Quantitative Polymerase Chain Reaction to Enumerate Bacteriophages

为了通过定量聚合酶链反应 （qPCR） 计数噬菌体，在优化的缓冲液中获得含有 Taq DNA 聚合酶、引物、脱氧核苷酸三磷酸 （dNTP） 和荧光报告染料分子的 qPCR 反应混合物。转移到 qPCR 板的孔中。

添加经过热处理的噬菌体。热处理从噬菌体颗粒中释放噬菌体 DNA。密封板，防止混合物蒸发。将板加载到 qPCR 系统中，设置适当的循环条件。

加热到高温会使双链 DNA 变性成单链。它还激活 Taq DNA 聚合酶。退火导致序列特异性引物与互补噬菌体 DNA 链结合。延伸允许活化的 Taq DNA 聚合酶将 dNTP 添加到引物的 3' 端，从而沿 5' 至 3' 方向延伸生长的 DNA 链。

染料分子嵌入到新合成的双链 DNA 中，导致荧光强度增加。每个 PCR 循环都会使靶 DNA 量增加一倍，从而增加荧光强度。

确定测得的荧光超过背景水平的阈值循环 Ct 值。

Ct 值与起始 DNA 量成反比，每个噬菌体基因组相当于一个噬菌体颗粒，便于从噬菌体 DNA 标准曲线定量噬菌体。

扩增后，进行熔解曲线分析，逐渐提高反应温度。在特定的熔解温度下，一半的 DNA 分离成单链，释放染料分子并导致荧光突然减弱。

qPCR 产物独特的独特熔解温度验证了产品的特异性。