研究离体条件下 HIV 发病机制的人宫颈粘膜感染模型

将宫颈子宫黏膜放入培养皿中。将宫颈外粘膜和宫颈内膜与粘膜下层分开。将粘膜层切成更小的外植体并将它们转移到锥形管中。

将人类免疫缺陷病毒 1 型或 HIV-1 添加到外植体管中。HIV-1 病毒颗粒接近暴露的粘膜层并与宿主细胞上的 CD4 受体和 CXCR4 共受体结合。

结合后，病毒包膜与宿主细胞膜融合，将含有病毒RNA和逆转录酶的病毒衣壳释放到细胞质中。在细胞质内，逆转录酶将病毒 RNA 转化为互补 DNA 或 cDNA。

cDNA 进入宿主细胞核，整合酶将病毒 DNA 掺入宿主基因组。病毒 DNA 指导新病毒 RNA 和蛋白质的合成，这些 RNA 和蛋白质组装成新的病毒颗粒。这些颗粒从宿主细胞中萌芽，获得脂质包膜。

用合适的缓冲液冲洗外植体以去除任何未结合的病毒。最后，将外植体放在明胶海绵上，放入具有合适培养基的多孔板中并孵育。

气液界面最大限度地提高了氧气暴露和营养物质通过海绵毛细血管的可及性，从而提高了下游分析的模型可行性。

使用培养皿的盖子作为切割表面来解剖组织。用镊子轻轻握住组织，用手术刀和刀片将颈外和/或宫颈内膜的粘膜与基质和粘膜下层的粘膜分离，以获得粘膜条。将粘膜切成 2 毫米宽的条状。尽可能多地去除并丢弃粘膜下层，只留下一层 2 毫米厚的组织。然后，将条带切成 2 毫米厚的块。

将组织外植体转移到含有 10 至 20 毫升 CMT 的新 100 毫米培养皿中，以避免在进行解剖时组织干燥。在解剖结束时，旋转板以随机化外植体分布。使用无菌镊子，将外植体转移到无菌的 1.5 毫升锥形管中。使用移液器去除管中的任何介质。

为了获得最佳效果，应在手术后尽快处理和感染子宫颈外植体，最好是在手术当天。或者，组织可以浸泡在 4 度的 CMT 中过夜，并在解剖后立即感染。

37 摄氏度的水浴中解冻 HIV-1 制剂。解冻后，将病毒转移到含有外植体的试管中。将试管转移到热振荡器中，并在 37 摄氏度下孵育两小时，以 300 RPM 摇摆。每 30 至 60 分钟轻轻倒置管子几次。

同时，用每孔3至4毫升的无菌磷酸盐缓冲盐水填充六孔板。在与 HIV-1 孵育结束时，使用移液器将含有外植体的试管中的所有病毒制剂丢弃到装有消毒液的容器中。然后，使用镊子和移液器将外植体转移到含有PBS的六孔板中。

让外植体在室温下在PBS中静置一分钟后，通过轻轻地将PBS上下移液到孔中两到三次来清洗它们。然后，使用移液器将PBS丢弃到装有消毒剂溶液的容器中。向每个孔中加入 3 至 4 毫升新 PBS。再重复两次，总共洗涤三次。在将外植体转移到海绵之前丢弃PBS，以避免组织干燥。

现在，使用镊子将每个明胶海绵顶部的五到八个外植体转移到 12 孔板中。将板放回培养箱。