在 E. coli 中利用荧光阻遏蛋白-操纵子系统诱导位点特异性复制阻滞

本实验的总体目标是在核蛋白阻断位点处停滞复制叉，并观察阻断位点处的DNA结构，以研究DNA修复通路。该方法有助于回答有关DNA复制与修复的关键问题，例如当细胞的复制装置遇到蛋白质障碍时，DNA如何被加工处理。该技术的主要优势在于，我们能够在整个活细胞群体中，在染色体的特定位点上可逆地停滞复制叉。

为演示本实验方案，我实验室的以下成员将参与操作：Dr.Karla Mettrick、研究生 Georgia Weaver 和 Tayla-Ann Corocher。本实验采用携带四环素操纵子阵列的 E.coli 菌株，该菌株含有 pKM1 质粒。pKM1 编码 TetR-YFP，即一种可诱导的、带有黄色荧光蛋白标签的四环素阻遏蛋白。

将该大肠杆菌菌株的新鲜过夜培养物用含有所需选择性抗生素的稀释型复杂培养基稀释至600纳米处的光密度为0.01。在30摄氏度下振荡培养，使其光密度在600纳米处达到0.05至0.1。取10毫升样品作为未诱导对照。

向剩余的培养物中加入0.01%阿拉伯糖，以诱导pKM1质粒表达TetR-YFP。将未诱导和已诱导的培养物均在30°C条件下振荡培养。一小时后，使用荧光显微镜检测已诱导培养物中每个细胞内是否出现单一焦点信号。

若诱导后的细胞被证实处于阻滞状态（以超过70%的细胞具有单个焦点为标志），记录光密度值，并取7.5毫升样品用于双向凝胶电泳分析。同时，从未诱导的对照培养物中取等量样品。在进行荧光显微镜观察前，制备琼脂糖垫以防止细胞在观察过程中移动。

每个琼脂糖垫片，吸取 500 微升熔融琼脂糖至显微镜载玻片上，并在琼脂糖凝固前立即覆盖盖玻片。将载玻片置于湿润的纸巾之间，于 4 摄氏度保存备用。观察细胞时，从琼脂糖垫片上移去盖玻片，并吸取 10 微升细菌培养物至垫片中央。

大约五分钟后，当琼脂糖垫干燥后，盖上盖玻片。在盖玻片上滴加一滴镜油，将载玻片置于光学显微镜下。使用相差显微镜以100倍放大倍数观察细胞。

在成像软件的“采集”对话框中，将曝光时间设置为 100 毫秒。点击“采集”以获取图像。切勿移动载物台。

在“采集”对话框中，选择 YFP 作为与相机连接的外部快门的照明光源。将曝光时间设置为 1,000 毫秒。关闭载物台光源，然后选择“采集”以获取荧光图像。

开始此操作时，向先前收集的培养样品中加入叠氮化钠，使其终浓度为 0.1%，并在冰上孵育至少五分钟。在 5,000 × g 条件下离心十分钟。弃去上清液。

将每个细胞沉淀重悬于 200 微升 PIV 缓冲液中，并将细胞转移至微量离心管中。进行微量离心以沉淀细胞，弃去上清液。用 40 微升适当的玻璃疏水剂或硅酮溶液处理显微镜载玻片。

用纸巾擦拭载玻片直至干燥。将细胞密度最低的样品用50微升PIV重悬，并置于50摄氏度的加热块中。对于其余所有样品，调整PIV的体积，使每管中的最终细胞密度相同。

向样品中加入等体积新配制的含PIV的0.8%琼脂糖溶液。将样品置于加热块中，保持温度高于50摄氏度，以防止凝固。取20微升细胞-琼脂糖悬液滴加到处理过的载玻片上，形成半球形胶塞。

当胶块完全凝固后，将来自同一样本的所有胶块轻轻移入一个微量离心管中，并加入1毫升细胞裂解缓冲液。在37摄氏度孵育2小时。2小时后，移除细胞裂解缓冲液，并加入1毫升EDTA-Sarkosyl-蛋白酶K溶液（或ESP溶液）。

在50摄氏度孵育过夜，或直至胶块变为透明。待胶块透明后，移除ESP缓冲液，将胶块转移至15毫升离心管中。加入12毫升TE缓冲液，静置30分钟。

用 TE 缓冲液总共洗涤胶块五次。将胶块置于 1 毫升 TE 缓冲液中，4 摄氏度保存。为了分析复制中间产物，需用针对目标区域的适当限制性内切酶消化琼脂糖胶块中的 DNA。

在此示例中，EcoRV 在阵列前方、阵列内部以及阵列后方切割 DNA，从而在目标区域产生 5.5 kb 和 6.7 kb 的片段。开始此操作时，将琼脂糖小块转移至新的微量离心管中，并加入 150 微升限制性内切酶缓冲液。加入 25 至 100 个单位的限制性内切酶，在 37 摄氏度下消化 6 至 8 小时。

在 4 摄氏度下制备 0.4% 琼脂糖凝胶。将 300 毫升熔融琼脂糖倒入尺寸约为 25 × 25 厘米的凝胶托盘中。插入梳子，使加样孔的宽度与胶块直径大致相同。

当凝胶完全凝固后，取出梳子并将凝胶移至室温。使用接种环将其中一个已消化的琼脂糖小块滑入加样孔中，使小块的平面紧贴加样孔侧壁，确保DNA进入凝胶的方向正确。以相同方式将单个琼脂糖小块插入每隔一个的加样孔中。

用移液器将熔化的0.4%琼脂糖加入加样孔中，以固定凝胶块的位置。在空加样孔中加入1 kb DNA标准品，并在标准品与样品之间留出空隙。在室温下用1×TBE缓冲液过夜电泳。

次日，在含有 0.3 微克/毫升溴化乙锭的水浴中染色凝胶 20 分钟。使用长波紫外透射仪观察 DNA，并用平整直切的方式切下每条泳道片段，尽量减少两侧多余的琼脂糖。将切下的凝胶泳道置于与 DNA 迁移方向呈 90 度的凝胶托盘中。

下一步是准备300毫升琼脂糖用于第二维凝胶。当琼脂糖冷却至50摄氏度时，用移液器将熔化的琼脂糖滴加至凝胶切片周围，以固定其位置。将剩余的琼脂糖倒入托盘中，使其深度至少与凝胶切片齐平。

凝胶完全凝固后，在含有 0.3 微克/毫升溴化乙锭的 1×TBE 缓冲液中，于 4 摄氏度进行电泳，直至 DNA 迁移约 10 厘米。切下基因组 DNA 所在区域的凝胶块，并包括其上方的凝胶，以确保回收所有不可见的 DNA。随后通过文中所述的 Southern 杂交方法对凝胶中的 DNA 进行检测和可视化。

在此系统中，复制阻断通过大多数细胞中存在一个焦点得以确认，该焦点对应于细胞内阵列的一个拷贝。加入无水四环素可解除该阻断，随后阵列的重复通过出现多个焦点的细胞数量增加而得以可视化。复制受阻的细胞还表现出生长抑制，而在后续培养中加入无水四环素则可逆转该抑制效应。

为了分析复制中间体，首先将DNA在第一维进行电泳。然后切下目标DNA片段，并进行第二维电泳，得到线性DNA的对角线分布。对该阵列DNA进行Southern杂交，结果显示未阻断样品中出现两个信号点，分别对应于预期的5.5 kb和6.7 kb阵列片段。

封闭的样品显示出5.5 kb斑点的减少，并出现椭圆形信号，表明Y型DNA的积累。加入无水四环素后，Y型DNA信号消失。另一种常见的中间体是Holliday连接体，其表现为Y弧顶部的圆锥形信号以及Y弧末端线性DNA产生的尖峰信号。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在八天内完成。尽管这是一种二维实验方法，但必须牢记，DNA胶块的质量对于DNA结构的最佳观察效果至关重要。