3D培養基質膜アッセイ:細胞浸潤を研究するための3次元基質膜タンパク質マトリックス上での癌細胞の培養

まず、ガラス底皿に冷たい基底膜マトリックスを注ぎ、ピペットチップで均等に広げます。膜は、二酸化炭素の連続供給で、摂氏37度で固めます。蛍光標識癌細胞をトリプシン化してプレート表面から切り離し、培地中で再懸濁する。

これらの再懸濁細胞を円錐形のチューブに移し、スピンします。上清を取り除き、培地中の細胞を再懸濁する。カウント後、所望の数の細胞を含むこの細胞懸濁液を、同じ比率で基質マトリックスと混合する。

細胞マトリックス混合物を固化した基膜マトリックスコーティング皿にそっとプレートします。セルマトリックス混合物を摂氏37度で固め、二酸化炭素を連続的に供給します。混合物が固まったら、皿に培養培地を加え、所望の期間インキュベートする。

癌細胞はアクチンが豊富な膜突起を形成し、細胞外マトリックスを分解するプロテアーゼを放出し、マトリックスに侵入する。異なる時間間隔で蛍光顕微鏡の下に皿を置き、突起を形成する細胞を分析する。このプロトコル例では、3D基膜マトリックス上の乳がん細胞を培養し、浸潤過程を研究する。

培養手順を開始する前に、基膜マトリックス、P200ピペット、ピペットチップを氷の上に一晩、摂氏4度に置きます。翌日、氷冷200マイクロリットルピペットの先端を使用して、共焦点番号1ガラス底皿の底にスパイラルパターンでマトリックスの50マイクロリットルを広げます。その後、少なくとも30分間、5%の二酸化炭素を含む37°Cの細胞培養インキュベーターに皿を置きます。

マトリックスが固化している間、トリプシン化する細胞の70%から80%のコンフルエント100ミリメートルのプレート。細胞が剥離し始めたら、トリプシンを10ミリリットルの培地で不活性化し、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移す。

100 Gsと摂氏4度で3分間遠心分離します。細胞が回転している間、 アリコート 50マイクロリットルのマトリックスを基体膜マトリックスの1皿あたり1つの1ミリリットルマイクロ遠心分離管に入れ、チューブを氷の上に置く。細胞が回転し終わったら、ペレットを乱さずに上清を吸引し、1ミリリットルの培地で細胞を再懸濁して数えます。

次に、2.5回10倍の4番目の細胞を新しいマイクロ遠心分離チューブに移し、培地で細胞懸濁液を50マイクロリットルの最終体積にトッピングします。その後、50マイクロリットルの氷冷基膜マトリックスを1:1比で細胞に加え、最終体積は100マイクロリットルです。固化した基膜マトリックス上にマトリックスを細胞混合物にそっとプレートし、細胞培養インキュベーター内のマトリックスに埋め込まれるようにします。

30分後、マトリックスを2ミリリットルの培地で覆い、皿をインキュベーターに戻し、実験の間毎日メディアを交換します。実験期間中、1日1回の光顕微鏡の10倍の目的を使用して、基部膜マトリックスに懸濁したコロニーの差動干渉コントラスト画像を20枚撮影する。画像を盲目的に分析して、細胞コロニーの星状形成を決定します。細胞のスフェロイドからの1つ以上の突起が観察された場合、コロニーは星状であると見なされる。