Southern 印迹检测小鼠胚胎干细胞基因组中的同源重组

对于每个 gDNA，每个样品混合 30 μL 10X Dra I 缓冲液、3 μL Dra I 和 10 μg gDNA。加水至最终体积为 30 μL，并在 37 摄氏度下孵育过夜以消化 gDNA。

用溴化乙锭制备 1% 琼脂糖电泳凝胶。将先前采集的样品连同 1 Kb 分子量标准一起加载到凝胶上，并在 30 至 40 伏特下运行过夜。第二天，将凝胶浸泡在装有 0.2 牛顿盐酸溶液的托盘中。使用摇床在室温下轻轻摇晃托盘 20 分钟。

将凝胶转移到含有 DNA 变性溶液的托盘中。在室温下轻轻摇晃 20 分钟。然后，将凝胶转移到装有 DNA 中和溶液的托盘中，并在室温下轻轻摇晃 20 分钟。使用快速向下转印系统，将 DNA 从凝胶转移到膜上。

接下来，按照制造商提供的说明组装 TurboBlotter 和印迹膜组。之后，取出膜，用 2X 生理盐水柠檬酸钠洗涤 1 分钟。用组织吸收液体，然后使用 UV 交联剂将 DNA 与膜交联。

要开始用放射性标记 DNA 探针，请将热变性的探针 DNA 添加到含有即用型 DNA 标记珠的试管中。上下移液混合，并加入 5 微升放射性标记的三磷酸脱氧胞嘧啶。在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。根据制造商提供的说明，使用 G-50 微柱纯化标记的探针。使用闪烁计数器测量放射性。

要开始将膜与标记的探针杂交，请将膜放入杂交管中。添加混合预杂交溶液。将试管放入杂交炉中，让预杂交在 42 摄氏度下进行 30 分钟。

然后，从烘箱中取出试管，将预杂交溶液倒入 50 毫升试管中。加入变性探针并轻轻混合。将混合杂交溶液加入杂交管中，然后将管放回杂交炉中。然后，让杂交进行过夜。

要去除非杂交探针，请将膜放入含有 1x 含 0.1% SDS 的盐水-柠檬酸钠的托盘中，并在 55 至 60 摄氏度下轻轻摇晃 10 分钟。之后，用保鲜膜包裹膜，并将其固定在曝光盒中。在暗室中，将膜暴露在 2 张 X 射线胶片下。冲洗胶片以可视化结果。