利用DNA纤维技术在脊椎动物模型系统DT40中可视化DNA复制

本实验的总体目标是在单分子水平上观察DNA复制过程。首先将卤化核苷酸类似物掺入新合成的DNA中。在活细胞中，将含有标记DNA的细胞置于显微镜下进行观察。

将细胞铺展于载玻片上，使DNA在显微镜载片上伸展开来。随后对DNA纤维进行免疫染色，并通过荧光显微镜图像分析，可揭示全基因组复制叉动态，从而实现对影响整体复制程序的各种参数进行定量分析。近年来，已开发出多种DNA纤维荧光技术，用于可视化活细胞中单个复制叉的移动过程。

您即将看到的这项在DT 40细胞中进行的活体实验可在一天内完成，仅需常规实验室设备和荧光显微镜。本实验操作将由本实验室的博士后Rebecca Schwab博士演示。为了在活体内标记DT 40细胞，首先取处于指数生长期的细胞培养物。加入IDU标记物至终浓度为25 µM，并混匀细胞悬液。

将细胞在38摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育20分钟。接着，加入CldU标记物，使其终浓度为250微摩尔。混匀后继续孵育细胞悬液。

现在用预冷的 PBS 重悬 DT 40 细胞。将细胞沉淀重悬于预冷的 PBS 中，并将标记好的细胞置于冰上。取 2 微升细胞悬液滴加到玻片的一端，空气中自然干燥，直至液滴体积显著缩小但尚未完全干透。

现在，在细胞悬液上方加入 7 µL 裂解液，用移液枪头轻轻搅拌混合溶液，孵育 2 分钟。接着，将载玻片倾斜至 15 度，使纤维沿载玻片伸展。当纤维溶液到达载玻片底端后，将其平放，静置晾干。

此时，载玻片上应可见一条细的不透明线条。用铅笔标记拉伸纤维的起始位置。首先将载玻片浸入甲醇与乙酸按3:1比例配制的溶液中，持续10分钟。

将载玻片用蒸馏水清洗，然后浸入2.5摩尔的盐酸中80分钟。用PBS清洗载玻片三次，每次五分钟，轻拍。将多余的PBS用纸巾吸去。

然后将玻片水平放置。现在在每张玻片上加入含5% BSA的PBS溶液，用移液枪滴加，盖上盖玻片，于室温孵育20分钟。轻轻将盖玻片沿玻璃玻片表面向下移动。

用纸巾吸去多余的 BSA。然后将 50 微升抗 BRDU 一抗溶液加入每张载玻片上。

用盖玻片覆盖样品，置于湿化孵育盒中孵育两小时。移除盖玻片后，用 PBS 洗涤载玻片三次，每次五分钟。每张载玻片上加入 50 µL 二抗溶液，覆盖盖玻片，并避免光照。

然后孵育一小时。移去盖玻片，并用 PBS 洗涤载玻片三次，每次五分钟。最后，向每张载玻片上加一滴 Vector Shield 封片介质。

轻轻按压盖玻片，去除其周围的多余液体。用纸巾将透明指甲油涂抹于盖玻片边缘以封固，室温下晾干。将载玻片置于零下20摄氏度保存。

在载玻片上靠近铅笔标记处滴加一滴镜油，开始寻找纤维。从主束区域移开，寻找纤维彼此清晰分离的区域。在典型的实验中，仅选择使用单一颜色通道的图像，以避免偏差。

然后对每个样品拍摄约10张图像。在载玻片上移动位置以拍摄不同区域，因为载玻片的单一区域可能无法提供具有代表性的纤维长度或重复结构。将图像导入图像分析软件中。

测量100条纤维束的长度，或计数150至200个不同的复制结构。双标记纤维技术可区分不同的复制结构。新复制的DNA可显示为抗体标记的核苷酸类似物组成的线条。

此处，持续延伸的复制叉以相邻的红色和绿色信号表示。新的起始事件可分为两类：一类是在细胞与第一种标记物孵育期间已激活的复制起点，另一类是在与第二种标记物孵育期间激活的复制起点。前者由相邻的绿色、红色和绿色信号组成，后者仅由一条绿色线条表示。

终止事件表现为相邻的红色和绿色信号。红色信号呈散在分布。复制起始区由连续的复制起始信号和终止信号组成。

根据实验设计的不同，停滞或崩溃的复制叉可被定义为仅出现红色信号，或一条红色线条后跟随一段较短的绿色轨迹。在本实验中，野生型 DT 40 细胞的平均复制叉速度为 0.4 微米每分钟。其中正在进行的复制叉占 63%，起始点占 10%，停滞的复制叉占 16%，终止信号占 8%，分散的纤维占 3%。

观看本视频后，您应能充分理解如何在 DT 40 细胞中可视化并分析复制叉动态。这将为您提供研究 DNA 复制缺陷的重要工具。