人皮肤角质形成细胞的分离：一种从皮肤样本中培养原代角质形成细胞的方法

— 角质形成细胞是表皮（即皮肤最外层）中最主要的细胞类型。它们在真皮层上方形成多层结构，并与多种其他细胞类型（如黑色素细胞、树突状细胞和默克尔细胞）相互关联。

为了分离角质形成细胞，首先从人皮肤中获取表皮组织。接着，用酶消化缓冲液处理组织。缓冲液中的酶可降解表皮组织中存在的细胞外基质蛋白，从而启动细胞解离。然后，加入适当的培养基，并通过机械方法破坏组织。

为了将解离的细胞释放到悬浮液中，需将表皮细胞悬液通过滤网过滤，以去除任何细胞团块或碎片。离心以沉淀表皮细胞，并将其与含有酶的上清液分离。弃去上清液，并使用优选的角质形成细胞培养基重新悬浮细胞。将细胞培养至所需时间。

在培养过程中，优化的培养基通过促进角质形成细胞相对于其他表皮细胞类型的优先生长，从而富集并扩增角质形成细胞。在以下实验方案中，我们将展示从成人人体皮肤组织中分离角质形成细胞的方法。

— 从接受整形手术的健康成年志愿者处采集10厘米×15厘米的皮肤样本。将皮肤样本置于含有制冷元件的泡沫塑料盒中运输，以保持低温。如有必要，可将皮肤样本在4摄氏度条件下保存过夜。使用灭菌剪刀、手术刀和镊子，去除皮肤组织下方的脂肪。

然后，使用针头将皮肤组织段固定在培养皿上方的无菌盖上。用一块干燥且已灭菌的纱布擦拭皮肤表面以进行清洁，接着用浸有70%乙醇的灭菌纱布进一步擦拭消毒。随后，使用足部削皮器切除皮肤组织段的表皮上层，并将其转移至一个直径9厘米的培养皿中。

然后，立即向培养皿中加入 25 毫升先前配制的 DPBS/胰蛋白酶/葡萄糖溶液。将样品在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。使用移液器从培养皿中移除 DPBS/胰蛋白酶/葡萄糖溶液，并加入 10 毫升含 2% FBS 的 RPMI-1640 以灭活胰蛋白酶。

现在，用两把镊子轻轻刮擦并搅动皮肤切片的表皮层和真皮层，使表皮细胞释放到培养基中。将表皮细胞悬液通过金属滤网过滤，并将滤液收集至一个50毫升离心管中。将剩余的皮肤切片加入含有10毫升不含FBS的RPMI-1640培养基的50毫升离心管中，涡旋振荡10秒。

将此悬液通过金属滤器过滤至含有表皮细胞悬液的50毫升离心管中。然后加入DPBS，使总体积达到50毫升。在室温下以450 × g离心10分钟。随后弃去上清液，根据细胞沉淀的大小，将表皮细胞沉淀重悬于约10毫升37摄氏度的KSFM培养基中。

使用台盼蓝染色法，在显微镜下对细胞进行计数。然后，向每个75平方厘米的培养瓶中转移8×10⁶个细胞，并加入12毫升37°C的KSFM培养基。轻轻摇动培养瓶，以确保细胞均匀分布。将角质形成细胞置于37°C、100%湿度和5% CO₂的培养箱中培养。两天后更换培养基，之后每周换液三次。