5-甲基胞嘧啶斑点印迹法测定 DNA 甲基化程度

DNA 甲基化是一种表观遗传修饰，涉及在 DNA 的胞嘧啶碱基上添加甲基以形成 5-甲基胞嘧啶。这种修饰会改变基因表达。

为了通过斑点印迹定量 DNA 甲基化，采集来自处于不同去分化阶段的人软骨细胞的基因组 DNA 样品，这些细胞表现出不同水平的甲基化胞嘧啶。

用氢氧化钠（一种强碱）处理 DNA 样品并加热。这种处理会破坏两条 DNA 链之间的氢键，导致 DNA 变性。添加乙酸铵以中和碱，防止 DNA 过度降解。

取尼龙膜，将变性 DNA 样品点成点。带负电荷的 DNA 通过静电相互作用与带正电荷的尼龙膜结合，导致其在固体支持物上印迹。

用封闭缓冲液处理印迹膜，以防止非特异性结合。接下来，将抗 5-甲基胞嘧啶抗体添加到膜上，并孵育。这些抗体仅与 DNA 上的甲基化胞嘧啶结合。

洗涤以去除未结合的抗体，并添加与一抗特异性结合的化学发光酶偶联二抗。

在膜上添加化学发光底物。抗体上的酶与底物反应产生化学发光，产生不同强度的点。

对膜进行成像并测量点的强度，这与每个样品中 DNA 甲基化的程度相对应。