Southern 印迹检测小鼠胚胎干细胞基因组中的同源重组

Southern 印迹涉及通过基于探针的检测从复杂的 DNA 混合物中鉴定特定的 DNA 序列。

要使用 Southern 印迹鉴定小鼠胚胎干细胞中的同源重组或 HR 事件，请从细胞中获取基因组 DNA。与限制性内切酶一起孵育，将 DNA 消化成更小的片段。

将 DNA 上样到琼脂糖凝胶上。进行电泳，实现基于大小的片段分离。

用酸性溶液处理凝胶以去除嘌呤碱基，松开双链 DNA dsDNA。加入碱性变性溶液。高 pH 值会破坏氢键，将松散的 dsDNA 变性为单链 DNA，即 ssDNA。与中和溶液一起孵育以中和凝胶 pH 值。

使用印迹纸、尼龙膜和堆叠在膜顶部的凝胶组装转印系统。执行传输。ssDNA 通过向下的毛细管作用从凝胶转移到膜上。

用紫外线照射膜，交联并固定 DNA。将膜放入含有杂交溶液的试管中。旋转孵育，包被膜并防止非特异性探针结合。

最后，将膜与含有单链放射性标记探针的杂交缓冲液一起孵育。探针通过序列互补性与特定 DNA 区域结合。

清洗膜，去除未结合的探针。将膜暴露在 X 射线下。膜上不同的条带将包含 HR 事件的 DNA 区域与对照区域区分开来。