可视化的单分子荧光显微镜下的DNA复制
October 9th, 2009
此协议表明一个简单的可视化实时个人replisomes的DNA复制的单分子荧光显微镜技术。
在这种技术中，玻璃盖玻片用惰性和生物素 peg 分子的混合物进行功能化。使用这种功能化表面创建一个流通池，并将其放置在草坪显微镜上。使用多价链霉亲和素将生物素化的滚圆模板连接到表面。
当通过添加 repli 区蛋白和核苷酸复制底物时，所得双链 DNA 以层流延伸，并使用间配对染料进行实时成像。大家好，我是来自哈佛医学院生物化学和分子药理学系 Antoine Van Ian 实验室的 Nathan Tanner。我是 Joe Laro，同样来自 Van Noian 实验室。
今天，我们将向您展示一种在单分子水平上实时对 DNA 复制进行荧光成像的程序。我们在实验室中使用该程序来研究单个复制复合物的协调 DNA 合成活性。那么让我们开始吧。
要开始此程序，通过在 TBS 缓冲液中加入 10 倍过量的寡核苷酸，加热至 65 摄氏度，然后将加热块冷却以适当冷却引物，将生物素化尾寡核苷酸吸附到 M 13 单链 DNA 上。现在，引物 M 13 已准备就绪，将其添加到含有 D NDP 和氯化镁的 64 纳摩尔 T 7 DNA 聚合酶和 T 7 复制缓冲液的混合物中，并在 37 摄氏度下孵育反应 12 分钟。孵育结束时，用 100 毫摩尔 EDTA 淬灭。
接下来，用苯酚异戊醇氯仿纯化填充的产物 DNA，提取并透析到 TE 缓冲液或其他合适的储存缓冲液中，每个有机相进行反向提取，以回收任何残留的引物。透析后的 M 13 用紫外可见分光光度计测定 DNA 浓度。模板制备的一次迭代可以产生足够的纳摩尔浓度的模板，用于数百到数千个单分子实验。
现在 DNA 已准备就绪，请继续准备功能化的盖玻片。要复制的 DNA 附着在用 Amil Lane 功能化的玻璃盖玻片上，Amil 的氧基团与玻璃结合，留下可用于结合生物素化 peg 分子的 amin。这种涂层有助于减少与表面的非特异性结合。
要彻底清洁玻璃盖玻片，请将它们放入染色罐中，并在罐中加入乙醇超声处理液。冲洗罐子 30 分钟，用一摩尔氢氧化钾超声处理 30 分钟，然后重复两次洗涤。对于第一个官能团化反应，需要去除所有痕量的水。
用丙酮填充染色瓶并超声处理 10 分钟。清空罐子并再次装满丙酮。继续将正弦试剂加入染色缸中并搅拌 2 分钟。
然后用大量过量的水淬火。然后在烤箱中以 110 摄氏度烘烤 30 分钟来干燥盖玻片。接下来，用固定的钉子制备每体积重量约 0.2% 的 PEG 混合物，包括玻璃盖玻片垫片，允许分离盖玻片，将 100 微升移液到干燥的孤立盖玻片上。
将第二个盖玻片放在顶部。将盖玻片在 PEG 溶液中孵育 3 小时。然后将每对盖玻片分开，并用水充分清洗。
小心保持盖玻片功能面朝上，因为只有一侧会涂有钉子。最后，用压缩空气干燥盖玻片，并在真空下干燥存放，表面保持稳定至少一个月。因此，可以批量制作数十个盖玻片并根据需要使用。
现在盖玻片已经准备好了，可以组装用于单分子实验的流动室。首先将 20 至 25 mL 含有 BSA 的封闭缓冲液放入干燥液中，以去除任何气泡，以便后续步骤使用。接下来，在 100 μL PBS 中稀释 25 μL 链霉亲和素，并将溶液铺在钉子官能化盖玻片的表面，在室温下孵育 20 分钟，以使链霉亲和素与表面生物素结合，同时准备腔室的其他部分。
在孵育盖玻片时，剪下一条双面胶带，两侧有背衬，使其与用于组装流通室的石英载玻片的尺寸相匹配。用铅笔在胶带上标记管孔的位置，以便可以在胶带上绘制流动室的轮廓。标记孔后，在标记周围制作一个 2 毫米宽的矩形。
这个矩形将用作流道，因此请务必制作笔直的侧面，并在管道入口和出口周围留出空间。现在沿着绘制的轮廓剪下标记的胶带，进行笔直干净的切割，以确保没有粘合剂伸入通道。使用丙酮彻底清洁石英载玻片，以去除先前实验中使用的流通池结构中的粘合剂。
找到通道轮廓的最佳对齐方式。撕下背胶的一侧，小心地将胶带放在球场滑轨上。小心地正确对齐胶带，因为入口和出口孔需要保持畅通
。接下来，为流通池的入口和出口准备 0.76 mm 管路的管路切割长度。以大约 30 度角切割管子的末端有助于使管子不会平压在腔室底部。将管路悬挂在试管架上，以便在后续步骤中轻松连接到流通池。
至此，盖玻片孵育已完成。用水彻底冲洗 strep avid ENC 涂层盖玻片，并使用压缩空气干燥。小心不要将盖玻片翻转过来，因为只有一侧是功能性的。
最后，通过去除胶带背衬的另一侧并将石英载玻片放在盖玻片上来完成流通室的组装。轻轻按压盖玻片，以推出胶粘剂中滞留的任何空气。这将有助于防止任何气泡进入流道。
用环氧树脂密封腔室的侧面。将切割好的管插入石英的孔中，用环氧树脂密封到位，然后晾干几分钟。当环氧树脂密封件干燥时，开始堵塞表面。
使用 21 号针头。将一些 Degas 封闭缓冲液拉过其中一根试管。冲洗几次以去除气泡，并让腔室孵育至少半小时，然后再进行单分子复制。实验。
现在流通池已被堵塞，将其放在显微镜载物台上。用载物台夹将腔室固定到位，并确保流道沿 y 轴对齐。使用更大直径的连接器管将流通池出口管连接到注射泵。
将入口放入封闭缓冲液中，然后拉回注射器以去除管中的任何空气。轻轻轻弹出口管将有助于清除流通池中滞留的任何气泡。现在加入 DNA，将 DNA 储备模板稀释至 25 皮摩尔，以中等流速（每分钟 0.025 mL）将 1 mL 封闭缓冲液流入腔室，持续 30 分钟，以使 DNA 具有良好的表面覆盖。
DNA进入腔室后，使用封闭缓冲液洗涤至少 200 体积的流动槽洗去多余的 DNA。要去除所有游离 DNA，请打开激光器和相机。冷却后的 CCD 需要达到一定温度才能使用。
洗去多余的 DNA 并对复制缓冲液进行脱气后，制备复制反应混合物、核苷酸 DTT 和胞质素复制缓冲液。然后加入蛋白质并轻轻混合。然后将反应混合物流入流通池。
这里的流速需要足以将双链 DNA 拉伸成 2 毫米宽。100 微米高的流道 0.04 毫升/分钟效果很好。留出时间让混合物进入腔室约 10 分钟。
将视野移动到通道的一侧并聚焦在粘合材料上，以确保靠近表面以进行聚焦并开始成像。调整激光功率显微镜焦距和草皮角度。保持低功率以避免染色 DNA 的任何光切割。
以每秒 1 到 5 帧的速度采集，持续数分钟，具体取决于 DNA 复制的速率。重复以获得更长的复制轨迹，或者当几乎所有反应混合物都已泵入细胞流中时，使用 cyt 在更多的缓冲液中进入细胞流，以查看更多分子，以查看其他视野。拍摄不同复制分子的多个图像可为生产率确定提供统计数据。
在滚动的圆圈中。复制测定领先强度合成延伸了连接圆圈和表面的尾部，尾部被滞后链聚合酶转化为双链 DNA，并通过层流拉伸。下面是一个 cyt orange 在 532 纳米激发下的示例视场。
小荧光点是栓系的未复制底物。请注意产品的极端长度和每个字段的大量产品。典型的视野将显示许多复制分子，可见在 37 摄氏度下染色的 DNAE 大肠杆菌实验中不断增长的亮线，每个视野有 5 到 50 个分子，具体取决于表面密度。
T 7 repla 区的启动效率要高得多，并且可以复制场中超过 50% 的分子。由于密度如此之高，很难分辨如图所示的单个分子。因此，在较低的蛋白质浓度或表面密度下进行 T 7 实验 来自大肠杆菌的典型复制分子的 Chime 图，T 7 实验包括来自大肠杆菌和 T 7 的分子的终点轨迹与时间的关系图，轨迹拟合线性回归以获得复制速率，在本例中，大肠杆菌为每秒 467.1 个碱基对和每秒 99.4 个碱基对。
对于 T 7，与单高斯拟合的单分子轨迹的速率分布给出了大肠杆菌每秒 535.5 个正负 39 个碱基对和 75.9 个正负 4.8 个碱基对/秒。对于 T seven，复制产物的长度分布与单指数衰减拟合以获得生产率，大肠杆菌为 85.3 正负 6.1 千克碱基对，G 7 为 25.3 正负 1.7 千克碱基对。然后，我们刚刚向您展示了如何测量单分子的配位 DNA 复制。
执行此程序时，请务必记住正确地使盖玻片功能化并制作干净的直流通道。确保保持激光功率负载并尽量减少长 DNA 的光切割。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
该协议展示了一种简单的单分子荧光显微镜技术，用于实时可视化个体复制组在DNA复制中的活动。该方法允许研究人员研究单分子水平上的DNA合成的协调活动。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 分子药理学
背景
- 单分子荧光显微镜为DNA复制提供了洞察。
- 理解复制组动力学对于研究DNA合成至关重要。
- 该技术利用功能化表面以增强成像。
- 实时观察DNA复制可以揭示复杂的生物过程。
研究目的
- 可视化个体复制组的DNA复制。
- 开发DNA合成实时成像的协议。
- 促进复制复合物活动的研究。
使用的方法
- 玻璃盖片用生物素钳分子进行功能化处理。
- 创建单分子实验的流动池。
- 将生物素化的滚环模板附着到表面。
- 在DNA复制过程中使用嵌入染料进行实时成像。
主要结果
- 成功可视化DNA复制过程。
- 证明了该协议在实时成像中的有效性。
- 对个体复制复合物协调的洞察。
- 为未来研究建立了可靠的方法。
结论
- 该协议能够详细观察DNA复制。
- 它为DNA合成动力学的进一步研究提供了基础。
- 单分子技术可以增强我们对分子生物学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This single-molecule DNA replication assay provides direct visualization of replisome dynamics, enabling mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in DNA synthesis. By quantifying replication rate and processivity at the individual molecule level, the method supports target validation and lead identification in oncology and antiviral programs where replication fidelity is a key determinant of drug response. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular mechanism to functional output, informing go/no-go decisions before substantial investment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by directly observing replication complex activity and coordination.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative measurement of replication rate and processivity as functional readouts of target engagement.
- Scientific Value: Clarifies pathway-specific effects of perturbations on DNA synthesis machinery, improving target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems with defined replication kinetics for downstream compound screening.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative outputs (rate in bp/s, processivity in kb) enabling assay reproducibility and cross-laboratory comparability.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness by providing a sensitive, real-time readout of replication inhibition or stimulation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems where dysregulated replication contributes to pathology, such as in cancer or viral infection models.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation by maintaining consistent mechanistic readouts.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking target modulation to measurable changes in replication dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, providing mechanistic insights that bridge biochemical and phenotypic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing real-time activities of individual replication complexes under defined conditions.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, real-time measurements of DNA synthesis that are amenable to high-content analysis and compound library screening.
- Analytics: Generates precise measurements of replication rate (bp/s) and processivity (kb) via linear regression and exponential fitting of single-molecule trajectories, enabling objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a functional readout of replication fidelity that correlates with cellular proliferation and genome stability phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability for evaluating replication-targeting agents across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in DNA synthesis pathways through direct observation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via surface-functionalized flow cells and real-time imaging protocols that minimize variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by delivering early, mechanism-based efficacy signals that reduce late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on replication dynamics, supporting capital-efficient advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule fluorescence microscopy, surface functionalization, and DNA biochemistry.
- Needs a fluorescence microscope with sensitive camera, laminar flow control, and intercalating dye compatibility for real-time visualization.
- Demands cross-team standardization of surface preparation, flow cell assembly, and imaging parameters to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for different template designs, protein concentrations, and buffer conditions to optimize molecule density and signal-to-noise.
- Practical limitations include the need to manage photo damage at high laser power and challenges in resolving high-density replication events without dilution or lower surface coverage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:42
Introduction
1:11
Preparing the DNA Replication Template
5:46
Assembling the Flow Chamber
2:44
Preparing Functionalized Coverslips
10:03
Single-Molecule Replication Experiment
13:18
Single Molecule DNA Replication Data Analysis and Representative Results
15:00
Conclusion
