在慢性淋巴细胞性白血病患者中使用甲基CpG结合域捕获法进行综合DNA甲基化分析

该程序的总体目标是研究整体甲基化分析，并使用下一代测序在慢性淋巴细胞白血病患者中鉴定差异甲基化的 CpG 富集区域。这种方法可以帮助回答表观遗传学领域的关键问题，例如识别潜在的 CLL 特异性特征基因、疾病发病机制和预后。该技术的主要优点是它以无偏倚且不依赖 PCR 的方式提供完整的 CpG 甲基化全基因组覆盖。

首先，根据制造商的方案，使用市售的 DNA 提取试剂盒从患者和正常外周血单核细胞样品中分离基因组 DNA。按照文本方案中的说明定量基因组 DNA 后，使用 TE 缓冲液从每个样品中稀释 5 μg 基因组 DNA，至总共 200 μL，最终浓度为每微升 25 ng。接下来，使用超声仪在专门设计的试管中进行超声处理，总共 30 个循环，每次开 30 秒，关 30 秒。

每五个循环后，短暂旋转试管以将样品收集到底部。按照文本实验步骤中的说明，使用 DNA 电泳检查所有样品的超声处理范围。要制备磁性链霉亲和素微珠，首先将它们从试剂盒提供的储备管中重新悬浮。

轻轻地上下移液珠子以获得均匀的悬浮液。对于每 5 μg 片段化 DNA 样品，将 50 μL 微珠放入单独、清洁并标记的 1.5 mL 试管中。加入 50 μL 1X 微珠洗涤缓冲液，使最终体积达到 100 μL。

将磁珠放在磁力架上 1 分钟，让所有磁珠集中在面向磁体的磁珠管内壁上。使用 200 μL 移液器在不接触珠子的情况下去除液体。然后，从磁力架上取下试管，加入 250 μL 1X 磁珠洗涤缓冲液，并用移液管轻轻混合磁珠。

对所有样品重复这些步骤至少 4 次后，最后将样品重悬于 250 μL 1X 磁珠洗涤缓冲液中。将样品放在冰上。要将 MBD-生物素蛋白与洗涤的磁珠结合，首先将 35 μL 蛋白添加到单独的试管中，并使用 1X 磁珠洗涤缓冲液将总体积增加到 250 μL。

将 250 微升稀释的 MBD 蛋白添加到 250 微升洗涤的珠子中，并让它们在室温下端到端旋转。将磁珠与蛋白质混合 1 小时后，将试管放在磁力架上 1 分钟，洗涤蛋白结合的磁性链霉亲和素磁珠。使用移液管去除液体，不要接触珠子。

然后，加入 250 μL 1X 微珠洗涤缓冲液，并将试管置于旋转混合器上，在室温下放置 5 分钟。再重复洗涤步骤两次，然后将洗涤后的 MBD-生物素微珠重新悬浮在 200 μL 1X 微珠洗涤缓冲液中，使微珠可用于甲基化 DNA 捕获。在干净的 1.5 mL 无 DNase 试管中，加入 100 μL 微珠洗涤缓冲液和 180 μL 片段化基因组 DNA。

使用不含 DNase 的水将最终体积降至 500 μL。将 380 微升不含 DNase 的水添加到剩余的 20 升片段化基因组 DNA 中。冷冻样品以便稍后进一步处理，并将其用作输入 DNA 对照。

将含有洗涤过的 MBD-生物素珠子的试管放在磁力架上 1 分钟，然后在不干扰珠子的情况下去除液体。然后，加入 500 μL 在磁珠洗涤缓冲液中稀释的片段化基因组 DNA。用石蜡膜密封所有试管，并在 4 摄氏度下以每分钟 8 至 10 转的速度在端到端旋转支架上放置过夜。

DNA 和 MBD 磁珠结合反应后，将试管放在磁力架上 1 分钟，以将所有磁珠集中在试管内壁上。用移液管除去上清液，不要接触珠子，并将未结合的 DNA 样品组分保存在冰上。然后向微珠中加入 200 μL 1X 微珠洗涤缓冲液，并将试管在室温下放在旋转支架上 3 分钟。

使用磁力架去除液体后，再重复洗涤两次以去除残留的未结合 DNA。最后一次洗涤后，加入试剂盒中提供的 200 μL 高盐洗脱缓冲液以洗脱 DNA。然后，将试管在室温下放在旋转支架上 15 分钟。

孵育后，将它们放在磁力架上 1 分钟，然后用移液管小心地将上清液转移到新的、干净的 1.5 毫升试管中。接下来，向磁珠中加入 200 μL 高盐洗脱缓冲液，并在室温下旋转试管 15 分钟以重复洗脱。将第二次洗脱液添加到含有 200 μL 第一次洗脱液的同一管中。

要沉淀 DNA，将 1 微升糖原、40 微升 3 摩尔乙酸钠（pH 值为 5.2）和 800 微升冰冷的无水乙醇添加到 400 微升洗脱的 DNA 中。同时将试剂添加到先前冷冻的 400 μL 输入 DNA 对照样品中。通过涡旋充分混合试管，然后在零下 80 摄氏度下孵育过夜。

第二天，将试管以 12， 000 倍 g 和 4 摄氏度离心 30 分钟。小心丢弃上清液，不要干扰沉淀。然后，加入 500 微升 70% 乙醇并涡旋试管。

使用相同的条件再次离心试管 15 分钟后，使用移液管小心地去除上清液。然后，在室温下以最大速度离心试管 1 分钟，并使用移液器吸头完全去除残留的乙醇。在室温下将沉淀风干 5 分钟。

最后，在 DNA 沉淀中加入 10 微升不含 DNase 的水，然后按照文本方案中的说明进行甲基化 DNA 定量、MBD 测序和分析。与正常对照相比，分析确定了 CLL 样本中富集的几个差异高甲基化和低甲基化区域。这些差异甲基化区域被定位到不同类别的蛋白质编码和非编码基因。

最后，数据分析显示从两个不同的正常对照比较中获得的 CLL 相关差异甲基化区域之间存在显着重叠。在这里，使用焦磷酸测序在大量 CLL 样品中验证了位于两个差异甲基化基因靶标区域的所有 CpG 位点。该方法所需的最佳超声处理范围如下所示。

这一系列片段化 DNA 是理想的，更适合用于下一代测序目的。一旦掌握，如果做得好，这项技术可以在两天内完成。在尝试该程序时，影响最终 DNA 回收的关键因素是所用输入 DNA 的质量和数量以及超声处理后片段化 DNA 的范围。

我们决定使用这种方法，因为它是第一个基于免疫沉淀的 CLL 全局甲基化研究，用于富集覆盖整个基因组所有甲基化区域的甲基化 DNA。该技术的意义延伸到预后或治疗，因为已鉴定的差异甲基化特征基因可以作为治疗的全局正常生物标志物和表观遗传靶标。在此程序之后，富集的甲基化 DNA 可用于其他下游应用，如杂交或进行微阵列分析，以使用阵列上存在的一组固定 CpG 位点轻松比较两个样品或疾病实体之间的金属组或疾病实体。

最后，这是一种经济高效的技术，可以分析大量患者样本中基因组中的甲基化序列，包括跨越蛋白质编码基因的注释序列以及跨越重复元件和长非编码 RNA 的非注释序列。