使用可视化的DNA复制DNA纤维的技术，在脊椎动物的模型系统DT40
2011年10月27日
DT40，模型脊椎动物的遗传系统，提供了强大的工具来分析蛋白质的功能。在这里，我们描述了一个简单的方法，允许在DT40细胞在单分子水平的S期DNA合成的影响参数的定性分析。
该程序的总体目标是在单分子水平上可视化 DNA 复制。首先将卤代核苷酸类似物掺入新合成的 DNA 中。在活细胞中，将带有标记 DNA 的细胞放在显微镜上。
然后载玻片放置细胞并将 DNA 拉伸到显微镜载玻片上。随后对 DNA 纤维进行免疫染色和荧光显微镜图像分析可以阐明全局复制叉动力学，从而可以定量分析影响整个复制程序的参数。在过去的几年里，开发了不同版本的 DNA 纤维 Fluor 技术，以可视化活细胞内单个复制叉的运动。
您即将见证的 DT 40 细胞体内实验可以在一天内完成，只需要一般的实验室设备和演示该程序的荧光显微镜，由我实验室的博士后 Rebecca Schwab 博士负责。为了在体内标记 DT 40 细胞，请从指数增长的培养物开始。添加 IDU 标记至终浓度为 25 微摩尔，并混合细胞悬液。
将细胞在 38 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 20 分钟。接下来，添加 CLDU 标记至终浓度为 250 微摩尔。混合并孵育细胞悬液。
现在用冰冷的 PBS reus 洗涤 DT 40 细胞。将细胞沉淀悬浮在冷 PBS 中，并将标记的细胞保持在冰上。将两微升细胞悬液点到载玻片的一端，风干，直到液滴体积大大减少但未完全干燥。
现在，在细胞悬液顶部加入 7 μL 纤维裂解液，然后用移液器吸头搅拌孵育 2 分钟，轻轻混合溶液。接下来，将载玻片倾斜 15 度，让纤维沿载玻片扩散。纤维溶液到达载玻片底部后，将其水平放置以风干。
此时，沿着载玻片应该可以看到一条细的不透明线。用铅笔标记拉伸纤维的起点。首先将玻片浸入 3 比 1 甲醇和乙酸中 10 分钟。
用蒸馏水清洗玻片，然后浸入 2.5 摩尔盐酸中 80 分钟。在 PBS 中洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟 轻拍。将多余的 PBS 收集到纸巾上。
然后水平调整幻灯片的方向。现在，在每张载玻片的顶部用 PBS 吸取 5% BSA 溶液，并放置盖玻片孵育 20 分钟。将盖玻片轻轻地沿着载玻片移动。
用纸巾去除多余的 BSA。然后移液 50 μL 抗 BRDU 一抗溶液。到每张幻灯片上。
用盖玻片盖住游戏，并在加湿室中孵育 2 小时。取下盖玻片后，用 PBS 洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟。涂抹 50 μL 二抗溶液位置盖玻片，并保护载玻片避光。
然后孵育 1 小时。取下盖玻片，用 PBS 洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟。最后，在每个载玻片上添加一滴矢量盾封固剂。
轻轻按压盖玻片并去除周围的多余液体。用纸巾，用透明指甲油密封盖玻片并风干。将载玻片储存在零下 20 摄氏度。
将一滴浸油滴在靠近铅笔标记的载玻片上，然后开始定位纤维。远离主束，找到纤维彼此明显分开的区域。在典型实验中，仅使用一个颜色通道选择图片，以避免偏差。
然后为每个样品拍摄大约 10 张照片。沿载玻片移动以拍摄不同的照片，因为载玻片的一个区域可能无法提供具有代表性的纤维长度或复制结构。将图片导入图像分析程序。
测量 100 个纤维束的长度和/或计数 150 到 200 种不同的复制结构。双标记纤维技术允许区分不同的复制结构。新复制的 DNA 可以可视化为抗体标记的核苷酸类似物线。
在这里，一个正在进行的拉长分叉表示为相邻的红色和绿色信号。新的起始事件可分为在细胞与第一个标记物孵育时触发的起始事件，以及在孵育过程中与第二个标记物触发的起始事件。前者由相邻的绿色、红色、绿色信号组成，后者由一条绿线组成。只。
终止事件表现为相邻的 red、green。红色信号穿插其中。源由连续的源和终止信号组成。
根据实验设计，停滞或折叠的分叉可以定义为仅红色信号或红线，后跟一小段绿色通道。在本实验中，野生型 DT 40 细胞的平均分叉速度为每分钟 0.4 微米。63% 正在进行的分叉，10% 的来源，16% 停滞的分叉，8% 的终止和 3% 的穿插光纤。
观看此视频后，您应该对如何可视化和分析 DT 40 细胞中的复制叉动力学有很好的了解。这将为您提供研究 DNA 复制缺陷的重要工具。
概述
本文介绍了一种在DT40细胞中以单分子水平可视化DNA复制的方法，DT40细胞是一个模型脊椎动物遗传系统。该技术允许对S期期间DNA合成参数进行定性分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 遗传学
背景
- DT40细胞是研究蛋白质功能的强大模型。
- 了解DNA复制动力学对于洞察遗传稳定性至关重要。
- 单分子技术提供了关于复制过程的详细信息。
- 以前的方法已经发展用于可视化单个复制叉。
研究目的
- 可视化活的DT40细胞中的DNA复制动力学。
- 分析各种参数对DNA合成的影响。
- 为研究人员提供简单直接的实验协议。
使用的方法
- 将卤代核苷酸类似物掺入DNA中。
- 对DNA纤维进行免疫染色以进行可视化。
- 使用荧光显微镜分析复制叉动力学。
- 对纤维长度和复制结构进行定量分析。
主要结果
- 野生型DT40细胞中的平均叉速度为每分钟0.4微米。
- 63%的复制叉正在进行，10%的起点和16%的停滞复制叉。
- 还表征了终止事件和穿插纤维。
- 该技术允许区分各种复制结构。
结论
- 该方法为DNA复制动力学提供了重要的洞察。
- 它可用于研究DNA复制缺陷。
- 该协议易于操作，可以在一天内完成。
常见问题
Executive Industry Relevance
Single-molecule visualization of DNA replication in DT40 cells enables precise interrogation of replication fork dynamics, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative and qualitative insights into genome stability mechanisms, directly informing target validation and pathway analysis. The method's rapid turnaround and accessibility facilitate integration into high-throughput discovery pipelines for portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of replication fork speed and structure for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing ongoing, stalled, and terminated forks in gene-modified systems.
- Facilitates pathway clarification by quantifying replication origin density and fork termination events.
- Provides predictive confidence for prioritizing targets affecting genome stability.
Screening & Assay Development
- Prepares validated DT40 cell-based systems for downstream compound screening targeting replication processes.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative outputs for assay development.
- Enables scalable analysis of replication dynamics across genetic backgrounds.
- Supports reliable evaluation of candidate molecules impacting DNA synthesis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by modeling genomic instability linked to tumorigenesis.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for genome maintenance targets.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying replication defects in engineered models.
- Enhances predictive de-risking for translational biomarker development in genome stability pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This DNA fiber technique positions within the early discovery to lead identification continuum, enabling hypothesis testing and mechanistic validation before preclinical studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing replication fork behavior in gene-edited cells.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative outputs for replication dynamics, supporting compound evaluation workflows.
- Analytics: Delivers measurable readouts such as fork speed, origin density, and structure frequencies for comparative analysis.
- Translational Research: Connects replication phenotypes to disease-relevant genomic instability when supported by genetic models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse gene function and compound mechanism studies in vertebrate cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genome stability research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable single-molecule analysis with general lab infrastructure.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of genome maintenance targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-program comparability for replication-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to general laboratory equipment and a fluorescence microscope.
- Demands cross-team standardization for image acquisition and tract measurement protocols.
- Adaptable to various gene-edited or compound-treated DT40 cell models.
- Limited to systems where single-molecule DNA fiber stretching and labeling are feasible.
