由紫外线引起的复制中间体的可视化 E。大肠杆菌使用二维的琼脂糖凝胶电泳分析
2010年12月21日
我们目前可以使用其中的一个两维的琼脂糖凝胶电泳分析，以确定紫外线照射后发生的复制中间体的结构的过程。
该程序的总体目标是使用二维凝胶分析可视化复制遇到 DNA 损伤时出现的 DNA 结构中间体。这是通过首先从诱导复制阻断损伤的活跃分裂细胞中分离 DNA 来实现的。然后，使用凝胶电泳根据大小分离回收的 DNA。
接下来，切下泳道并在第二块凝胶中水平重新铸造，根据大小和形状进一步分离 DNA。最后，使用 southern 分析来可视化在引入紫外线诱导损伤之前和之后的不同时间与复制 DNA 片段相关的 DNA 结构。最终，该程序可用于证明无法处理某些突变体中的 DNA 损伤会导致 DNA 修复中间体的积累。
嗨，我叫 Arthur Ian。我来自波特兰州立大学的 Corella 实验室。嗨，我叫 Brand she，我也来自 Corella 实验室。
今天，我们将向您展示二维凝胶电泳的流程。我们在实验室中使用该程序来研究 DNA 复制和修复中间体。那么让我们开始吧。
要开始此过程，在 37 摄氏度的 DGC 大腿培养基中培养含有质粒 PBR 3 22 的大肠杆菌过夜培养物和氨苄青霉素。使用 DGC 大腿培养基可最大限度地减少紫外线屏蔽。孵育过夜后，在 14， 000 RRP M 下沉淀细胞 30 秒。
然后将细胞沉淀重悬于 200 μL 不含氨苄青霉素的 DG C th 培养基中并接种。20 mL DG C 大腿培养基培养培养物，无需筛选氨苄青霉素。在 37 摄氏度的振荡培养箱中，OD 600 为 0.5，这相当于大约五倍 10 到第八个细胞不含氨苄青霉素的每毫升生长避免了针对某些突变体中可能出现的异常或非生产性复制中间体的选择。
此外，如果使用紫外线诱导损伤，则必须从介质中去除氨苄青霉素，因为它在这些波长下具有很强的吸收力并屏蔽。细胞在细胞生长时减少紫外线的有效剂量。使用 UVC 光度计确定与 15 瓦杀菌灯的距离，该灯产生的曝光率约为每秒每平方米 1 JUUL。
后续步骤应在黄光下进行，因为这将防止紫外线照射后光吸附逆转环丁烷会阴二聚体的光活化。一旦达到所需的细胞密度，使用移液器将培养物转移到旋转平台上直径为 15 厘米的培养皿中，以确保均匀照射整个细胞群。接下来，以每平方米 50 焦耳的速度照射培养物，并立即将它们转移到无菌预热烧瓶中，然后将它们放回摇动的 37 摄氏度培养箱中。
在实验期间，该剂量平均产生一个环丁烷会阴二聚体，对于每个要检查的时间点，每 4.5 kb 的单链 DNA 就会产生一个环丁烷会阴二聚体。将 0.75 毫升等分试样的培养物移液到 0.75 毫升冰冷的网 30 中。Buffer net 30 用作终止缓冲液，可防止复制和核苷酸切除修复继续进行。
添加终止缓冲液后，样品可以保存在冰上直到时间过程结束。经过时间过程后，将每个样品沉淀并重新悬浮沉淀。在 150 μL 裂解缓冲液中，在 37 摄氏度下裂解细胞 20 分钟，不要搅动。
由于具有单链区域或分支点的复制结构更容易被剪切，因此请用剃须刀片剪掉移液器吸头，以使嘴部更宽并最大限度地减少剪切力。一般来说，移液和搅拌应保持在最低限度，直到用限制性内切酶消化 DNA，裂解后，加入蛋白酶 K 和 sarcas 细胞，让孵育持续 1 小时。这有助于释放与蛋白质相关的 DNA 片段。
由于主动复制的 DNA 通常与蛋白质或膜复合物结合，因此这有助于提高复制片段的产量。1 小时后，向每个样品中加入 2 倍体积的苯酚，然后轻轻倒置试管 5 分钟，以提取样品。然后加入两倍体积的氯仿、异戊酯、酒精，并轻轻倒置试管再放置 5 分钟。
接下来，在微量离心机中以 14， 000 RPM 的速度离心样品 5 分钟，然后将每个样品的顶部水相转移到新管中。然后加入 4 体积的氯仿 ISO 醇，再次轻轻倒置试管 5 分钟。再次以 14， 000 RPM 的转速离心样品 5 分钟。
将透析膜放在烧杯中 250 毫升 0.1 xte 的顶部，并将每个样品的 100 微升点到膜上。透析后让样品透析 1 小时。将每个样品的 80 μL 放入含有 20 μL 酶混合物的新鲜 1.5 mL试管中。
在37 摄氏度下消化样品过夜。PV 2 将复制起点下游的质粒线性化。在加载 agros 凝胶之前，加入 100 微升氯仿和 20 微升含有溴的 6 x 加载染料。
向每个样品中加入酚蓝和二甲苯青，并混合氯仿将剥离与 DNA 末端结合的任何剩余 PV。通过第一维运行受限 DNA 样品来开始二维 aros 凝胶分析。首先，将 Lambda 后三尺寸标记加载到一个 XTBE 中先前制备的 0.4% agros 凝胶的第一泳道中。
然后为每个样品加载 40 μL 含有上样染料的水相，跳过泳道以使凝胶切片更容易。电泳后，以每厘米 1 伏特的浓度运行第一维度约 12 至 15 小时。低电压和低百分比的 AGROS 凝胶主要用于根据大小分离 DNA 片段。
在第一维运行后，用一把大屠刀切出包含 Lambda 后三标记并用粥样粟网染的第一条泳道。对于第二个维度，使用大屠刀使用 Lambda Hind 三个标记作为指导作物切出凝胶泳道，并丢弃线性化质粒预期在每个泳道上运行的区域下方。要灌注第二个维度，请将每个切片水平放置在空凝胶灌注器的顶部。
在一个 XTBE 中制备 1% AROS 的溶液，并冷却至 55 摄氏度。冷却后，将凝胶溶液倒入以灌输第二维，确保完全覆盖凝胶切片。在倒入凝胶之前，确保切片的方向均匀且蓖麻水平非常重要。
凝胶凝固后，在电泳装置中以每厘米 6.5 vols 的速度运行第二维度 5 个半到 7 小时，该电泳装置允许缓冲液再循环高电压和高百分比的 Agros 凝胶根据 DNA 片段的形状和大小有效地分离 DNA 片段。非线性形状在电泳后通过第二维的速度更慢。用水冲洗凝胶一次，然后在 400 毫升 0.25 摩尔盐酸中洗涤两次，轻轻搅拌 15 分钟。
酸洗用于将 DNA 分子部分切割成更小的片段，这些片段在 Southern 分析过程中转移效率更高，并且由于 DNA 复制中间体尺寸大且形状不寻常，因此这是必要的。要制备用于碱转移的凝胶，请再次用水冲洗凝胶，然后在 400 毫升 0.4 摩尔氢氧化钠中洗涤两次，每次 30 分钟。然后，如本程序的书面部分所述，使用含有 0.4 摩尔氢氧化钠的向下碱转移系统将凝胶中的 DNA 转移到高键 n 加尼龙膜上，让 DNA 转移后 DNA 转移 6 至 12 小时，继续进行探针杂交，如书面方案中所述。
探测并清洗膜后，将膜放在纸巾上，直到液体明显消失。然后用聚氯乙烯保鲜膜包裹膜，并将其暴露在磷酸成像仪屏幕上。最后，可以使用 storm eight 40 及其相关的图像量化来可视化和量化放射性。
图2D aros 凝胶分析观察到的 PV 2 消化 PBR 3 22 质粒的迁移模式。非复制线性质粒以线性 4.4 KB 片段的形式运行，复制质粒形成 Y 形结构，由于其较大尺寸和非线性形状，其迁移速度比非复制片段慢。这种迁移模式形成一个电弧，在紫外线照射后从线性区域向孔延伸。
在圆锥区域中观察到双 Y 或 X 形分子，并且迁移速度比 Y 形分子的弧慢。显示了用 P 32 标记的 PBR 3 22 探测的 2D 凝胶的 Southern 分析示例，用于 UV 照射后立即和 UV 照射后 15 分钟的细胞。当细胞在辐射后以指数期快速生长时，大约 1% 的血浆 DNA 总可以在 Y 弧中找到。
当阻塞的复制叉在受损位点积累时，观察到 YS 形状分子的瞬时增加。L 形复制中间体也瞬时积累并持续存在，直到与病变修复时间相关的时间。我们刚刚向您展示了如何使用二维凝胶电泳可视化 DNA 修复中间体。
执行此程序时，请务必注意会降低产量的剪切力，并对所有样品和凝胶保持温和。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文介绍了一种在复制过程中遇到DNA损伤（特别是在紫外线照射后）时可视化DNA结构中间体的方法。该方法利用二维琼脂糖凝胶分析来识别这些中间体。
关键研究组成部分
科学领域
- DNA复制
- DNA损伤响应
- 凝胶电泳
背景
- DNA损伤可能会阻碍复制。
- 了解复制中间体的结构对于研究DNA修复机制至关重要。
- 二维凝胶分析允许对DNA片段进行详细分离。
- 紫外线照射是在实验环境中诱导DNA损伤的常用方法。
研究目的
- 可视化复制过程中的DNA结构中间体。
- 评估DNA损伤对复制过程的影响。
- 展示特定突变体中DNA修复中间体的积累。
使用的方法
- 从有诱导损伤的活跃分裂细胞中分离DNA。
- 使用基于大小的凝胶电泳分离DNA。
- 在第二个凝胶中重新铺设通道以进一步分离大小和形状。
- 使用Southern分析可视化与复制相关的DNA结构。
主要结果
- 成功可视化紫外线损伤后的DNA中间体。
- 识别由于损伤导致的DNA结构变化。
- 证明在某些突变体中修复中间体积累的证据。
- 展示了二维凝胶分析在研究DNA复制中的有效性。
结论
- 该程序有效地揭示了在损伤存在下DNA复制的动态。
- 获得的见解可以为未来的DNA修复机制研究提供信息。
- 该方法可以应用于各种DNA损伤模型。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing DNA replication intermediates provides mechanistic insight into how cells respond to genotoxic stress, informing target validation in DNA damage response pathways. This approach supports preclinical de-risking by linking molecular phenotypes to repair kinetics, enabling predictive confidence in therapeutic strategies targeting replication stress. The method’s applicability to bacterial models allows early-stage interrogation of conserved mechanisms relevant to mammalian systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing replication fork dynamics following UV-induced DNA damage.
- Operational Value: Clarifies functional roles of gene products like RecA and RecF pathway components in lesion processing.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating intermediate persistence with nucleotide excision repair activity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, shape- and size-resolved DNA outputs suitable for standardization across experimental conditions.
- Reproducibility: Two-dimensional gel separation reduces variability by resolving intermediates based on both size and conformation.
- Screening Utility: Facilitates comparison of replication intermediate profiles between wild-type and repair-deficient strains.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a disease-relevant system for studying replication stress mechanisms conserved from bacteria to humans.
- Translational Continuity: Links UV-induced lesion removal kinetics to replication intermediate resolution, mirroring nucleotide excision repair timelines.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes transient fork reversal from pathological intermediate accumulation, informing go/no-go decisions in pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting hypothesis testing in DNA repair biology prior to lead identification stages.
- Discovery Biology: Tests mechanistic models of replication fork behavior under genotoxic stress using structural readouts.
- Screening: Delivers assay-ready, quantifiable DNA structures enabling side-by-side comparison of genetic backgrounds.
- Analytics: Produces migration-pattern data that reflect changes in DNA shape and size, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects bacterial replication intermediate dynamics to conserved eukaryotic repair pathways when lesion removal correlates with intermediate resolution.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating genetic or chemical modulators of replication fidelity across multiple damage models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in replication repair by directly visualizing lesion-induced intermediates.
- Operational Value: Standardizes detection of replication-associated DNA structures through gel-based size and shape separation.
- Strategic Value: Improves pathway-level go/no-go decisions by linking intermediate accumulation to repair proficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in lesion-processing assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DNA isolation, gel electrophoresis, and southern blotting techniques.
- Dependent on access to UV irradiation equipment and radiolabeling or detection systems for nucleic acids.
- Necessitates standardized sample handling to minimize shearing of fragile replication intermediates.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol from plasmid-based bacterial models to other systems.
- Practical limitations include low abundance of intermediates and requirement for synchronized cell populations to detect transient species.
