Name: 可视化的单分子荧光显微镜下的DNA复制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 57 s
Description: 学习单分子荧光显微镜技术实时可视化DNA复制过程，利用功能化玻片和流动室观察复制体动态。该方法为研究DNA合成协调机制提供了可靠的实验基础。

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Samir Hamdan 协助开发了此技术。E. coli 蛋白来自伍伦贡大学 Nick Dixon 教授的实验室，T7 蛋白来自哈佛医学院 Charles Richardson 教授的实验室。本工作由美国国立卫生研究院（GM077248，资助 A.M.v.O.）和 Jane Coffin Childs 基金会（J.J.L.）提供资助。

在进行单分子复制实验之前，需要预先准备一些材料。
1. DNA复制模板
复制反应的底物是采用标准分子生物学技术制备的带有生物素标记且具有尾部的M13滚环1,2。
材料：M13mp18 单链 DNA，生物素标记的尾部寡核苷酸引物（5'-Biotin-T36AATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCT-3'），T7 DNA 聚合酶，加热块，苯酚/异戊醇/氯仿
<ol>
 <li>在TBS缓冲液中，将生物素标记的尾部寡核苷酸与M13退火（尾部寡核苷酸终浓度为330 nM，M13终浓度为33 nM，寡核苷酸过量10倍）。</li>
 <li>将混合物置于加热块中于65 °C加热。加热完成后关闭加热块，使其缓慢冷却，以确保引物正确退火。</li>
 <li>将已退火的M13加入含有dNTPs和MgCl2的T7 DNA聚合酶（终浓度64 nM）与T7复制缓冲液的混合物中。</li>
 <li>在37 °C孵育反应12分钟，随后用100 mM EDTA终止反应。</li>
 <li>通过苯酚/氯仿/异戊醇抽提纯化填补完成的产物DNA，并透析至TE缓冲液或其他合适的储存缓冲液中，测定DNA浓度（每次有机相抽提后均需进行反向提取，以回收残留的已退火M13）。</li>
 <li>一次模板制备可轻松获得数毫升纳摩尔浓度的模板，足以支持数百至数千次单分子实验。</li>
</ol>
2. 功能化盖玻片
为了将DNA固定在玻璃盖玻片上，首先用氨基硅烷对玻璃进行功能化处理，然后将其与生物素化的PEG分子偶联。这种涂层有助于减少DNA和复制蛋白与表面的非特异性相互作用1,3。
材料： 玻璃盖玻片、染色缸、3-氨丙基三乙氧基硅烷、甲氧基-PEG5k-NHS酯、生物素-PEG5k-NHS酯、丙酮、1M KOH、乙醇、烘箱、水浴超声仪
<ol>
 <li>将玻璃盖玻片放入染色缸中，并用乙醇充满染色缸，彻底清洗盖玻片。超声处理30分钟，倒出乙醇，用1 M KOH溶液冲洗染色缸并充满，再次超声处理30分钟。上述清洗步骤各重复一次。</li>
 <li>进行第一次功能化反应前，必须去除所有残留水分。用丙酮充满染色缸，超声处理10分钟，再用丙酮冲洗染色缸一次。</li>
 <li>在丙酮中配制体积分数为2%的硅烷试剂溶液。将该溶液加入染色缸中，振荡反应2分钟。此反应使氨基硅烷的烷氧基与玻璃表面偶联，留下可用于下一步偶联反应的活性氨基。用大量水淬灭反应。</li>
 <li>将盖玻片置于110 °C烘箱中烘烤30分钟，使其干燥。</li>
 <li>在100 mM NaHCO3（pH 8.2）溶液中配制甲氧基与生物素化PEG比例为50:1的混合液，目标生物素化PEG浓度约为0.2 % w/v。</li>
 <li>用移液器吸取100 μL PEG混合液滴加到干燥的硅烷化盖玻片上，再将另一片盖玻片覆盖其上。加入玻璃盖玻片作为间隔物，可使两片盖玻片保持分离状态。</li>
 <li>将盖玻片在PEG溶液中孵育3小时，随后分开每对盖玻片，并用大量水充分洗涤。操作时需小心保持盖玻片的功能化面朝上，因为仅有一侧被PEG包被。</li>
 <li>将盖玻片干燥后置于真空环境中保存。表面功能化效果至少可稳定保持一个月，因此可一次性批量制备数十片盖玻片，按需使用。</li>
</ol>
这些材料应提前制备，然后在每次实验中使用。每次单分子实验开始时，首先组装流动池。
3. 流动腔室的制备
实验使用一个简单的流动池进行，该流动池由经过功能化的盖玻片、双面胶带、石英载片和管路构成。每次单分子实验需准备一个流动池1,4。
材料：双面胶带、剃刀刀片、带管孔的石英载玻片、快干环氧树脂、功能化盖玻片（见上文）、链霉亲和素溶液（25 μL，1 mg/mL，溶于PBS中）、管路、封闭缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，2 mM EDTA，50 mM NaCl，0.2 mg/mL BSA，0.005% Tween-20）
<ol>
 <li>首先将 20–25 mL 封闭缓冲液放入真空干燥器中，以去除后续步骤中可能存在的气泡。</li>
 <li>取一片 PEG 功能化的盖玻片，并在其表面铺加 125 µL 用 PBS 稀释的链霉亲和素溶液。在准备流动池其他组件的同时，让其孵育 20 分钟，使链霉亲和素与表面的生物素结合。</li>
 <li>裁剪一块双面胶带，使其尺寸与石英载玻片匹配。用铅笔在胶带上标记出管路孔的位置，以便在胶带上画出流动室的轮廓（1 mg/mL）。</li>
 <li>在孔周围制作一个宽 2 mm 的矩形区域。该区域将作为流动通道，因此需确保边缘平直，并在进样口和出样口周围留出足够空间。如有需要，可使用多个通道或不同尺寸的通道。</li>
 <li>沿所画轮廓进行切割，确保切口平直、干净，避免胶粘剂突入通道内。</li>
 <li>使用丙酮或乙醇彻底清洗石英载玻片，以去除之前构建流动池时残留的胶粘剂。</li>
 <li>找到通道轮廓的最佳对齐位置，撕去胶带一侧的背衬保护膜，小心地将胶带贴附到石英载玻片上。注意对齐位置，确保进样口和出样口不被堵塞。</li>
 <li>裁剪适当长度的管路，用于流动池的进样口和出样口。将管路末端以约 30° 角斜切，有助于防止管路末端紧贴流动池底部。将管路放置在适当的支撑物上，使其悬空，便于下一步连接到流动池。</li>
 <li>用去离子水彻底冲洗已包被链霉亲和素的盖玻片，并用压缩空气吹干。请注意，仅一侧经过功能化处理，切勿将盖玻片翻转。撕去胶带另一侧的背衬保护膜，将石英载玻片贴合到盖玻片上。</li>
 <li>轻轻按压盖玻片，以排出粘合剂中可能夹带的空气。这有助于防止气泡进入流动通道。</li>
 <li>用环氧树脂密封流动室的四周。将已裁剪的管路插入石英片的孔中，并用环氧树脂固定。此步骤需静置数分钟使其干燥。</li>
 <li>待环氧树脂完全干燥后，开始进行表面封闭：通过其中一根管路抽吸部分脱气的封闭缓冲液。21 号针头可完美插入 0.76 mm 的管路中。反复冲洗数次以彻底去除气泡，并让流动室至少孵育半小时。</li>
</ol>
4. 单分子复制实验
材料：制备好的流动腔、SYTOX Orange、全内反射荧光显微镜（TIRF显微镜）、532 nm激光器、CCD相机、配备图像采集软件的计算机、滚环DNA底物、复制蛋白
<ol>
<li>封闭流通池后，即可开始单分子实验。</li>
<li>取流通池并将其放置在显微镜载物台上。用载物台夹固定腔室，并确保流道沿 y 轴方向平直对齐。</li>
<li>使用较大直径的连接管或针头将流通池出口管连接至注射泵。将入口置于封闭缓冲液中，并回拉注射器以去除管路中的空气。轻轻弹击出口管有助于清除滞留在流通池内的气泡。</li>
<li>用 1 mL 封闭缓冲液将储备 DNA 模板稀释至 25 pM。以中等流速注入腔室，以实现良好的 DNA 表面覆盖率。0.025 mL/min 流动 30 分钟效果良好。可根据每批盖玻片表面的 DNA 分子数量或实验所需分子数进行调整。</li>
<li>DNA 注入后，使用封闭缓冲液洗去多余的 DNA。至少清洗 200 个流通池体积，以彻底去除所有游离 DNA。</li>
<li>开始对复制缓冲液进行脱气处理。对于 E. coli 复制实验，应在 37 °C 下进行，以减少加热流通池时产生气泡的风险。</li>
<li>打开激光器和相机。冷却 CCD 需要达到工作温度后方可使用。</li>
<li>若进行 37 °C 实验，请开启加热器。确保物镜与流通池接触，否则后续会成为热沉影响温度控制。</li>
<li>完成清洗和脱气后，可准备反应体系。在复制缓冲液中混合核苷酸、DTT 和 SYTOX。然后加入蛋白质并轻柔混匀。</li>
<li>将反应混合物注入流通池。此流速需足以拉伸双链 DNA。对于宽度为 2 mm、高度为 100 μm 的流道，0.04 mL/min 的流速效果良好。</li>
<li>给予足够时间使混合物进入腔室，然后开始成像。建议将视野移至流道侧边，并对准粘合材料进行聚焦，以确保聚焦位置接近表面。</li>
<li>调节激光功率、显微镜焦距和 TIRF 角度。保持较低功率以避免染色 DNA 发生光切割。根据 DNA 复制速率，以 1–5 帧/秒采集数分钟图像。如需更长的复制轨迹，可重复采集，或移动至新视野以观察更多分子。</li>
<li>当反应混合物即将耗尽时，建议注入含 SYTOX 的缓冲液以观察其他视野。对不同复制分子进行多次成像可为持续性分析提供统计学数据。</li>
</ol>
5. 代表性结果
活跃复制的分子可清晰地显示为染色的DNA延伸条带。在我们的实验中，以25 pM的M13底物流动时，在60倍镜下可观察到100至1000个分子。 125 μm x 125 μm 视野（图1）。使用以下方法进行重复实验 E. coli 复制体蛋白在 37 °C （详见材料部分）每个视野可产生5-50个复制分子。在T7复制体浓度相当的情况下，由于其在底物上启动效率更高，我们观察到 &gt;70% 的分子在视野中发生复制。这些条件产生的产物密度极高，导致单个分子难以分辨和分析，因此T7实验在较低的蛋白质浓度下进行。
数据分析：为了获得反应速率数据，只需将DNA的终点长度对时间作图，并计算其斜率（图2）。对于持续合成能力的分析，需确定DNA的总长度。这两个数值均需转换为碱基对（base pairs）。在开展实验之前，应明确在适当放大倍数下相机的像素尺寸。在进行碱基对换算时，可依据DNA的晶体学长度（2.9 bp/nm）进行合理估算。然而，层流无法将DNA完全拉伸，因此建议通过已知长度的DNA（例如48,502 bp的λ DNA）进行DNA长度校准：使用生物素化寡核苷酸将其固定在流动池中，并在复制实验所用的流速下测量其经SYTOX染色后的长度。由此可确定每像素对应的碱基对数目，从而准确计算复制速率和持续合成能力。采集大量图像和视频可获得足够数量的产物分子，进而绘制出复制速率和持续合成能力的分布图（图2）1。
<img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="DNA replication diagram and microscope image showing leading and lagging strand synthesis." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 图1： （参考文献1） a) 滚环复制检测示意图。（SA，链霉亲和素）。前导链合成延伸连接环状模板与表面的尾部。该尾部由后随链聚合酶转化为双链DNA，并在层流作用下被拉伸。 
b) 使用SYTOX Orange染色并在532 nm激发下的视野示例。微小的荧光点为被固定的非复制底物。注意产物的极长形态以及每个视野中大量的产物数量（每条流动池包含 &gt;5000 个这样的视野）。
<img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="DNA 流动实验中的静态平衡；T7 和大肠杆菌分析的电泳凝胶及图示结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 图 2：（改编自参考文献 1）a,b) 来自 T7 (a) 和 E. coli (b) 实验的典型复制分子的明场图像。c) 将 a) 和 b) 中分子的终点轨迹对时间作图。通过线性回归拟合轨迹以获得复制速率。图示示例分别为 99.4 bp s-1 和 467.1 bp s-1。d) 复制产物的长度分布，通过单指数衰减拟合以获得持续合成能力：25.3 ± 1.7 kbp（T7），85.3 ± 6.1 kbp（E. coli）。e) 单分子轨迹的速率分布，通过单高斯函数拟合。平均值为：75.9 ± 4.8 bp s-1（T7），535.5 ± 39 bp s-1（E. coli）。

<ol><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27(2009).</li>
<li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+grafted+to+silicon+surfaces%3A+Grafting+density+and+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M. Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanner%2C+NA+%22DNA+replication%3A+Methods+and+protocols%22">DNA replication: Methods and protocols</a>. Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. 521, Humana Press. New York. 397-410 (2009).</li>
<li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li>
</ol>

一个关键的对照是检测染料SYTOX Orange对目标复制蛋白的影响。实现这一点的简单方法是按照前述方法在流动池中进行复制实验，但省略SYTOX。当反应混合物流经反应室后，加入含SYTOX的缓冲液以染色DNA，并分析复制分子的长度分布。或者，也可使用常规的体相反应来检测SYTOX对复制速率和效率的任何影响。
本实验仅使用一个流体通道。通过构建多通道流动室或使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）等微流控装置，可轻松实现多通道。增加通道数量可显著提高蛋白质浓度、突变体或抑制分子的筛选效率，并加快数据重复采集的速度。
如前所述，我们使用自制的铝制流动池加热器、电阻加热元件（筒式加热器）和可调电源，在 37 °C 下进行 E. coli 复制实验。这种方法具有良好的温度稳定性，并避免了购买物镜加热器的需要。为了校准加热器，我们只需在石英流动池顶部的中央钻一个孔，将热电偶插入流动通道，并像平常一样流过缓冲液。通过在逐渐升高的电压下测量流动池中缓冲液的温度，可实现精确的加热控制。

<table><tbody><tr><td>M13mp18 单链DNA</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>N4040</td><td></td></tr><tr><td>生物素化尾部寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T7 DNA聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274</td><td>使用 T7 复制缓冲液进行底物制备</td></tr><tr><td>苯酚/异戊醇/氯仿</td><td>罗氏集团</td><td>03117987001</td><td>24:24:1 体积比</td></tr><tr><td>3-氨基丙基-三乙氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td>其他氨基硅烷可单独使用或与非氨基反应性硅烷混合，以获得更稀疏的表面</td></tr><tr><td>丙烯酸琥珀酰亚胺酯 PEG</td><td>Nektar</td><td></td><td>类似的 PEG 可从 Nanocs、CreativePEGWorks 等公司购买。</td></tr><tr><td>生物素-PEG-NHS</td><td>Nektar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>Grace Bio-Lab 公司</td><td>SA-S-1L</td><td>100 &amp;#x03BC;m 厚度</td></tr><tr><td>石英载玻片</td><td>技术玻璃</td><td>20 毫米（宽）× 50 毫米（长）× 1 毫米（高）</td><td>裁剪至适合盖玻片大小。使用金刚石钻头（DiamondBurs.net）钻孔</td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>0.76 mm 内径，1.22 外径&lt;br/&gt;可使用其他尺寸的管子替代。</td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td>配制 1 mg/mL 溶液，25 &amp;#x03BC;PBS pH 7.3 中的 L 等分试样</td></tr><tr><td>脱氧核糖核苷三磷酸溶液混合物</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>核糖核苷三磷酸溶液</td><td>Amersham</td><td>272056 272066 272076 272086</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td>其他双链DNA染料也可使用</td></tr><tr><td>配备60倍TIRF物镜的荧光显微镜</td><td>奥林巴斯公司</td><td>IX-71</td><td>显微镜、相机等设备可用类似仪器替代</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>哈佛仪器</td><td>11 Plus</td><td>以换液模式运行，以方便更换溶液</td></tr><tr><td>532 nm 激光器</td><td>相干公司</td><td>Compass 215M-75</td><td>选择与所选染料对应的波长</td></tr><tr><td>EMCCD 相机</td><td>滨松光子株式会社</td><td>ImagEM</td><td></td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>HQ600/75m</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;T7 复制&lt;/strong&gt;：40 mM Tris pH 7.5，50 mM 谷氨酸钾，10 mM 氯化镁，100 &amp;#x03BC;g/mL BSA，含 5 mM 二硫苏糖醇，600 &amp;#x03BC;M dNTPs，300 &amp;#x03BC;mM ATP, 300 &amp;#x03BC;M CTP，以及使用前立即加入的15 nM SYTOX Orange。蛋白质添加如下：5 nM gp4（六聚体）、40 nM 聚合酶（1:1 gp5:硫氧还蛋白）、360 nm gp2.5&lt;sup&gt;1,5&lt;/sup&gt;.&lt;/p&gt;&lt;p类=&quot;我们介绍一种基于荧光显微镜的简单实时方法，用于在单分子水平上观察DNA复制。将一个环状的叉状DNA模板固定在经过功能化的玻璃盖玻片上，加入复制蛋白和核苷酸后，DNA模板被大量复制（图1）。通过层流延伸正在合成的双链DNA（dsDNA）产物，并利用嵌入式染料进行可视化。实时测量DNA延伸末端的位置，可精确测定复制速率（图2）。此外，完成的DNA产物长度可反映复制的持续性。该实验操作简便、快速，仅需配备灵敏度适中的相机的荧光显微镜即可完成。&quot;&gt;&lt;strong&gt;&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;strong&gt; 复制： &lt;/strong&gt;50 mM HEPES pH 7.9，12 mM 醋酸镁，80 mM 氯化钾，100 &amp;#x03BC;g/mL BSA，含 10 mM 二硫苏糖醇（DTT）、40 &amp;#x03BC;M dNTPs，200 &amp;#x03BC;M rNTPs，以及使用前立即加入的15 nM SYTOX Orange。蛋白质添加量如下：30 nM DnaB（六聚体）、180 nM DnaC（单体）、30 nM &amp;alpha;&amp;epsilon;&amp;theta;，15 nM &amp;#964;&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#947;&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;&amp;#948;&amp;#948;&amp;rsquo;&amp;#967;&amp;#968; 或 &amp;#964;&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;#948;&amp;#948;&amp;rsquo;&amp;#967;&amp;#968;，30 nM &amp;#946; （二聚体），300 nM DnaG，250 nM SSB（四聚体），20 nM PriA，40 nM PriB，320 nM PriC，480 nM DnaT&lt;sup&gt;1,6&lt;/sup&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;&lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;strong&gt; 复制： &lt;/strong&gt;50 mM HEPES pH 7.9，12 mM 醋酸镁，80 mM 氯化钾，100 &amp;#x03BC;g/mL BSA，含 10 mM 二硫苏糖醇（dithiothreitol）、40 &amp;#x03BC;M dNTPs，200 &amp;#x03BC;M rNTPs，以及在使用前立即加入的15 nM SYTOX Orange。蛋白质添加量为：30 nM DnaB（六聚体）、180 nM DnaC（单体）、30 nM &amp;alpha;&amp;epsilon;&amp;theta;，15 nM &amp;#964;&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#947;&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;&amp;#948;&amp;#948;&amp;rsquo;&amp;#967;&amp;#968; 或 &amp;#964;&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;#948;&amp;#948;&amp;rsquo;&amp;#967;&amp;#968;，30 nM &amp;#946; （二聚体），300 nM DnaG，250 nM SSB（四聚体），20 nM PriA，40 nM PriB，320 nM PriC，480 nM DnaT&lt;sup&gt;1,6&lt;/sup&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

利用荧光显微镜观察单分子dna复制

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

我们介绍一种基于荧光显微镜的简单实时方法，用于在单分子水平上观察DNA复制。将环状分叉的DNA模板固定在功能化玻璃盖玻片上，加入复制蛋白和核苷酸后，DNA可被大量复制（图1）。通过层流拉伸正在生长的双链DNA（dsDNA）产物，并利用嵌入染料进行可视化。实时测量DNA延伸末端的位置，可精确确定复制速率（图2）。此外，完成复制的DNA产物长度可反映复制的持续性。该实验操作简便、快速，仅需配备灵敏度适中的相机的荧光显微镜即可完成。

关键词：荧光显微镜，单分子检测，DNA复制，复制速率，复制持续性，双链DNA（dsDNA）

本方案展示了一种简单的单分子荧光显微镜技术，用于实时观察单个复制体进行的DNA复制过程。

利用荧光显微镜观察单分子DNA复制

我们介绍一种基于荧光显微镜的简单实时方法，用于在单分子水平上观察DNA复制。该方法使用环状分叉DNA……

该技术中，使用惰性与生物素化聚乙二醇分子的混合物对玻璃盖玻片进行功能化处理。利用该功能化表面构建流动池，并将其置于全内反射显微镜上。通过多价链霉亲和素将生物素标记的滚环扩增模板固定在表面。当通过添加复制区蛋白和核苷酸对底物进行复制时，所生成的双链DNA在层流作用下延伸，并利用一种嵌入式染料实时成像。大家好，我是来自哈佛医学院生物化学与分子药理学系Antoine Van Oijen实验室的Nathan Tanner。我是同样来自Van Oijen实验室的Joe Laro。今天，我们将向您展示一种在单分子水平上实时进行DNA复制荧光成像的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究单个复制复合物的协同DNA合成活性。现在，让我们开始吧。开始此实验步骤时，将生物素标记的尾部寡核苷酸与M13单链DNA退火：在TBS缓冲液中加入10倍过量的寡核苷酸，加热至65摄氏度，随后关闭加热模块，使其缓慢冷却，以确保引物正确退火。现在引物M13已准备就绪，将其加入含有64纳摩尔T7 DNA聚合酶、T7复制缓冲液、dNTPs和氯化镁的混合物中，在37摄氏度孵育12分钟。孵育结束后，用100毫摩尔EDTA终止反应。接下来，使用苯酚-异戊醇-氯仿对补平后的产物DNA进行纯化，通过抽提并透析至TE缓冲液或其他合适的储存缓冲液中。每次有机相需反向提取，以回收任何残留的引物。透析后，使用紫外-可见分光光度计测定M13 DNA的浓度。一次模板制备可获得足够浓度的纳米摩尔级模板，用于数百至数千次单分子实验。现在DNA已准备就绪，接下来开始制备功能化盖玻片。待扩增的DNA将连接到经阿米胺（Amil Lane）功能化的玻璃盖玻片上，阿米胺的Oxy基团与玻璃结合，留下一个可与生物素化聚乙二醇（peg）分子结合的氨基。该涂层有助于减少非特异性结合到表面。为了彻底清洁玻璃盖玻片，将其放入染色缸中，并用乙醇超声清洗液充满染色缸。超声清洗30分钟后，倒掉乙醇并用1摩尔的氢氧化钾超声清洗液充满染色缸，继续超声清洗30分钟，并重复上述两种清洗步骤各一次。在进行第一次功能化反应前，必须去除所有残留的水分。将染色缸中装入丙酮，超声处理10分钟。倒空染色缸后，再次加入丙酮。随后向染色缸中加入西奈试剂，振荡反应2分钟。然后加入大量过量的水进行淬灭。接着将盖玻片置于烘箱中，在110摄氏度下烘烤30分钟以干燥。随后，通过加入末端胺化的PEG制备浓度约为0.2%（重量/体积）的PEG混合液，将玻璃盖玻片作为间隔物以实现盖玻片之间的分离，用移液器吸取100微升该混合液滴加到一片干燥的硅烷化盖玻片上。在上方放置第二块盖玻片。将盖玻片在PEG溶液中孵育3小时。然后将每对盖玻片分开，并用大量水充分洗涤。注意保持盖玻片的功能化面朝上，因为只有一侧涂有聚乙二醇（peg）。最后用压缩空气吹干盖玻片，并将其置于干燥器中的真空环境下保存，表面至少一个月内保持稳定。因此可一次性制备数十个盖玻片，按需使用。现在盖玻片已准备就绪，可以组装单分子实验所需的流动池。首先，将 20 至 25 毫升含有 BSA 的封闭缓冲液置于干燥器中，以去除后续步骤中可能存在的气泡。接下来，将 25 微升链霉亲和素稀释于 100 微升 PBS 中，并将该溶液均匀涂布于经 peg 修饰的功能化盖玻片表面，在室温下孵育 20 分钟，使链霉亲和素与表面的生物素结合，同时可准备流动池的其他组件。在盖玻片孵育的同时，裁剪一段双面胶带（两面均有背衬），使其尺寸与用于组装流动室的石英载玻片相匹配。用铅笔在胶带上标记出管路孔的位置，以便在胶带上绘制流动室的轮廓。标记完孔位后，在标记周围制作一个2毫米宽的矩形框。该矩形将作为流体通道，因此务必确保侧边平直，并在管路进出口周围预留足够空间。现在沿着绘制的轮廓线裁剪已标记的胶带，进行平直且干净的切割，以确保没有胶粘剂突入通道内。使用丙酮彻底清洁石英载片，以去除之前实验中流动池构建所残留的胶粘剂。找到通道轮廓的最佳对齐位置。移除胶带背衬的一侧，小心地将胶带贴到载玻片上。注意正确对齐胶带，确保进样口和出样口的孔洞不被堵塞。接下来，准备长度合适的0.76毫米内径管，用于流式池的进液口和出液口。将管子末端以约30度角斜切，有助于防止管子末端紧贴腔室底部。将管子悬挂在试管架上，以便在后续步骤中方便地连接到流式池。此时盖玻片孵育已结束。用清水彻底冲洗链霉亲和素包被的盖玻片，并用压缩空气吹干。注意不要将盖玻片翻转，因为仅一侧具有功能化表面。最后，通过移除胶带另一侧的背衬，并将石英载玻片放置在盖玻片上，完成流动室的组装。轻轻按压盖玻片，以排出粘合剂中夹带的任何空气。这有助于防止气泡进入流动通道。用环氧树脂密封腔室的侧面。将切割好的管子插入石英片的孔中，并用环氧树脂固定，静置几分钟使其干燥。环氧树脂密封干燥后，开始进行表面封闭。使用21号针头，从其中一根管中吸取部分脱气封闭缓冲液。反复冲洗数次以去除气泡，并让反应室孵育至少半小时，然后再进行单分子复制实验。封闭流式池后，将其放置在显微镜载物台上。使用载物台夹固定样品池，并确保流道沿 y 轴方向对齐。使用直径较大的连接管将流式池的出口管与注射泵相连。将进样管放入封闭缓冲液中，并回拉注射器以去除管路中的任何空气。轻轻弹击出样管，有助于清除流动池中滞留的气泡。现在加入DNA，将储备DNA模板用1毫升封闭缓冲液稀释至25皮摩尔，以中等流速（例如0.025毫升/分钟）流入反应室，持续30分钟，以实现DNA在表面的良好覆盖。DNA进入反应室后，使用封闭缓冲液清洗至少200个流通池体积，以去除多余的DNA。为彻底清除游离的DNA，开启激光器和相机。冷却式CCD需达到设定温度后方可使用。洗去多余的 DNA 并对复制缓冲液进行脱气后，在复制缓冲液中配制包含核苷酸、DTT 和细胞毒素的复制反应混合物。然后加入蛋白质，轻轻混匀。接着将反应混合物注入流动池中。此处的流速需要足够大，以拉伸双链 DNA，适用于宽度为 2 毫米、高度为 100 微米的流动通道，0.04 毫升/分钟的流速效果良好。让混合物进入腔室约需 10 分钟时间。将视野移至通道的一侧，并聚焦于粘附材料，以确保接近表面进行聚焦并开始成像。调节激光功率、显微镜焦距和扫描角度。保持较低的激光功率，以避免染色DNA发生光裂解。根据DNA复制速率，以每秒一到五帧的速度采集几分钟的图像。若需获得更长的复制轨迹，可重复实验；当几乎所有反应混合物已被泵入细胞时，更换视野以观察更多分子，通过加入含细胞色素c的缓冲液冲洗流动池，从而观察其他视野。对不同复制分子进行多次成像，可为确定复制效率提供统计学数据。在滚环扩增中，复制实验的前导链合成延伸了连接环状模板与表面的尾部，随后由滞后链聚合酶将尾部转化为双链DNA，并通过层流拉伸。以下是使用532纳米激发光的Cy3橙色荧光成像视野示例。微小的荧光点为固定的未复制底物。注意产物的极长长度以及每个视野中大量的产物数量。典型的视野中可见多个正在复制的分子，表现为逐渐增长的明亮DNA染色条带。在37摄氏度下进行的大肠杆菌实验中，每个视野中的分子数量为5至50个，具体数目取决于表面密度。T7复制区域的起始效率要高得多，可在视野中复制超过50%的分子。由于密度如此之高，很难分辨出单个分子，如图中所示。因此，应在较低的蛋白质浓度或表面密度下进行T7实验。来自大肠杆菌和T7实验的典型复制分子的Chime图包含大肠杆菌和T7分子的终点轨迹，轨迹随时间变化绘制。通过线性回归拟合轨迹以获得复制速率，在本例中，大肠杆菌为每秒467.1个碱基对，T7为每秒99.4个碱基对。对于T7，单个分子轨迹的速率分布通过单高斯拟合，得到大肠杆菌（e coli）的平均速率为535.5 ± 39 碱基对每秒，G7的平均速率为75.9 ± 4.8 碱基对每秒。对于T7，复制产物的长度分布通过单指数衰减拟合以获得持续合成能力，该值在大肠杆菌中为85.3 ± 6.1 千碱基对，在G7中为25.3 ± 1.7 千碱基对。接下来，我们刚刚向您展示了如何利用单分子方法测量协调的DNA复制过程。进行此操作时，需注意正确地对盖玻片进行功能化处理，并制作出干净、笔直的流道。务必控制激光功率负荷，尽量减少长链 DNA 的光解作用。以上即是全部要点。感谢观看，祝您的实验顺利。

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