Name: 迁移人T淋巴细胞分离，培养和分析 em在体外 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学习人T淋巴细胞体外迁移分析方法，包括细胞分离、培养及在ICAM-1和SDF-1包被培养板上的迁移成像技术。该方案为研究免疫细胞动态行为提供可靠的实验基础。

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本项目得到美国国立卫生研究院基金资助，项目编号为 HL087088（M.K.）和 HL18208（M.K.）。

1. 人T淋巴细胞的分离
<ol>
 <li>从健康供体获取人血。在进行下一步操作前，将血液置于室温下冷却约30分钟。</li>
 <li>用移液器轻轻将3 mL室温的Polymorph密度梯度分离液加入8 mL圆底聚苯乙烯管中。然后轻轻将3 mL全血加至Polymorph分离液上方，注意避免两种试剂混合。</li>
 <li>将试管在室温下以500 × g离心45分钟。</li>
 <li>离心后，外周血单个核细胞（PBMC）已与其他血液成分分离，位于上层细胞层。从顶部观察，PBMC层呈现为第一层浑浊的条带。</li>
 <li>小心移除PBMC层上方的澄清黄色上清液，然后使用P1000微量移液器将PBMC层转移至15 mL或50 mL锥形管中。</li>
 <li>用PBS洗涤PBMC两次，每次以500 × g离心5分钟。每次洗涤后上清液会略显浑浊。</li>
</ol>
2. 人T淋巴细胞的培养
<ol>
 <li>使用移液器将PBMC转移至含有20 mL RPMI 1640培养基的T-75培养瓶中，培养基中需添加10% FBS、1%青霉素/链霉素和1 μg/mL植物血凝素（PHA）。</li>
 <li>在37°C、5% CO2条件下孵育至少1小时，最长可达24小时。此步骤可使贴壁于培养瓶表面的单核细胞与仍悬浮在培养基中的淋巴细胞分离。若在此步骤中采用短时间孵育（1小时），可使用仅含10% FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基，无需添加PHA，具体如步骤2.1所述。</li>
 <li>小心移除培养瓶中的全部培养基，将其转移至50 mL锥形管中，并在500 × g下离心5分钟。</li>
 <li>重悬细胞沉淀（此时主要含有淋巴细胞），并将细胞转移至新的T-75培养瓶中，瓶内含25 mL RPMI 1640培养基，其中添加10% FBS、1%青霉素/链霉素和1 μg/mL PHA。</li>
 <li>在37°C下培养3天（若PBMC初始孵育过夜，则培养2天）。细胞生长24小时后，可能需要添加15–20 mL新鲜培养基，并转移至更大的T-175培养瓶中。</li>
 <li>培养3天后，使用移液器将培养基和悬浮的淋巴细胞从培养瓶中移出，转移至50 mL锥形管中，在500 × g下离心5分钟。</li>
 <li>重悬细胞沉淀，并将细胞转移至新的T-75或T-175培养瓶中，分别加入25 mL（T-75）或50 mL（T-175）RPMI 1640培养基，其中含10% FBS、1%青霉素/链霉素以及20 ng/mL人IL-2或IL-15。</li>
 <li>继续培养淋巴细胞4–7天。若起始使用T-75培养瓶，培养1–2天后需扩大培养规模并转移至T-175培养瓶。</li>
</ol>
3. 体外 淋巴细胞迁移实验
<ol>
 <li>在进行迁移实验的前一天，用 PBS 将 Protein A 或 G 配制成 20 μg/mL 的溶液，加入玻璃底培养皿（厚度 0.17 mm），4°C 过夜包被。</li>
 <li>用 PBS 充分洗涤培养皿。</li>
 <li>将人 ICAM-1/Fc（10 μg/mL）和人 SDF-1（2 μg/mL）溶于 PBS 溶液中，加入培养皿，室温孵育 4 小时，以实现固定化。</li>
 <li>使用血细胞计数板测定 T-175 培养瓶中培养物的细胞密度，以制备 T 淋巴细胞。每孔培养皿应使用约 2–5 × 105 个细胞，以达到适合迁移分析的细胞密度。</li>
 <li>用 PBS 洗涤 T 淋巴细胞两次，然后重悬于 1 mL 含 1 mg/mL D-葡萄糖的 L-15 培养基中。</li>
 <li>用 PBS 充分洗涤包被有 ICAM-1/Fc 和 SDF-1 的培养皿。</li>
 <li>将 1 mL 培养基中的 T 淋巴细胞转移至培养皿中，并在 37°C 下维持培养。</li>
</ol>
4. 使用 NIS Elements 软件采集图像序列
<ol>
 <li>打开 NIS Elements 软件。</li>
 <li>在相机设置菜单中，为实时成像和图像采集均选择“2x2 二倍像素合并”模式。</li>
 <li>进入“应用程序”菜单，选择“定义/运行实验”。</li>
 <li>设定图像之间的时间间隔以及图像采集序列的总时长。</li>
 <li>点击“运行”按钮以开始图像采集。</li>
 <li>可使用多种软件包（包括 ImageJ、AutoQuant 或 Volocity）对细胞进行追踪，并量化迁移参数（如速度、路径长度、位移等）（图 1）。</li>
 <li>为生成“蜘蛛网图”，需收集每个细胞在各时间点的 x-y 坐标（图 2），并将这些坐标投影到一张图中，使每个细胞的起始点均位于原点（图 3）。</li>
</ol>
5. 代表性结果
在第6天培养时，无论存在IL-2或IL-15，T淋巴细胞均占 &gt;通过CD3阳性染色以及CD4和/或CD8阳性染色确定，98%的细胞为T细胞。对于IL-2，我们发现83%为CD4+细胞，15%为CD8+细胞 &lt;1% CD4+CD8+ 细胞。对于 IL-15，我们发现 88% 为 CD4+ 细胞，11% 为 CD8+ 细胞 &lt;1% CD4+CD8+ 细胞。在 ICAM-1/SDF-1 基质上迁移时，T 淋巴细胞的迁移速度约为 15 μm/min 可在1小时内持续进行。T淋巴细胞在ICAM-1/SDF-1上的迁移依赖于LFA-1介导的黏附，因为抗LFA-1配体阻断抗体可显著抑制该迁移过程。
<img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig1.jpg" alt="细胞迁移分析；显微镜图像显示带有颜色编码轨迹的细胞运动路径。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 迁移性T淋巴细胞的细胞示踪。 从全血中分离的T淋巴细胞在IL-2或IL-15存在下培养6天后，接种于包被有10 μg/mL ICAM-1和2 μg/mL SDF-1的玻璃底培养皿中，使其贴附并迁移。每10秒采集一次图像，持续30分钟。使用Volocity软件在每幅图像中识别细胞并进行时间序列追踪。该视频显示T淋巴细胞以约15 μm/min的速度进行随机迁移。
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2017/2017_Kim_Movie1.mov">点击此处观看视频。</a> 
视频 1. 迁移性 T 淋巴细胞的细胞示踪。从全血中分离的 T 淋巴细胞在含有 IL-2 或 IL-15 的培养条件下培养 6 天后，接种于包被有 10 μg/mL ICAM-1 和 2 μg/mL SDF-1 的玻璃底培养皿中，使其贴附并迁移。每 10 秒采集一次图像，持续 30 分钟。使用 Volocity 软件对每幅图像中的细胞进行识别，并随时间进行追踪。该视频展示了 T 淋巴细胞以约 15 μm/min 的速度进行随机迁移的过程。
<img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig2.jpg" alt="细胞中心点追踪结果；数据表，随时间变化的位置坐标，细胞迁移分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2. 细胞的时空位置。使用Volocity软件获取每个时间点各个细胞的X-Y坐标。
<img src="/files/ftp_upload/2017/2017fig3.jpg" alt="随机游走轨迹、散点图、统计模拟、数据分析中的随机过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. “蛛网图”。利用每个细胞的X-Y-t坐标，随机选取15个细胞，并以原点为共同起始点进行绘制。通过比较蛛网图，可快速直观地展示不同实验条件下细胞迁移的差异。左图显示T淋巴细胞在对照条件下的迁移情况，右图显示在存在抗LFA-1配体阻断抗体条件下的迁移情况。

<ol><li>Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+integrin+VLA-4+localizes+to+the+lamellipodia+and+mediates+t+cell+migration+on+VCAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1.</a> J Immunol. 183, 359-369 (2009).</li>
<li>Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+myosin+heavy+chain+IIA+mediates+integrin+LFA-1+de-adhesion+during+T+lymphocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.</a> The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).</li>
<li>Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+integrins+and+their+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+research%22%5BJournal%5D)">Leukocyte integrins and their ligand interactions.</a> Immunologic research. , (2009).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

在本实验中，我们详细介绍了一种用于分析原代人T淋巴细胞运动能力的简易系统。体外迁移实验已被广泛用于解析多种分子及信号通路在不同类型细胞运动中的作用。在依据本方案设计您自己的实验时，需注意一些关键对照条件，包括：1）使用非黏附性或非整联蛋白介导的黏附性底物包被，例如牛血清白蛋白（BSA）或聚-L-赖氨酸（PLL）；2）使用特异性阻断整联蛋白的抗体处理，以确定整联蛋白的功能特异性；3）在无刺激信号的情况下进行共包被，例如本方案中所述的SDF-1。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH300070.03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical &amp; Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td></td></tr><tr><td>PHA</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>重组人 IL-15</td><td>R&amp;D Systems</td><td>247-IL</td><td></td></tr><tr><td>Protein G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19459</td><td></td></tr><tr><td>重组人 ICAM-1/Fc</td><td>R&amp;D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>重组人 SDF-1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>350-NS</td><td></td></tr></tbody></table>

人t淋巴细胞的分离、培养及迁移分析 体外

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T淋巴细胞的迁移涉及细胞表面整合素与表达在其他细胞上的配体或细胞外基质蛋白之间的黏附相互作用。整合素在细胞前缘从低亲和力状态精确地时空激活为高亲和力状态，对于T淋巴细胞的迁移至关重要。1同样，细胞尾部边缘（即尾突）的回缩是维持整合素依赖性T淋巴细胞持续运动的必要步骤。2许多针对自身免疫性疾病或炎症性疾病的治疗策略以整合素为靶点，旨在抑制白细胞的过度募集和迁移。3. 为了研究调控人T淋巴细胞迁移的分子事件，我们采用了in vitro用于分析T淋巴细胞在二维基质上迁移的系统，该基质模拟了T淋巴细胞从血管中被募集时所处的微环境。首先从人类供体中分离T淋巴细胞，随后对其进行刺激并培养7至10天。在实验过程中，使T淋巴细胞黏附并迁移于涂有细胞间黏附分子-1（ICAM-1，整合素LFA-1的配体）和基质细胞衍生因子-1（SDF-1）的基质表面。我们的数据显示，T淋巴细胞的迁移速度约为15 μm/min。T淋巴细胞的迁移可被整合素阻断所抑制1或通过调节细胞迁移的细胞肌动球蛋白机器的抑制剂2.

T淋巴细胞迁移发生于归巢至淋巴器官、血管外渗以及进入外周组织的过程中。本文介绍了一种可用于分析T淋巴细胞迁移的实验方案 体外.

人T淋巴细胞的分离、培养及迁移分析 体外

T淋巴细胞的迁移涉及细胞表面整合素与表达在其他细胞上的配体或细胞外基质成分的黏附相互作用……

T淋巴细胞迁移发生在向淋巴器官归巢、从血管系统迁移出来以及进入外周组织的过程中。该过程涉及T细胞表面与其他细胞之间的黏附相互作用。为了在体外研究这一现象，需分离并培养人T淋巴细胞，然后将其接种于包被有黏附蛋白的组织培养板上。ICAM-1 和趋化因子 SDF-1。随后可获取并分析 T 淋巴细胞迁移的图像。大家好，我是罗切斯特大学疫苗生物学与免疫学中心 Minsu Kim 实验室的 Craig LeFort。今天我们将向您展示一种分离和培养人类青少年淋巴细胞并分析其体外迁移能力的实验方法。在我们的实验室中，利用该检测方法研究整合素在T细胞迁移中的作用。T细胞中的主要整合素是淋巴细胞功能相关抗原1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）。LFA-1的特异性配体是ICAM家族分子，例如ICAM-1。此外，T细胞迁移还需要共刺激信号，以提供方向性信号并激活整合素。在我们的实验中，我们使用人ICAM-1和CXCL12（又称SDF-1）作为T细胞迁移的底物。那么，让我们开始吧。从健康供体获取人血后，将血液冷却至室温，大约需要30分钟。血液冷却后，用移液器轻轻将三毫升室温的多形核细胞密度梯度分离液加入八毫升圆底聚苯乙烯管中。然后，再轻轻将三毫升全血加至分离液上层。注意避免任何混合。将试管放入离心机，以500 G离心45分钟。离心完成后，在室温下，外周血单个核细胞（PBMCs）已与其他血液成分分离。PBMC层位于最上层，呈现为第一层浑浊的条带。在无菌条件下，小心移除并弃去呈清亮黄色的上层液体。然后使用 P 1000 微量移液器将 PBMC 层转移至新的锥形管中。用 PBS 洗涤 PBMC 两次，每次以 500 G 离心 5 分钟。每次洗涤后，上清液都会略显浑浊。将细胞重悬于 20 毫升含有 10% FBS、1% 青霉素-链霉素和 1 微克/毫升植物血凝素（PHA）的 RPMI 1640 培养基中。在 PHA 存在下孵育可诱导 T 淋巴细胞的活化与扩增。使用移液器将 PBMC 转移至 T75 培养瓶中。随后在 37°C 和 5% CO₂ 条件下孵育 1 至 24 小时。此步骤可使单核细胞贴附于培养瓶表面，从而与仍处于悬浮状态的淋巴细胞分离。孵育结束后，小心吸除含有主要为淋巴细胞的培养基，并将其转移至15毫升锥形管中。以500 × g离心5分钟。用RPMI 1640重悬细胞沉淀，然后将细胞转移至新的T75培养瓶中，瓶内含25毫升添加了胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素和植物血凝素（PHA）的RPMI 1640培养基，在37°C条件下孵育。培养24小时后，可能需要添加15至20毫升新鲜培养基，并转移至更大的T175培养瓶中。继续孵育三天或两天。如果外周血单个核细胞（PBMC）的初始孵育在三天后为过夜孵育，则使用移液器移除含有悬浮淋巴细胞的培养基，并将其转移至50毫升锥形管中，在500 ×g离心5分钟。Reese 已将细胞沉淀重悬，并将细胞转移至一个新的 T75 培养瓶中，其中含有 25 毫升 RPMI 1640 培养基，添加 FBS、青霉素、链霉素以及人 IL-2 或 IL-15，随后将细胞放入培养箱中培养。若从一个 T75 培养瓶开始培养，则需要扩增细胞并转移至 T175 培养瓶中。培养淋巴细胞一至两天，总共培养四至七天。在迁移实验前一天，用含20微克/毫升蛋白A或G的PBS溶液对玻璃底0.17毫米培养皿进行包被，4摄氏度孵育过夜。次日，用PBS充分洗涤培养皿，然后向培养皿中加入ICAM-1 Fc和人SDF-1的PBS溶液。在室温下孵育四小时，以固定分子。使用血细胞计数板测定培养细胞的密度。然后用 PBS 缓冲液洗涤淋巴细胞两次，并在孵育结束后，将细胞重悬于 1 毫升含有 D-葡萄糖的 L-15 培养基中。用 ICAM-1 Fc 和 SDF-1 大量 PBS 缓冲液充分洗涤包被的培养皿，随后将 1 毫升培养基中的 T 淋巴细胞转移至该培养皿中，每皿应使用约 2 × 10⁵ 至 5 × 10⁵ 个细胞，以达到适用于迁移分析的细胞密度。为了获得细胞迁移的图像，将培养皿置于显微镜载物台上，并置于温度可控的环境中，例如37摄氏度的加热培养室。在图像设置菜单中打开NIS Elements软件。选择2×2 binning模式用于实时成像和图像采集。进入应用程序菜单，选择“定义”、“运行”、“实验”。设置图像之间的时间间隔以及总时长。对于图像采集序列，按下运行按钮，开始图像采集，随后进行数据获取。可以使用 Image J Auto Quant 或 veloc 等软件包对迁移参数（如速度、路径长度和位移）进行量化。要生成蜘蛛网图，需收集每个细胞在每个时间点的 XY 坐标，并将其投影到图表上，所有细胞的起始点均位于原点。此处显示的 T 淋巴细胞在 ICAM 和 SDF-1 上培养后成像，每 10 秒拍摄一次，持续 30 分钟。本视频展示了T淋巴细胞以大约每分钟15微米的速度进行随机迁移，使用每个细胞的XYT坐标。随机选取了15个细胞，并以原点为共同起点进行绘制。通过比较蜘蛛网图，可以快速直观地展示不同实验条件下迁移行为的差异。左侧显示的是在对照条件下T淋巴细胞迁移的图谱，而右侧显示的是存在抗LFA-1配体阻断抗体时T淋巴细胞迁移的图谱。这些数据表明，T淋巴细胞利用整合素LFA-1在ICAM-1基质上迁移。我们刚刚向您展示了在实验过程中如何使用培养的人T淋巴细胞进行迁移实验。需要记住的是，向 ICAM-1 包被的培养皿中加入适量的细胞非常重要，以便简化细胞追踪和迁移分析。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

human-t-lymphocyte-isolation-culture-analysis-migration

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

迁移人T淋巴细胞分离，培养和分析<em在体外</em

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