genotype. De geur van de gist en het druivensap is aantrekkelijk en bevordert het leggen van eieren door de vrouwtjes. Laat het leggen van eieren gedurende een getijdeperiode. Verwijder vervolgens de volwassenen en incubeer de embryoplaten gedurende 24 uur om eerst instar-larven te verkrijgen. plaat werd uitgesneden en gevuld met gistpasta.

Jonge larven moeten zich voeden om lichaamsgewicht te krijgen om zich te ontwikkelen, dus graven ze in de voedselbron, de gistpasta. Naarmate ze zich ontwikkelen, komen larven in een dwalende fase en tunnelen ze weg van het voedsel om een locatie voor verpopping te zoeken. Om hypoxie te beoordelen, onderzoeken we de tunnelpatronen die larven vormen in het substraat. Gebrek aan of onvoldoende tunneling is een teken van zuurstoftekort. In het voorbeeldprotocol zullen we zien hoe we de graaf- en tunneltest kunnen opzetten.

- Stel de controle en experimentele genetische kruisen in eierleggen op zoals beschreven in het tekstprotocol. Houd de vliegen minstens twee dagen in het donker voordat u begint met getijde eierverzamelingen. Voor getijde eierverzameling, breng de volwassenen over naar nieuwe druivenagarplaten versierd met een vers uitstrijkje van gistpasta vroeg op de dag en laat de volwassenen vier uur eieren op de borden leggen. Breng de volwassenen na vier uur over op verse druivenagarplaten.

Incubeer vervolgens de vier uur durende verzamelplaten 's nachts bij 25 graden Celsius. Tegen de volgende middag zullen de meeste larven zijn uitgebroed. Plan om minstens 50 te hebben voor elke experimentele groep.

Voor een enkele run van de test, bereid ten minste vijf assayplaten per experimentele groep. Voeg 16 gram vliegenagar toe in 700 milliliter gedeioneerd water door verhitting. Bereid 17,5 milliliter Nipagen in 95% ethanol. Verwarm de agar-oplossing totdat deze bijna volledig is opgelost. Voeg vervolgens Nipagen-oplossing toe aan de agar-oplossing en verwarm tot agar volledig oplost. Koel de agar-oplossing kort af en laad vervolgens 10 centimeter platen met 15 milliliter.

Uitgeharde agar moet stevig aanvoelen en bestand zijn tegen afbrokkelen wanneer er stukken uit worden gesneden. Zodra de agar is uitgehard, gebruikt u een kurkboorder van 1,5 centimeter om een centraal gat in de agargel in elk bord te maken. Vul de gaten vervolgens netjes met verse gistpasta.

Om de larven over te brengen naar de testplaat, maakt u een eenvoudig hulpmiddel. Buig een curve in de punt van een plastic microspatula en dompel de punt in gistpasta om deze aan larven te lijmen. Pak nu de eerste instar-larven afzonderlijk op en plaats ze op de agarplaat dicht bij de voedselheuvel. Bereid voor elke experimentele groep ten minste vijf borden met elk 10 larven.

Om de reproduceerbaarheid tussen de assay-replica's te garanderen, is het van cruciaal belang dat er slechts 10 larven op elke testplaat worden geplaatst. Zorg ervoor dat u de testplaat zorgvuldig controleert om te bepalen dat één en slechts één larve wordt overgedragen elke keer dat u een larve met de microspatula-tip aflevert.

Zodra de plaat is geladen, label het, bedek het en plaats het vervolgens in het donker met de dekselzijde omhoog bij kamertemperatuur. Onderzoek elke plaat dagelijks totdat alle larven zijn gestorven of verpopt. Hier zijn voorbeelden van platen voor een wilde soort van dag twee tot dag acht van de test. Op dag twee worden larven begraven in voedsel en vindt er geen tunneling plaats. Tunneling begint op dag drie en bereikt een maximum tussen dag vijf en acht als larven ophouden te dwalen en verpoppen in hun tunnels.

Breng de poppen voorzichtig met een gebogen plagende naald over op een druivenplaat en tel indien gewenst hoeveel poppen er insluiten. Let op de poppenvorming en evalueer de poppen op afwijkingen.