人T淋巴细胞的分离、培养及迁移分析 体外

T淋巴细胞迁移发生在向淋巴器官归巢、从血管系统迁移出来以及进入外周组织的过程中。该过程涉及T细胞表面与其他细胞之间的黏附相互作用。为了在体外研究这一现象，需分离并培养人T淋巴细胞，然后将其接种于包被有黏附蛋白的组织培养板上。

ICAM-1 和趋化因子 SDF-1。随后可获取并分析 T 淋巴细胞迁移的图像。大家好，我是罗切斯特大学疫苗生物学与免疫学中心 Minsu Kim 实验室的 Craig LeFort。

今天我们将向您展示一种分离和培养人类青少年淋巴细胞并分析其体外迁移能力的实验方法。在我们的实验室中，利用该检测方法研究整合素在T细胞迁移中的作用。T细胞中的主要整合素是淋巴细胞功能相关抗原1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）。

LFA-1的特异性配体是ICAM家族分子，例如ICAM-1。此外，T细胞迁移还需要共刺激信号，以提供方向性信号并激活整合素。在我们的实验中，我们使用人ICAM-1和CXCL12（又称SDF-1）作为T细胞迁移的底物。

那么，让我们开始吧。从健康供体获取人血后，将血液冷却至室温，大约需要30分钟。

血液冷却后，用移液器轻轻将三毫升室温的多形核细胞密度梯度分离液加入八毫升圆底聚苯乙烯管中。然后，再轻轻将三毫升全血加至分离液上层。注意避免任何混合。

将试管放入离心机，以500 G离心45分钟。离心完成后，在室温下，外周血单个核细胞（PBMCs）已与其他血液成分分离。PBMC层位于最上层，呈现为第一层浑浊的条带。

在无菌条件下，小心移除并弃去呈清亮黄色的上层液体。然后使用 P 1000 微量移液器将 PBMC 层转移至新的锥形管中。用 PBS 洗涤 PBMC 两次，每次以 500 G 离心 5 分钟。

每次洗涤后，上清液都会略显浑浊。将细胞重悬于 20 毫升含有 10% FBS、1% 青霉素-链霉素和 1 微克/毫升植物血凝素（PHA）的 RPMI 1640 培养基中。在 PHA 存在下孵育可诱导 T 淋巴细胞的活化与扩增。

使用移液器将 PBMC 转移至 T75 培养瓶中。随后在 37°C 和 5% CO₂ 条件下孵育 1 至 24 小时。此步骤可使单核细胞贴附于培养瓶表面，从而与仍处于悬浮状态的淋巴细胞分离。

孵育结束后，小心吸除含有主要为淋巴细胞的培养基，并将其转移至15毫升锥形管中。以500 × g离心5分钟。用RPMI 1640重悬细胞沉淀，然后将细胞转移至新的T75培养瓶中，瓶内含25毫升添加了胎牛血清（FBS）、青霉素、链霉素和植物血凝素（PHA）的RPMI 1640培养基，在37°C条件下孵育。

培养24小时后，可能需要添加15至20毫升新鲜培养基，并转移至更大的T175培养瓶中。继续孵育三天或两天。如果外周血单个核细胞（PBMC）的初始孵育在三天后为过夜孵育，则使用移液器移除含有悬浮淋巴细胞的培养基，并将其转移至50毫升锥形管中，在500 ×g离心5分钟。

Reese 已将细胞沉淀重悬，并将细胞转移至一个新的 T75 培养瓶中，其中含有 25 毫升 RPMI 1640 培养基，添加 FBS、青霉素、链霉素以及人 IL-2 或 IL-15，随后将细胞放入培养箱中培养。若从一个 T75 培养瓶开始培养，则需要扩增细胞并转移至 T175 培养瓶中。

培养淋巴细胞一至两天，总共培养四至七天。在迁移实验前一天，用含20微克/毫升蛋白A或G的PBS溶液对玻璃底0.17毫米培养皿进行包被，4摄氏度孵育过夜。次日，用PBS充分洗涤培养皿，然后向培养皿中加入ICAM-1 Fc和人SDF-1的PBS溶液。

在室温下孵育四小时，以固定分子。使用血细胞计数板测定培养细胞的密度。然后用 PBS 缓冲液洗涤淋巴细胞两次，并在孵育结束后，将细胞重悬于 1 毫升含有 D-葡萄糖的 L-15 培养基中。用 ICAM-1 Fc 和 SDF-1 大量 PBS 缓冲液充分洗涤包被的培养皿，随后将 1 毫升培养基中的 T 淋巴细胞转移至该培养皿中，每皿应使用约 2 × 10⁵ 至 5 × 10⁵ 个细胞，以达到适用于迁移分析的细胞密度。

为了获得细胞迁移的图像，将培养皿置于显微镜载物台上，并置于温度可控的环境中，例如37摄氏度的加热培养室。在图像设置菜单中打开NIS Elements软件。选择2×2 binning模式用于实时成像和图像采集。

进入应用程序菜单，选择“定义”、“运行”、“实验”。设置图像之间的时间间隔以及总时长。对于图像采集序列，按下运行按钮，开始图像采集，随后进行数据获取。

可以使用 Image J Auto Quant 或 veloc 等软件包对迁移参数（如速度、路径长度和位移）进行量化。要生成蜘蛛网图，需收集每个细胞在每个时间点的 XY 坐标，并将其投影到图表上，所有细胞的起始点均位于原点。此处显示的 T 淋巴细胞在 ICAM 和 SDF-1 上培养后成像，每 10 秒拍摄一次，持续 30 分钟。

本视频展示了T淋巴细胞以大约每分钟15微米的速度进行随机迁移，使用每个细胞的XYT坐标。随机选取了15个细胞，并以原点为共同起点进行绘制。通过比较蜘蛛网图，可以快速直观地展示不同实验条件下迁移行为的差异。

左侧显示的是在对照条件下T淋巴细胞迁移的图谱，而右侧显示的是存在抗LFA-1配体阻断抗体时T淋巴细胞迁移的图谱。这些数据表明，T淋巴细胞利用整合素LFA-1在ICAM-1基质上迁移。我们刚刚向您展示了在实验过程中如何使用培养的人T淋巴细胞进行迁移实验。

需要记住的是，向 ICAM-1 包被的培养皿中加入适量的细胞非常重要，以便简化细胞追踪和迁移分析。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。