La producción de transgénicos Xenopus laevis Integración mediada por la enzima de restricción y transferencia nuclear

Para estudiar la expresión génica durante el desarrollo embrionario del xenopus, los productos génicos clonados deben integrarse de forma estable en el genoma. Los primeros núcleos de espermatozoides se aíslan de los testículos y la pérma de ranas adultas. A continuación, se preparan extractos citosólicos en interfase a partir de huevos de xenopus.

Los núcleos de espermatozoides y el extracto de óvulo se mezclan con transgénicos linealizados, ADN y una enzima de restricción. Durante este paso, el extracto de óvulo descontamina la cromatina de los espermatozoides, mientras que la enzima de restricción promueve la integración del transgén. Finalmente, los núcleos tratados se transfieren a óvulos no fertilizados.

Cada célula del embrión resultante lleva el transgén y la expresión dependiente del promotor del transgén se detecta mediante inmunofluorescencia, microscopía u otros métodos. La principal ventaja de este método frente a otros métodos, como la inyección de ADN, es que los embriones resultantes experimentan la integración del transgén antes de la primera escisión. Esto significa que los embriones resultantes no son quiméricos, por lo que no se requiere reproducción.

Con este protocolo, se pueden crear grandes cantidades de embriones transgénicos de forma rápida y eficiente en tan solo unas horas. Estos embriones transgénicos se pueden utilizar para analizar la función del promotor o de los genes, o se pueden criar para crear líneas transgénicas en este procedimiento transfiriendo los testículos de una o dos ranas sacrificadas a una placa de Petri seca de 60 milímetros. Con pinzas, macere los testículos hasta que no queden trozos visibles.

Agregue dos mililitros de tampón de preparación nuclear fría o NPB al macerado y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo, rocíe macerado a través de aproximadamente cuatro espesores de gasa en un embudo y recoja el filtrado en un tubo de 15 mililitros. Luego enjuague el plato con ocho mililitros de NPB y filtre a través de la gasa en el tubo. Esta solución contiene los espermatozoides con las manos enguantadas.

Exprima la gasa para recoger el líquido restante, centrifugue el tubo durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para pellet el esperma después de la centrifugación, decantar el sobrenadante. A continuación, añada ocho mililitros de NPB y colóquelo hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender el pellet. Gire hacia abajo nuevamente durante el centrifugado, lleve un mililitro de NPB a temperatura ambiente.

Luego, después del centrifugado, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de NPB y agregue 50 microlitros de 10 miligramos por mililitro. Lyin recién hecho a perme. La mezcla de esperma se incuba suavemente durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue 10 mililitros de un XMPB frío con 3%BSA al tubo. Para detener la reacción de lyan, gire hacia abajo el lyo que se trata. El pellet debe verse un poco más translúcido que antes.

Vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de NPB frío con 0,3%BSA para lavar los núcleos de esperma mezclados suavemente con una pipeta de 10 mililitros y gire hacia abajo después del centrifugado, decantar el sobrenadante y volver a suspender el pellet. En 500 microlitros de tampón de almacenamiento de espermatozoides, transfiera los espermatozoides a un tubo de 1,5 mililitros. Este es el stock de núcleos Coloque este tubo en hielo para verificar el rendimiento de los núcleos.

Coloque 98 microlitros de tampón de dilución de espermatozoides, un microlitro de la culata nuclear y un microlitro de una dilución de uno a 100 de la culata de hux en un tubo de micro fuga de 1,5 mililitros. Mezclar bien. Usando un pipeteador, permita que una pequeña cantidad fluya hacia la cámara de un hemocitómetro por acción capilar.

Bajo un microscopio compuesto, cuente los núcleos. Un macho debe producir de 50 a 100 millones de células. Coloque los núcleos a cuatro grados centígrados durante la noche para permitir que el glicerol penetre y mejore la criopreservación.

Las alícuotas congeladas de nitrógeno líquido se almacenan a menos 80 grados centígrados, los huevos de escritura se recogen de ocho a 12. Las ranas se transfieren a un vaso de precipitados y se lavan cuatro veces en aproximadamente 35 mililitros de tampón de extracto, y luego dos veces en 25 mililitros de tampón de extracto de factor citostático o C-S-F-X-B con inhibidores de la proteasa para empaquetar los huevos y transferirlos a tubos Beckman UltraClear. Deja que los huevos se asienten.

Retire la mayor cantidad posible de C-S-F-X-B y centrifugue a 150 Gs durante unos 60 segundos. Después de la centrifugación, retire el exceso de solución de la parte superior de los huevos empaquetados. Luego, para triturar los huevos y generar extracto citoplasmático, centrifugar los huevos a 16, 000 G durante 10 minutos A cuatro grados centígrados, los huevos deben separarse en tres capas.

La capa superior está formada por lípidos. La capa intermedia es el citoplasma y la capa inferior es la yema. Inserte una aguja de calibre 18 con una jeringa adjunta a través del tubo en la base de la capa intermedia y extraiga la solución citoplasmática.

Transfiera la solución a un tubo Beckman UltraClear nuevo con hielo. Añadir inhibidores de la proteasa al citoplasma aislado hasta una concentración final de una centrífuga x. La preparación citoplasmática a 16, 000 Gs durante 10 minutos.

A cuatro grados centígrados, transfiera el citoplasma clarificado a un nuevo tubo. Espere obtener de 0,75 a un mililitro de citoplasma por rana. A continuación, añada una vigésima parte del volumen de extracto de la mezcla energética a la muestra.

Transfiera el citoplasma a tubos de policarbonato de paredes gruesas. Para la ultracentrifugación, agregue un molar de cloruro de calcio a cada tubo hasta una concentración final de 0,4. Milimolar incubar los tubos durante 15 minutos A temperatura ambiente, esto inactiva el factor citostático y empuja el extracto a la centrífuga en interfase.

En una ultracentrífuga a 200.000 Gs durante una hora y media a cuatro grados centígrados, el citoplasma se fraccionará en cuatro capas de arriba a abajo. Son lípidos, citosol, membrana y mitocondrias, y glucógeno y ribosomas. Inserte una jeringa en la parte superior del tubo y retire la capa citosólica.

Esto debe ser aproximadamente un mililitro. Si se cargaron de dos a tres mililitros en el tubo, transfiera la fracción citosólica a tubos frescos y centrifugue las muestras a 200.000 Gs durante 20 minutos a cuatro grados Celsius, alícuota el sobrenadante en alícuotas de 25 microlitros en tubos de 0,5 mililitros. Congele rápidamente las alícuotas en nitrógeno líquido y guárdelas a menos 80 grados centígrados hasta su uso.

Para establecer una reacción de transgénesis, utilice una punta de pipeta recortada para mezclar suavemente el material de núcleos y combine cuatro microlitros de núcleos y dos microlitros de plásmido linealizado en un microtubo de 1,5 mililitros. Incube durante cinco minutos a temperatura ambiente mientras se lleva a cabo la incubación. Diluir 0,5 microlitros de la enzima de restricción en 4,5 microlitros de agua.

Luego agregue un microlitro de enzima diluida a 18 microlitros de tampón de dilución de espermatozoides, dos microlitros de cloruro de magnesio y dos microlitros de extracto de alta velocidad. Agregue esta mezcla a la reacción del plásmido de los núcleos. Incuba 10 minutos más para hinchar los núcleos durante esta incubación.

Los huevos obtenidos de dos o tres ranas hembras se desgastan y se lavan cinco veces en un XMMR. Use una pipeta de verraco ancha para transferir de 400 a 500 huevos de escritura a cada agro. Plato de pozo que contiene 0.2 XMMR y 4%fi.

Llame aproximadamente de 15 a 20 minutos después de comenzar la reacción de transgénesis. Mezcle suavemente los núcleos, extraiga la reacción de ADN con la punta recortada EC y agregue cinco microlitros de la reacción a 150 microlitros de tampón de dilución de esperma a temperatura ambiente para cargar la aguja. Coloque un trozo de TIG fino en el tubo en el extremo de la punta de la pipeta de 200 microlitros con clip EC.

Dibuja la solución. A continuación, conecte el tubo a la aguja y permita que la solución entre en la aguja por gravedad. Conecte la aguja al tubo de la bomba.

Coloque los huevos en la platina del microscopio. A continuación, inserte rápidamente la aguja en el primer huevo. La inyección debe ser poco profunda y aproximadamente perpendicular a la membrana plasmática X.

Para evitar daños, mantenga la aguja en el huevo durante unos 0,5 segundos. Dispensando a una velocidad de aproximadamente 20 nanolitros por segundo, uno o dos platos de trasplantes se pueden completar en 20 a 30 minutos. Después de las inyecciones, coloque los platos a 16 a 20 grados centígrados hasta que los embriones hayan alcanzado la etapa de cuatro a ocho células.

Los embriones transgénicos resultantes de transferencias nucleares deben ser criados hasta que la expresión del promotor del interés sea visible en la imagen que se muestra aquí. Un promotor de actina muscular impulsa la expresión de la proteína verde fluorescente en los somitas de este renacuajo transgénico. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la transferencia nuclear de núcleos de esperma para crear embriones de opus transgénicos.

Este enfoque se ha demostrado para la transgénesis con opus lavis, pero también se puede adaptar a zap tropic con modificaciones menores.