研究淋巴细胞跨微血管内皮细胞单层的迁移

取一个带有涂有 ECM 蛋白的 transwell 插入物的微孔板，以促进细胞粘附。

将人脑微血管内皮细胞（HBMEC）添加到插入物中，并将生长培养基添加到下部隔室中。

孵育，让细胞粘附并生长成单层。这些细胞表达紧密连接，模仿限制细胞和分子通过的血脑屏障内皮。

取出培养基。将外周血单核细胞或PBMC添加到插入物中，并将培养基添加到下部隔室中。

孵育，允许 PBMC 淋巴细胞与内皮细胞相互作用，然后在它们之间通过，这一过程称为迁移。

洗插入物底部，将粘附的转运细胞收集到下部隔室中。

引入荧光微珠作为细胞定量的参考。

悬浮液转移到管中，离心，弃去上清液，并重悬于荧光团偶联抗体混合物中以标记淋巴细胞。

迁移的淋巴细胞已准备好通过流式细胞术进行定量。

要制备用于迁移测定的细胞培养插入物，首先，将 100 微升纤连蛋白溶液添加到每个插入片段和 96 孔平底板的一个孔中。在37摄氏度下三小时后，用100微升HBMEC替换纤连蛋白溶液，并将600微升新鲜ECM-b培养基加入细胞培养插入物的下部隔室中。

然后，将板放回细胞培养箱中三到四天。将外周血单核细胞或PBMC样品重悬于补充有B27的RPMI培养基中，浓度为每毫升浓度的5倍10至6个细胞。接下来，从含有汇合HBMEC单层的适当数量的细胞培养插入物的下部和上部隔室中吸出培养基，并将每个供体100微升PBMC添加到细胞培养插入物中，并将每个体外对照的24孔板的一个孔中加入。

将 600 微升 RPMI 加 B27 添加到细胞培养插入物的下部隔室中，将 500 微升添加到体外对照孔中，并将板放回细胞培养箱中 6 小时。在孵育结束时，使用镊子取出细胞培养插入物，用 400 微升 PBS 小心地冲洗底部，不要接触膜。

然后，将 20 微升流式计数荧光球与实验和体外对照孔中的细胞彻底混合，并将 1 毫升所得 PBMC 悬浮液转移到适当的相应流式细胞术管中。通过离心收集细胞，并将目标荧光染料偶联抗体加入100微升流式细胞术缓冲液中到每个样品中。在4摄氏度下30分钟后，用250微升新鲜流式细胞术缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于适当体积的流式细胞术缓冲液中进行分析。