诱导位点特异性复制遇阻电子。大肠杆菌用荧光阻遏操作员系统

本实验的总体目标是在核蛋白块处停滞复制叉，并观察该块位点的 DNA 结构，以研究 DNA 修复途径。这种方法可以帮助回答有关 DNA 复制和修复的关键问题，例如当细胞的复制装置遇到蛋白质障碍时 DNA 是如何处理的。这项技术的主要优点是我们可以在整个活细胞群的染色体上特定位置可逆地停止复制叉。

演示该程序的将是我实验室的以下成员 Karla Mettrick 博士、研究生 Georgia Weaver 和 Tayla-Ann Corocher。该程序使用在 pKM1 质粒中携带四环素纵子阵列的大肠杆菌菌株。pKM1 编码 TetR-YFP，这是一种可诱导的黄色荧光蛋白标记的四环素阻遏蛋白。

根据需要，在稀释的复合培养基中用抗生素将这种大肠杆菌菌株的新鲜过夜培养物稀释至 600 纳米的光密度为 0.01，以便进行选择。在 30 摄氏度下振荡培养培养物，使 600 纳米的光密度为 0.05 至 0.1。取出 10 mL 样品作为未诱导的对照。

向剩余的培养物中加入 0.01% 阿拉伯糖，以诱导从 pKM1 产生 TetR-YFP。在 30 摄氏度下摇动继续培养未诱导和诱导培养物。一小时后，使用荧光显微镜检查诱导培养物的每个细胞内是否存在单个焦点。

如果确认诱导细胞被阻塞，由超过 70% 的细胞具有单个焦点表明，记录光密度并取出 7.5 毫升样品通过二维凝胶电泳进行分析。从未诱导的对照培养物中取出等效样品。在荧光显微镜检查之前，准备琼脂糖垫以防止细胞在可视化过程中移动。

对于每个琼脂糖垫，将 500 微升熔融琼脂糖移液到显微镜载玻片上，并在琼脂糖凝固之前立即覆盖盖玻片。将载玻片存放在 4 摄氏度的湿组织之间，直到需要为止。当需要检查细胞时，从琼脂糖垫上取下盖玻片，并将 10 微升细菌培养物移液到垫的中心。

大约 5 分钟后，当琼脂糖垫干燥后，更换盖玻片。将一滴浸油滴在盖玻片上，然后将载玻片放在光学元件下方。使用 100 倍放大倍率的相位显微镜观察细胞。

在成像软件的 Acquire 对话框中，将 Exposure Time 设置为 100 毫秒。选择 Acquire 以捕获图像。不要移动载物台。

在"已获取"对话框中，选择 YFP 作为与相机链接的外部快门的照明。将 Exposure Time 设置为 1， 000 毫秒。关闭载物台灯并选择 Acquire 以捕获荧光图像。

要开始此过程，请将叠氮化钠添加到先前收集的培养样品中，至终浓度为 0.1%，并在冰上孵育至少 5 分钟。将细胞以 5， 000 倍 g 离心 10 分钟。丢弃上清液。

每个细胞沉淀重悬于 200 μL PIV 缓冲液中，并将细胞转移到微量离心管中。微量离心机使细胞沉淀并弃去上清液。用 40 μL 适当的玻璃防水剂或硅胶溶液处理显微镜载玻片。

用纸巾擦拭载玻片，直到它干燥。将细胞密度最低的细胞重悬于 50 μL PIV 中，并置于 50 摄氏度的加热块中。对于所有其他样品，调整 PIV 的体积，使每个试管中的最终细胞密度相同。

向样品中加入等体积的新鲜制备的 0.8% 琼脂糖溶液的 PIV 溶液。将样品放在加热块中，确保温度高于 50 摄氏度，以防止凝固。将 20 微升细胞琼脂糖悬浮液滴在处理过的载玻片上，以产生半球形的塞子。

当塞子凝固后，轻轻地将一个样品中的所有塞子滑入单个微量离心管中，并加入 1 毫升细胞裂解缓冲液。在 37 摄氏度下孵育 2 小时。2 小时后，去除细胞裂解缓冲液，加入 1 毫升 EDTA-Sarkosyl-蛋白酶 K 或 ESP 溶液。

在 50 摄氏度下孵育过夜或直到塞子透明。一旦塞子透明，取出 ESP 缓冲液并将塞子转移到 15 毫升管中。加入 12 mL TE 缓冲液，静置 30 分钟。

用 TE 缓冲液总共清洗塞子五次。将插头储存在 4 摄氏度的 1 毫升 TE 缓冲液中。为了分析复制中间体，用适合目标区域的限制性内切酶消化琼脂糖栓中的 DNA。

在此示例中，EcoRV 在阵列之前、阵列内和阵列之后立即切割 DNA，以在目标区域提供 5.5 kb 和 6.7 kb 片段。要开始此过程，请将琼脂糖塞转移到新鲜的微量离心管中，并加入 150 μL 限制性内切酶缓冲液。加入 25 至 100 单位的限制性内切酶，并在 37 摄氏度下消化 6 至 8 小时。

在 4 摄氏度下制备 0.4% 琼脂糖凝胶。将 300 毫升熔融琼脂糖倒入约 25 x 25 厘米的凝胶托盘中。插入梳子，使孔的宽度与塞子的直径大致相同。

凝胶凝固后，取下凝胶套并将凝胶移至室温。使用接种环，将其中一个消化的琼脂糖塞子滑入孔中，将塞子的平坦侧靠在 DNA 进入凝胶的孔侧。以相同的方式将单个塞子插入每隔一个孔中。

将熔融的 0.4% 琼脂糖移液到孔中，以将塞子密封到位。将 1 kb DNA 分子量标准加载到空孔中，在分子量标准和样品之间留出间隙。在室温下在 1xTBE 中运行凝胶过夜。

第二天，在含 0.3 μg/mL 溴化乙锭的水浴中对凝胶染色 20 分钟。用长波紫外透射仪观察 DNA，并用笔直均匀的切口切出每个泳道片段，最大限度地减少泳道两侧过量琼脂糖的包含。将切除的凝胶泳道放入凝胶托盘中，与 DNA 迁移方向成 90 度角。

下一步是为第二维凝胶制备 300 毫升琼脂糖。当琼脂糖冷却至 50 摄氏度时，用移液管将熔融的琼脂糖吹到凝胶切片周围以固化它们的位置。将剩余的琼脂糖倒入托盘中，深度至少与凝胶切片齐平。

凝胶凝固后，在 4 摄氏度下用 0.3 μg/mL 溴化乙锭的 1xTBE 进行电泳，直到 DNA 迁移约 10 cm。切除存在基因组 DNA 的块，包括其上方的凝胶，以包括不可见的 DNA。凝胶内的 DNA 随后通过 Southern 杂交可视化，如文本方案中所述。

在这个系统中，复制块由大多数单元确认，其中包含一个焦点，对应于单元内数组的一个副本。添加无氢四环素逆转了阻滞，随后阵列的复制被可视化为具有多个病灶的细胞积累。复制受阻的细胞也显示出生长抑制，在无水四环素存在下，这种抑制被随后的生长逆转。

为了分析复制中间体，在第一维对 DNA 进行了电泳。然后切除目标 DNA，进行第二维电泳，得到线性 DNA 的对角线。阵列 DNA 的 Southern 杂交显示，未封闭的样品中存在两个位点，对应于阵列的预期 5.5 kb 和 6.7 kb 片段。

封闭的样品显示 5.5 kb 点减少，并增加了一个椭圆信号，表明 Y 形 DNA 积累。添加无氢四环素消除了 Y 形 DNA 信号。另一种常见的中间体是 Holliday 连接，可视化为 Y 弧顶部的锥形信号和 Y 弧末端线性 DNA 的尖峰。

一旦掌握，如果准备得当，这项技术可以在 8 天内完成。在 2D 程序中，重要的是要记住 DNA 栓的质量对于 DNA 结构的最佳可视化至关重要。