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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

迁移人T淋巴细胞分离，培养和分析

Full Text

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08:39 min

June 1, 2010

DOI: 10.3791/2017-v

Craig T. Lefort¹, Minsoo Kim¹

¹Center for Vaccine Biology and Immunology,University of Rochester

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

T淋巴细胞的迁移过程中出现归巢淋巴器官，从血管中退出，进入周围组织。在这里，我们描述了一个可以用来分析T淋巴细胞迁移的协议

Transcript

T 淋巴细胞迁移发生在归巢到淋巴器官、离开脉管系统和进入外周组织期间。这个过程涉及 T 细胞表面与其他细胞的粘附相互作用。为了在体外检查这种现象，将人 T 淋巴细胞分离、培养并置于涂有粘附蛋白的组织培养板上。

ICAM 1 和 趋化因子 SDF 1。然后可以获取和分析 T 淋巴细胞迁移的图像。大家好，我是 Craig LeFort，是罗切斯特大学疫苗生物学和免疫学中心的 Minsu Kim 实验室。

今天，我们将向您展示一种分离和培养人类青少年淋巴细胞的程序，并分析它们在体外的迁移。我们在实验室中使用这种测定法来研究整合素和 T 细胞迁移的作用。T 细胞中的主要整合素是淋巴细胞功能相关抗原 1 或 LFA 1。

LFA one 的特定配体是 icas，例如 ICAM one。此外，T 细胞迁移需要 kin 信号来提供方向性信号并激活整合素。在我们的测定中，我们使用人 ICAM one 和 CX CL 12 或 SDF 1 作为 T 细胞迁移的底物。

那么让我们开始吧。从健康捐献者那里获得人血后，让血液冷却至室温。这大约需要 30 分钟。

血液冷却后，轻轻移取 3 mL 室温多晶型密度梯度培养基放入 8 mL 圆底聚苯乙烯管中。然后在上面轻轻加入 3 毫升全血。避免任何混合很重要。

将试管放入离心机中，以 500 G 离心 45 分钟。离心后，在室温下，外周血单核细胞或 P BMC 已与其他血液成分分离。PBMC 图层显示为从顶部开始的第一个云波段。

在无菌条件下，小心地去除并丢弃透明的黄色上层相。然后使用 P 1000 微量移液器将 PBMC 层转移到新的锥形管上。用 PBS 离心细胞以 500 G 洗涤 PBMC 两次，持续 5 分钟。

每次洗涤后，上清液都会有些浑浊。将细胞重悬于 20 毫升含有 10% FBS、1% 青霉素链霉素和每毫升 1 微克的 RPMI 1640 培养基中。在 PHA 存在下，植物血凝素或 PHA 孵育可诱导 T 淋巴细胞活化和扩增。

使用移液器将 PBMC 转移到 T 75 培养瓶中。接下来，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 1 至 24 小时。此步骤允许粘附在培养瓶表面的单核细胞与保持悬浮状态的淋巴细胞分离。

孵育后，小心地去除所有主要包含淋巴细胞的培养基，并将其转移到 15 毫升锥形管中。以 500 G 离心 5 分钟。Reese 一直是 RPMI 1640 中的细胞沉淀，并将细胞转移到含有 25 毫升 RPMI 1640 和 FBS、青霉素、链霉素和 PHA 的新 T 75 flaz 中，在 37 摄氏度下孵育。

生长 24 小时后，可能需要加入 15 至 20 mL 新鲜培养基并转移至更大的 T 1 75 培养瓶中。继续孵育 3 天或 2 天。如果 PBMC 的初始孵育在 3 天后过夜，则使用移液器去除含有悬浮淋巴细胞的培养基，并将其转移到 500 G 的 50 mL 锥形管离心机中 5 分钟。

Reese 一直是细胞沉淀，并将细胞转移到含有 25 毫升 RPMI 1640 的新 T 75 中。使用 FBS，青霉素、链霉素和人 IL 2 或 IL 15 将细胞置于培养箱中。如果开始使用 T 75 培养瓶，则需要扩增培养物并将其转移到 T 1 75 培养瓶中。

1 到 2 天后，淋巴细胞生长总共 4 到 7 天。迁移测定前一天，在玻璃底 0.17 毫米培养皿中涂上每毫升 20 微克蛋白 A 或 G 的 PBS 溶液，第二天在 4 摄氏度下孵育过夜。用 PBS 充分清洗培养皿，然后将 ICAM one FC 和 PBS 溶液中的人 SD F1 添加到培养皿中。

在室温下孵育 4 小时以固定分子。使用血细胞计数器确定培养细胞的密度。然后用 PBS 洗涤淋巴细胞两次，孵育后将它们重悬于一毫升含有 D 葡萄糖的 L 15 培养基中，用 ICAM 一 FC 和 SDF 一用 PBS 广泛洗涤包被培养皿，将 T 淋巴细胞在一毫升培养基中转移到培养皿中，每个培养皿应使用大约 2 至 5 乘以 10 至第五个细胞，以达到适合迁移分析的细胞密度。

为了获得细胞迁移的图像，将培养皿放在显微镜载物台上，置于温度受控的环境（如 37 摄氏度的加热室）中。在映像设置菜单中打开 NIS Elements 软件。选择 2 x 2 像素合并作为实时成像和图像捕获的模式。

转到 applications （应用程序） 菜单，然后选择 define（定义）、run（运行）、experiment（实验）。选择图像之间的时间长度和总时间。对于图像捕获序列，按下 run 按钮，在采集后开始图像采集。

速度、光程和位移等迁移参数可以使用 Image J Auto Quant 或 veloc 等软件包进行量化。要生成蜘蛛网状图，请收集每个单元格和时间点的 XY 坐标，并将它们投影到一个图形上，每个单元格在原点处都有一个公共起点。此处显示的 T 淋巴细胞接种在 ICAM 和 SDF 1 上，每 10 秒成像一次，持续 30 分钟。

该电影展示了 T 淋巴细胞以大约每分钟 15 微米的速度随机迁移，使用每个细胞的 XYT 坐标。随机选择 15 个细胞，并在原点处以共同起点绘制。比较蜘蛛网图可以快速直观地描述不同实验条件之间的迁移差异。

左侧显示了对照条件下 T 淋巴细胞迁移的曲线，右侧显示了存在抗 LFA 单配体阻断抗体的 T 淋巴细胞迁移曲线。这些数据表明，T 淋巴细胞利用整合素 LFA one 在 ICAM one 底物上迁移。我们刚刚向您展示了如何在手术过程中使用培养的人 T 淋巴细胞进行迁移分析。

重要的是要记住向 ICAM 单涂层培养皿中添加适当数量的细胞，以便简化细胞追踪和迁移分析。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。

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