Name: 在慢性淋巴细胞性白血病患者中使用甲基CpG结合域捕获法进行综合DNA甲基化分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: 了解甲基CpG结合域捕获法在慢性淋巴细胞性白血病中的全基因组DNA甲基化分析流程。该方法可无偏倚地识别差异甲基化区域，为疾病发病机制和预后研究提供潜在生物标志物。

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本研究由瑞典研究理事会、瑞典癌症协会、克努特和爱丽丝·瓦伦堡基金会（KAW）以及西约塔兰地区研发基金（FoU VästraGötalandsregionen）资助。

采集慢性淋巴细胞白血病（CLL）样本的伦理批准日期为2007年5月21日，注册编号为：EPN Gbg dnr 239/07。所有CLL患者均根据最新修订的诊断标准8进行确诊，并在确诊时采集样本。本研究中的患者均来自瑞典西部不同血液科，在获得书面知情同意后纳入研究。本研究仅选取外周血单个核细胞（PBMC）样本中白血病细胞肿瘤比例≥70%的慢性淋巴细胞白血病病例。
1. 准备工作
<ol>
	<li>使用商业分离试剂盒（参见材料表），按照制造商说明书从慢性淋巴细胞白血病（CLL）及正常健康外周血样本中分离PBMCs，用于DNA提取。</li>
	<li>对1.5 mL离心管进行高压灭菌。解冻甲基化DNA结合试剂盒中的所有试剂（参见材料表）。</li>
	<li>使用无DNase的水，将试剂盒提供的5倍浓缩洗涤缓冲液稀释，配制10 mL的1倍珠洗缓冲液，用于洗涤磁珠并稀释试剂盒提供的MBD蛋白。</li>
	<li>预先准备或获取以下试剂：3 M乙酸钠、无水乙醇和70%乙醇，用于DNA沉淀（材料表）。</li>
</ol>
2. 基因组DNA提取与超声处理
<ol>
	<li>根据制造商的说明书，使用市售的DNA提取试剂盒（材料表）从患者和正常PBMC样本中提取基因组DNA。使用分光光度计在260 nm处对基因组DNA进行定量。 
	注意：DNA提取柱的最大承载能力为500万至600万个细胞；因此，对于超过500万个细胞的样本，必须使用多个提取柱。用总共100 µL的10 mM Tris EDTA（TE）缓冲液分两次等体积洗脱DNA。甲基化DNA结合（MBD）测序所用的甲基化富集试剂盒中的MBD-生物素蛋白不能与单链DNA结合。因此，为保持DNA的双链结构，洗脱后的DNA必须保存在冷冻或4 °C条件下。</li>
	<li>用TE缓冲液（pH 8）将每个样本的5 µg基因组DNA稀释至总体积200 µL，最终浓度为25 ng/µL。</li>
	<li>使用超声破碎仪（材料表）在特制的管中进行超声处理，共进行30个循环（每个循环开启30秒，关闭30秒；每完成5个循环后，短暂离心以将液体收集至管底）。 
	注意：此步骤将产生长度在150 bp至300 bp之间的DNA片段，适用于本实验方案。</li>
	<li>在进行MBD测序的下一步之前，取1 µL片段化DNA样本与DNA分子量标记物一起，在市售的预制2%琼脂糖凝胶上使用DNA电泳成像设备检测所有样本的超声片段大小范围。使用标准紫外透射仪观察DNA条带。</li>
</ol>
3. MBD-生物素蛋白结合前的珠粒制备
<ol>
	<li>将试剂盒提供的磁性链霉亲和素珠从原管中重悬，轻轻吹打混匀以获得均一的悬浮液。切勿涡旋震荡珠子，也避免其干燥。</li>
	<li>将50 µL磁珠（每5 µg片段化DNA样本）分别加入已标记的干净1.5 mL离心管中。加入50 µL 1×磁珠洗涤缓冲液，使终体积达到100 µL。 
	注意：使用小容量0.5 mL聚合酶链式反应（PCR）条状管洗涤磁珠时，每管加入约150–200 µL洗涤缓冲液，具体请参见试剂盒说明书。然而，若使用1.5 mL离心管，则每管至少加入250 µL至300 µL洗涤缓冲液进行磁珠洗涤。</li>
	<li>将试管置于磁力架上静置1分钟，使所有磁珠聚集于靠近磁铁一侧的管壁内表面。使用200 µL移液器小心吸除上清液，避免触碰磁珠。</li>
	<li>从磁力架上取下离心管，加入250 µL 1×磁珠洗涤缓冲液，用移液器轻轻混匀磁珠。</li>
	<li>对所有样品重复步骤 3.3 和 3.4 至少 4–5 次，最后重悬于 250 µL 1× 磁珠洗涤缓冲液中。置于冰上保存。</li>
</ol>
4. 将 MBD-biotin 蛋白结合到已洗涤的磁珠上
<ol>
	<li>向不同的离心管中加入 35 µL MBD 蛋白（每 1 µg DNA 样品加 7 µL），再用 1x 磁珠洗涤缓冲液将总体积调至 250 µL。</li>
	<li>将 250 µL 稀释后的 MBD 蛋白加入 250 µL 已洗涤的磁珠中，室温下置于旋转混合仪上旋转 1 小时。</li>
	<li>磁珠与蛋白混合 1 小时后，洗涤与磁性链霉亲和素磁珠结合的 MBD 蛋白-生物素复合物。
	<ol>
		<li>将离心管置于磁力架上静置 1 分钟，用移液器小心吸除上清液，避免接触磁珠。加入 250 µL 1x 磁珠洗涤缓冲液，室温下在旋转混合仪上孵育 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 4.3.1 两次，最后将洗涤后的 MBD-生物素磁珠重悬于 200 µL 1x 磁珠洗涤缓冲液中，即可用于甲基化 DNA 的捕获。 
	注意：以该方式洗涤 2–3 次可彻底去除未结合的 MBD 蛋白磁珠背景，提高 MBD 蛋白偶联磁珠与片段化基因组 DNA 的结合效率。</li>
</ol>
5. 使用 MBD-biotin 磁珠结合片段化的基因组 DNA
<ol>
	<li>在洁净的1.5 mL无DNase离心管中，加入100 µL 5倍浓度的珠子洗涤缓冲液和180 µL片段化的基因组DNA（步骤2.3）。用无DNase水将终体积调至500 µL。</li>
	<li>向剩余的20 µL片段化基因组DNA中加入380 µL无DNase水，并将其冷冻保存。将这些样品作为输入DNA对照，在后续实验中与最终洗脱的甲基化DNA样品一同进行沉淀（见步骤7.1）。</li>
	<li>将含有经洗涤的MBD-生物素珠子的离心管（步骤4.4）置于磁力架上静置1分钟，小心移除上清液，避免扰动珠子。加入500 µL用珠子洗涤缓冲液稀释的片段化基因组DNA。</li>
	<li>用石蜡膜严密封闭所有离心管，置于4 °C、8–10 rpm的翻转摇床上过夜孵育。 
	注意：DNA与生物素珠子的结合反应可在室温下进行1小时完成，但4 °C过夜孵育可提高最终甲基化DNA的回收率。</li>
</ol>
6. 去除未结合的DNA并从磁珠上洗脱甲基化DNA
<ol>
	<li>DNA与MBD磁珠结合反应完成后，将离心管置于磁力架上1分钟，使所有磁珠聚集于管壁内侧。</li>
	<li>用移液器小心吸除上清液，避免接触磁珠，并将此未结合的DNA样品组分保存在冰上。</li>
	<li>向磁珠中加入200 µL 1×磁珠洗涤缓冲液，将离心管置于旋转仪上，室温旋转3分钟。随后将离心管放回磁力架上静置1分钟，吸除液体。重复该洗涤步骤两次，以彻底去除残留的未结合DNA。</li>
	<li>最后一次洗涤后，向磁珠中加入200 µL高盐洗脱缓冲液（2,000 mM NaCl，试剂盒中提供），用于DNA的洗脱。</li>
	<li>将离心管置于旋转仪上，室温旋转15分钟。然后将离心管置于磁力架上静置1分钟，用移液器小心将上清液转移至新的洁净1.5 mL离心管中。</li>
	<li>再次加入200 µL高盐洗脱缓冲液，室温旋转15分钟进行第二次洗脱。将第二次洗脱的上清液加入之前收集第一次200 µL洗脱液的同一离心管中。 
	注意：最终共400 µL洗脱DNA现已准备好进行乙醇沉淀，以获得适用于下一代测序的纯化DNA。</li>
</ol>
7. 甲基化DNA的乙醇沉淀与富集
<ol>
	<li>向400 µL洗脱的DNA以及在步骤5.2中制备的400 µL输入DNA样品中，各加入1 µL甘油原（20 µg/µL；试剂盒中提供）；40 µL 3 M乙酸钠（pH 5.2）；以及800 µL预冷的无水乙醇。</li>
	<li>使用涡旋振荡器充分混匀各管，并于-80 °C孵育过夜。</li>
	<li>在4 °C、12,000 × g（最大转速）条件下离心各管。小心弃去上清液，避免扰动沉淀。向每管中加入500 µL 70%乙醇，并涡旋振荡混匀。</li>
	<li>再次于4 °C以最大转速离心15分钟，然后用移液器小心吸除上清液。再于室温下以最大转速离心1分钟，并用移液器尖端彻底去除残留乙醇。</li>
	<li>将沉淀在室温下空气干燥5分钟。向DNA沉淀中加入10 µL无DNase的水。随后进行甲基化DNA定量（步骤7.6）、MBD测序（步骤7.7）及分析（第8和第9节）。</li>
	<li>使用市售的荧光定量试剂盒（参见材料表），按照制造商说明书对最终回收的甲基化DNA样品进行定量。</li>
	<li>注意：采用本方案，每个样品可回收30–50 ng最终DNA。DNA样品可置于干冰中运输，用于后续文库构建和高通量MBD测序。</li>
	<li>使用商业平台（材料表）进行DNA文库构建和高通量MBD测序，具体方法见参考文献9。 
	注意：为对最终甲基化DNA进行初步质量控制，应对所有样品采用50 bp双端测序方式进行文库制备。按步骤8.1所述对原始数据进行测序后质量控制处理，并按以下方法（步骤8.2–9.6）进一步使用生物信息学方法和统计学方法进行分析。</li>
</ol>
8. 生物信息学分析方法1：鉴定慢性淋巴细胞白血病相关差异甲基化区域（cllDMRs）
<ol>
	<li>使用可用的质量控制工具（如 Trimmomatic）对获得的 49-bp 读段（FASTQ 格式）进行接头序列清洁10 或使用 Cutadapt。利用 FastQC 工具包对剪切后的测序读段进行质量交叉验证： 
	java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:30:10</li>
	<li>使用短读长基因组比对工具 Bowtie 将清洗后的 FASTQ 文件与参考基因组进行比对11指定以下参数：
	<ol>
		<li>允许最多两个错配（Bowtie 参数： - v 2).</li>
		<li>将每条读段的比对结果限制为最佳的六条（Bowtie 参数： - m 6）以控制多重比对的读段。 
		bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq &#62; SAMPLE.sam 
		注意：使用 SAMtools 将比对后为各个样本生成的 SAM 文件转换为 BAM 文件。 
		samtools view -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用基于模型的ChIP-Seq分析（MACS）峰值识别工具对已比对的样本（BAM）进行分析，以预测慢性淋巴细胞白血病（CLL）亚组中的富集/甲基化区域12. 
	注意：比较 I：以 Input 样本作为对照组，正常样本和 CLL 患者样本均作为处理组。此步骤用于收集所有负向峰（即在 Input/背景中富集的峰）。比较 II：以正常样本组作为对照组，CLL 患者样本组作为处理组。获得的正向峰为 CLL 超甲基化区域，负向峰为 CLL 低甲基化区域（相对于正常样本）或差异甲基化区域（DMRs）。 
	macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam - c SAMPLE_CONTROL.bam --格式 BAM -g hs</li>
	<li>使用 BEDtools 去除差异甲基化区域（DMRs）中的比较 I 背景峰13. 
	bedtools subtract -a &#60;CLL 富集区&#62; - b &#60;输入富集区域&#62;</li>
	<li>预测重复元件（SINE-Alu、LINE、 等等。富含差异甲基化区域（DMRs）。
	<ol>
		<li>使用 fastacmd 根据参考基因组 HG19 的染色体坐标提取 DMRs 的 FASTA 序列。 
		fastacmd -d HG19_genome.fa -s 染色体 -L 起始,终止 -l 50000 &#62; DMRs.fasta</li>
		<li>使用 RepeatMasker 命令行工具预测 DMRs 的 FASTA 序列中重复元件所占的百分比。 
		RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Homer 注释预测的差异甲基化区域 &#34;annotatePeaks.pl&#34; 使用现有的 Ensembl [PMC4919035] 或 Gencode [PMID 22955987] 转录本注释（包括蛋白质编码和非编码转录本）。 
	annotatePeaks.pl DMRs.bed &#60;基因组&#62; -gtf &#60;Ensembl 或 Gencode GTF&#62; 
	注意：此数据提供了不同基因区域上峰分布的信息（即， 启动子、外显子、内含子、3'非翻译区和5'非翻译区）以及基因间区域。与差异甲基化区域（DMRs）相关的转录本或基因称为差异甲基化基因（DMGs）。</li>
	<li>使用更新后或当前的功能数据库，通过富集分析工具找出由CLL差异甲基化基因（仅限蛋白编码基因）显著富集的功能14. 
	注意：基于功能注释的基因集聚类（GeneSCF）14 是一种基于实时数据的功能富集分析工具，采用更新后的KEGG和基因本体（Gene Ontology）作为参考数据库。</li>
</ol>
9. 生物信息学分析方法2：鉴定与慢性淋巴细胞白血病相关的显著差异甲基化区域（cll sigDMR）
<ol>
	<li>参照方法I（第8节）中的步骤8.1-8.5，并利用步骤9.2-9.6中详述的可用工具，采用基于读段数的差异富集分析，为分析流程增加一个层次的统计学验证。</li>
	<li>使用正常样本和慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者样本，量化比对到各个峰或差异甲基化区域（DMRs）的读段数量 &#34;featureCounts&#34; 来自 &#34;Subread&#34; 包装15. 
	subread/bin/featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam 
	注意：可引入比对质量过滤以避免对低质量读段进行定量例如：-Q 30）在此步骤中，为获得的差异甲基化区域（DMRs）准备SAF文件。有关SAF文件格式的更多信息，请访问此链接 http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/。</li>
	<li>使用包含正常样本组和CLL患者样本组中各峰读段数的RAW读段计数表作为edgeR的输入16. 
	注意：比较正常样本组与慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者样本组以鉴定显著差异甲基化区域（sigDMRs）。对于差异富集分析，请参照 edgeR 用户指南中的详细分步说明（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf）。</li>
	<li>使用 edgeR 预测的错误发现率（FDR）和对数倍数变化对 sigDMRs 进行筛选16.</li>
	<li>使用 Homer 注释预测的 sigDMR &#34;annotatePeaks.pl&#34; 使用现有的 Ensembl 或 Gencode 转录本注释（蛋白质编码和非编码转录本）。 
	annotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf &#60;Ensembl 或 Gencode GTF&#62; -CpG 
	注意：此数据提供了不同基因区域上峰分布的信息即， 启动子、外显子、内含子、3'非翻译区和5'非翻译区）以及基因间区域。与显著差异甲基化区域（sigDMRs）相关的转录本或基因称为显著差异甲基化基因（sigDMGs）。</li>
	<li>使用更新或当前的功能数据库，通过富集分析工具找出由CLL sigDMGs（仅限蛋白质编码基因）显著富集的功能14. 
	注意：GeneSCF 是一种用于功能富集分析的实时工具，采用 KEGG 和基因本体（Gene Ontology）作为参考数据库。</li>
</ol>

<ol><li>Kanduri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genome-wide+array-based+methylation+profiles+in+prognostic+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 115 (2), 296-305 (2010).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

MBD-seq 是一种基于免疫沉淀的经济高效的技术，可用于研究具有全基因组覆盖范围的甲基化模式。MeDIP-seq（甲基化DNA免疫沉淀后接测序）和 MBD-seq 均可实现富含 CpG 的甲基化 DNA 的富集。然而，与 MeDIP-seq 相比，MBD-seq 对富含 CpG 的区域具有更高的结合亲和力19。利用甲基结合富集试剂盒，可通过高盐和低盐缓冲液分别洗脱出高 CpG 富集和低 CpG 富集的 DNA 区域。在本研究中，仅进行单一分数洗脱，以捕获高度富集的 CpG 富集区域，覆盖大多数 CpG 岛。
MBD-seq 可作为 WGBS 的一种强大替代方法，后者常用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）及其他白血病研究。尽管与基于亚硫酸氢盐转化的方法相比，MBD-seq 需要相对更多的起始 DNA 量，但它能够特异性地检测仅与 5 mC 修饰相关的全基因组甲基化变化，且不会因转化后的 PCR 扩增而引入偏差。因此，MBD-seq 是研究 cllDMGs 的理想方法，这些基因可能是具有预后价值的潜在表观遗传学 CLL 标志基因。
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近年来，利用下一代测序技术分析全基因组DNA甲基化谱的方法日益普及。基于以下三种原理，已开发出多种全基因组甲基化检测方法，包括基于微阵列和非微阵列的技术：基因组DNA的亚硫酸氢盐转化、甲基化敏感性限制性内切酶消化，以及使用甲基化CpG特异性抗体对甲基化DNA进行免疫沉淀。
异常DNA甲基化是白血病和淋巴瘤（包括慢性淋巴细胞白血病，CLL）的标志性特征之一。此前，包括我们团队在内的多个研究小组利用基因组DNA的亚硫酸氢盐转化，结合微阵列方法或全基因组测序技术，对不同CLL预后亚组以及正常健康B细胞对照的DNA甲基化谱进行了表征1,2,3,4。基因组DNA经亚硫酸氢盐转化后，未修饰的胞嘧啶会脱氨为尿嘧啶，而基因组中已甲基化的胞嘧啶则保持不变。转化完成后，可通过PCR扩增和测序，结合不同的定性或定量方法（如基于微阵列的分析或全基因组亚硫酸氢盐测序，WGBS）来确定DNA的甲基化状态。尽管基于亚硫酸氢盐转化的方法具有多种优势，并已被广泛应用于多种癌症中DNA甲基化水平的分析，但该技术仍存在一些局限性。WGBS测序可在使用较少DNA量的情况下实现单碱基对分辨率，是分析大量样本的最佳选择。然而，该方法无法区分基因组中5mC与5hmC之间的修饰差异5,6。此外，基于微阵列的方法无法对整个基因组提供完全覆盖。
在我们实验室最近的一项研究中7基于免疫沉淀的方法而非亚硫酸氢盐转化法，被用于在全球范围内鉴定慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者与正常健康对照者中富含CpG的差异甲基化区域。在甲基化CpG结合结构域（MBD）下一代测序（MBD-seq）中，双链片段化DNA的富集程度取决于CpG甲基化的水平。该方法可克服亚硫酸氢盐转化法的局限性，并能以无偏倚且不依赖PCR的方式实现对CpG甲基化的全基因组覆盖。此外，与基于亚硫酸氢盐转化的微阵列方法不同，MBD-seq可用于分析重复序列元件的甲基化状态，例如长散布核元件（LINEs）、短散布核元件（SINEs）和长末端重复序列（LTRs）。 等等然而，与亚硫酸氢盐转化方法相比，MBD-seq 实验方案需要相对大量的起始 DNA。此外，测序读长的质量和数据质量取决于所用抗体的特异性、亲和力和质量。
本研究介绍了一种详细的甲基化DNA结合测序（MBD-seq）方案，用于富集甲基化DNA以进行下一代测序。该方法采用一种 commercially available 甲基化DNA结合富集试剂盒（见材料表），并结合计算分析流程，对甲基化测序数据进行可视化和解读，以鉴定与正常健康对照相比，慢性淋巴细胞白血病（CLL）特异性的高甲基化和低甲基化区域。该方法的基本原理是利用人MBD2蛋白的甲基化DNA结合结构域（MBD）与甲基化CpG位点的特异性结合能力，从而富集含有甲基化CpG的DNA片段，随后对富集的甲基化DNA进行高通量测序。

<table><tbody><tr><td>DNeasy 血液与组织试剂盒</td><td>Qaigen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep 溶液</td><td>A X I S-S H I E L D</td><td>1114544</td><td></td></tr><tr><td>Nano drop 2000</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液 pH 8</td><td>Sigma aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor 标准超声破碎仪</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>TPX Bioruptor 管（1.5 mL）</td><td>Diagenode</td><td>C30010010-300</td><td></td></tr><tr><td>3 M 醋酸钠</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>E-gel iBase 安全成像仪组合试剂盒</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G6465EU</td><td></td></tr><tr><td>E-gel 2% 琼脂糖凝胶</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G441002</td><td></td></tr><tr><td>MethylMiner 甲基化 DNA 富集试剂盒</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Labquake 管式振荡器/旋转器</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>415110</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-S</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>12620-848</td><td></td></tr><tr><td>绝对乙醇</td><td>任意公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>任意公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无 DNA 酶水</td><td>Milli Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 沉淀剂（3M 醋酸钠）</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>安全密封 1.5 mL Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0.5 mL 管</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Hiseq2000 平台</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅&amp;nbsp;</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>管式旋转器</td><td>Labquake</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用基于甲基化cpg结合结构域捕获的方法对中国台湾慢性淋巴细胞白血病患者的全面dna甲基化分析

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

长链非编码RNA（lncRNA）在癌症中的作用正日益受到关注，原因是人们越来越希望了解其在癌症发生和发展过程中的分子机制。然而，lncRNA及重复序列在癌症中的全基因组表观遗传调控尚未得到充分研究，尤其是在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中。本研究采用了一种独特的方法：利用甲基结合域（MBD）蛋白对双链甲基化DNA片段进行基于免疫沉淀的富集，随后结合高通量测序技术（MBD-seq）。研究中使用了属于两种不同预后亚组的CLL患者样本（5份IGVH突变样本 + 5份IGVH未突变样本）。分析结果显示，与正常健康对照相比，共鉴定出5,800个高甲基化和12,570个低甲基化的CLL特异性差异甲基化基因（cllDMGs）。尤为重要的是，本研究识别出多个具有潜在预后价值的CLL特异性差异甲基化lncRNA、重复元件以及蛋白编码基因。本文详细描述了一种为CLL患者样本设计的MBD-seq实验及生物信息学分析流程，用于全面分析富含CpG区域的全基因组甲基化谱。最后，通过焦磷酸测序——一种高度定量的CpG甲基化水平分析方法——对一个蛋白编码基因和一个lncRNA进行了验证，进一步支持了MBD-seq实验结果的可靠性。

最近对慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者及其匹配的正常健康对照样本进行了MBD-seq分析，以鉴定CLL特异性的差异高甲基化和低甲基化基因7。用于分析CLL和正常健康样本数据的实验与生物信息学流程如图1A和1B所示。这些分析鉴定出多个CLL特异性的差异甲基化区域（cllDMRs），这些区域在IGHV突变型和IGHV未突变型样本中相较于对照样本显著呈现高/低甲基化状态，p值&#60;0.00001。图2A展示了来自正常B细胞和正常PBMC比较所得的所有cllDMRs。所有cllDMRs均被定位至不同类别的蛋白编码基因和非编码基因，如图2B所示。重要的是，在本分析中，CLL患者样本分别与两种不同的正常对照（分选的B细胞和PBMCs）独立进行比较。有趣的是，当与正常B细胞对照和正常PBMC对照样本比较时，分析结果显示大量共...

本研究介绍了一种优化的甲基化CpG结合域（MBD）测序方案及相应的计算分析流程，用于鉴定慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中差异甲基化的富含CpG区域。

利用基于甲基化CpG结合结构域捕获的方法对中国台湾慢性淋巴细胞白血病患者的全面DNA甲基化分析

长链非编码RNA（lncRNAs）在癌症中的作用正随着人们对lncRNAs在肿瘤发生发展过程中机制功能研究兴趣的增加而日益凸显……

本实验的总体目标是通过下一代测序技术研究慢性淋巴细胞白血病患者全基因组甲基化谱，并鉴定差异甲基化的富含CpG区域。该方法有助于解答表观遗传学领域的关键问题，例如识别潜在的慢性淋巴细胞白血病特异性标志基因、疾病发病机制及预后相关基因。该技术的主要优势在于能够以无偏倚且不依赖PCR的方式实现对全基因组CpG甲基化的全面覆盖。首先，按照制造商提供的说明书，使用市售的DNA提取试剂盒从患者及正常的外周血单个核细胞样本中分离基因组DNA。根据文本方案中所述方法对基因组DNA进行定量后，将每个样本的5微克基因组DNA用TE缓冲液稀释至总体积200微升，得到终浓度为25纳克/微升的溶液。接下来，在特制的试管中使用超声波破碎仪进行超声处理，总共进行30个循环，每个循环包括30秒超声开启和30秒关闭。每经过五个循环后，短暂离心管子，使样品沉降至管底。使用DNA电泳检测所有样品的超声破碎效果，具体步骤见文中的实验方案。为准备磁性链霉亲和素珠，首先将试剂盒提供的原液管中的珠子重新悬浮。轻轻吹打磁珠，使其上下混匀，形成均匀的悬浮液。每5微克片段化DNA样本，取50微升磁珠悬液加入到分别标记的洁净1.5毫升离心管中。每管加入50微升1×磁珠洗涤缓冲液，使终体积达到100微升。将离心管置于磁力架上静置1分钟，使所有磁珠聚集在靠近磁铁一侧的管壁上。使用200微升移液器小心吸除上清液，避免触碰磁珠。随后将离心管从磁力架上取下，加入250微升1X磁珠洗涤缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀磁珠。对所有样品至少重复上述步骤四次后，最后将样品重悬于 250 微升 1X 磁珠洗涤缓冲液中。将样品置于冰上保存。为使 MBD-生物素蛋白与洗涤后的磁珠结合，首先将 35 微升蛋白分别加入不同的离心管中，并用 1X 磁珠洗涤缓冲液将总体积调至 250 微升。向250微升洗涤后的磁珠中加入250微升稀释的MBD蛋白，于室温下轻轻旋转孵育。蛋白与磁珠混合孵育一小时后，将离心管置于磁力架上静置一分钟，使磁珠吸附；随后用移液器小心移除上清液，避免接触磁珠。然后，加入 250 微升 1× 磁珠洗涤缓冲液，将离心管置于旋转混合仪上，在室温下孵育 5 分钟。重复洗涤步骤两次，再将洗涤后的 MBD-生物素磁珠重悬于 200 微升 1× 磁珠洗涤缓冲液中，使磁珠准备好用于甲基化 DNA 的捕获。在一支洁净的 1.5 毫升无 DNase 离心管中，加入 100 微升每毫升磁珠洗涤缓冲液和 180 微升片段化的基因组 DNA。用无DNase水将终体积调至500微升。向剩余的20微升片段化基因组DNA中加入380微升无DNase水。将样品冷冻，以备后续进一步处理，并用作输入DNA对照。将含有洗涤后MBD-生物素磁珠的离心管置于磁力架上静置1分钟，移除上清液，注意不要扰动磁珠。随后，向每管中加入500微升用磁珠洗涤缓冲液稀释的片段化基因组DNA。用石蜡膜密封所有离心管，置于4摄氏度、每分钟8至10转的翻转摇床中孵育过夜。在DNA与MBD磁珠结合反应完成后，将离心管置于磁力架上静置1分钟，使所有磁珠聚集于管壁内侧。用移液器小心吸除上清液，避免接触磁珠，并将此未结合的DNA样品组分保存在冰上。随后向磁珠中加入200 µL 1×磁珠洗涤缓冲液，将离心管置于旋转仪上，在室温下孵育3分钟。使用磁力架去除液体后，再重复洗涤两次，以去除残留的未结合DNA。最后一次洗涤后，加入试剂盒中提供的200微升高盐洗脱缓冲液，以洗脱DNA。然后，将离心管置于旋转架上，在室温下孵育15分钟。孵育结束后，将样品置于磁力架上静置1分钟，用移液器小心将上清液转移至新的洁净1.5毫升离心管中。随后，向磁珠中加入200微升高盐洗脱缓冲液，于室温下旋转孵育15分钟，进行第二次洗脱。将第二次洗脱液加入同一管中，与先前的200微升第一次洗脱液合并。为了沉淀DNA，向400微升洗脱的DNA中加入1微升糖原、40微升3摩尔的醋酸钠（pH 5.2）以及800微升预冷的无水乙醇。同时，将上述试剂加入先前已冷冻的400微升输入DNA对照样品中。充分涡旋混匀各管，然后在-80摄氏度下孵育过夜。第二天，在 12,000 × g 和 4 °C 条件下离心试管 30 分钟。小心弃去上清液，避免扰动沉淀。然后，加入 500 µL 70% 乙醇，并涡旋振荡试管。在相同条件下再次离心，但离心时间为15分钟，然后用移液器小心吸去上清液。接着，在室温下以最大转速离心1分钟，并用移液器枪头彻底去除残留的乙醇。将沉淀物在室温下空气干燥5分钟。最后，在进行甲基化DNA定量、MBD测序及分析之前，向DNA沉淀中加入10 µL无DNase的水，具体步骤如文本方案所述。分析结果显示，与正常对照相比，CLL样本中存在多个差异性高甲基化和低甲基化区域。这些差异甲基化区域被定位至不同类别的蛋白质编码基因和非编码基因。最后，数据分析显示，通过两种不同正常对照比较获得的慢性淋巴细胞白血病（CLL）相关差异甲基化区域之间存在显著重叠。在此，利用焦磷酸测序技术，在大量CLL样本中验证了两个差异甲基化基因靶向区域内所有CpG位点。本文展示了该方法所需的理想超声处理范围。这一片段化DNA的片段范围非常适合用于下一代测序。只要掌握该技术，若操作得当，可在两天内完成。在实施该实验过程中，影响最终DNA回收效果的关键因素包括所用起始DNA的质量和数量，以及超声处理后DNA片段的大小范围。我们决定采用这种方法，因为这是首个基于免疫沉淀富集全基因组甲基化DNA区域的慢性淋巴细胞白血病（CLL）全基因组甲基化研究。该技术的意义可延伸至预后判断或治疗领域，因为所鉴定出的差异甲基化特征基因可作为全局性正常生物标志物以及表观遗传治疗靶点。在完成该操作流程后，所富集的甲基化DNA可用于其他下游应用，例如通过杂交或进行微阵列分析，利用芯片上固定的CpG位点集合，便捷地比较两个样本或不同疾病状态之间的甲基化组差异。最后，这是一种经济高效的技术，可用于分析大量患者样本中基因组范围内的甲基化序列，包括覆盖蛋白质编码基因的已注释序列以及覆盖重复元件和长链非编码RNA的非注释序列。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

在慢性淋巴细胞性白血病患者中使用甲基CpG结合域捕获法进行综合DNA甲基化分析

DNA甲基化分析的金标准是亚硫酸氢盐转化DNA的基因组测序。该方法利用了在酸性条件下，胞嘧啶对亚硫酸氢盐脱氨作用的敏感性高于5-甲基胞嘧啶（5-MeC）的特性。在对目标基因组DNA进行PCR扩增后，可区分未甲基化的胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶。...

DNA甲基化：亚硫酸氢盐修饰与分析

本视频展示了多重液滴式聚合酶链式反应技术，用于同时定量不同白细胞群体中的甲基化DNA区域，作为临床诊断和预后的早期生物标志物。...

多重液滴聚合酶链式反应检测白细胞DNA甲基化

增强型简化表示亚硫酸氢盐测序是一种基于限制性内切酶消化结合胞嘧啶亚硫酸氢盐转化的DNA甲基化分析测序文库制备方法。该方案需要50...

增强型简化表示亚硫酸氢盐测序法用于单碱基分辨率下的DNA甲基化分析

亚硫酸氢盐扩增子测序（BSAS）是一种用于定量目标基因组区域中胞嘧啶甲基化水平的方法。该方法在下一代测序之前，结合亚硫酸氢盐转化与目标区域的PCR扩增，从而在单碱基水平上实现DNA甲基化的绝对定量。...

通过下一代测序进行靶向DNA甲基化分析

本文介绍了一种利用甲基结合DNA捕获测序技术（MBDCap-seq 或...

用于患者组织的甲基化结合DNA捕获测序

新发现的5-甲基胞嘧啶（oxi-mCs）氧化形式，包括5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），可能代表具有独特功能作用的独立DNA修饰。本文描述了一种用于可视化oxi-mCs空间分布、信号强度分析及共定位的半定量工作流程。...

DNA修饰的免疫染色：共聚焦图像的计算分析

本文描述了采用甲基化特异性探针扩增法分析经骨肉瘤来源的细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1元件甲基化水平的方法。同时展示了常用于从胎牛血清中分离细胞外囊泡的超速离心法。...

骨肉瘤来源细胞外囊泡处理的间充质干细胞中LINE-1甲基化分析

本文描述了一种用于胃肠道癌症中全基因组DNA甲基化分析的实验方法。该方法适用于研究基因甲基化模式与胃肠道癌症发生过程中致癌因素之间关系的相关研究。...

胃肠道癌症中DNA甲基化的全基因组分析

通过定量DNA甲基化模式，表观遗传标记可用于白细胞（WBC）亚型分型。本方案介绍了一种基于热塑性弹性体（TPE）微流控装置的多重液滴聚合酶链式反应（mdPCR）方法，用于生成液滴，从而实现对白细胞分类计数中甲基化特异性靶标的精确定量和多重检测。...

使用聚合物微滴生成装置进行甲基化特异性多重微滴PCR用于血液学诊断

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DNA甲基化的样本制备到生物信息学分析：肥胖及相关性状研究的关联策略

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