Nucléofection et de la culture primaire de neurones embryonnaires de souris hippocampe et cortex

Les neurones hippocampiques et corticaux ont été largement utilisés pour étudier la polarisation neuronale du système nerveux central, la croissance des dendrites axonales et la formation et la fonction des synapses, et l’avantage de la culture de ces neurones est qu’ils se polarisent facilement en formant des axones et des dendrites distinctifs sur un substrat bidimensionnel à de très faibles densités. Cette vidéo présente une technique permettant de disséquer la culture et la transfection de neurones embryonnaires, hippocampiques et corticaux de souris via l’affection nucléologique, qui permet l’expression de protéines de fusion marquées par fluorescence au début du développement environ quatre à huit heures après le placage L’expression des protéines marquées par fluorescence est maintenue tout au long de la vie du neurone pendant plus de deux mois en culture. Cela permet d’étudier la fonction des protéines au cours d’événements de développement précoces tels que la croissance axonale et d’événements ultérieurs tels que la synaptogenèse et la plasticité synaptique.

Les premières cellules gliales sont isolées à partir des hémisphères corticaux de la période postnatale. Un à trois jours de pops de souris et plaqués dans des flacons. Après avoir atteint une fluidité de 70 à 100 % de co, les cellules gliales sont ensuite replaquées sur des lamelles de verre.

Ensuite, les neurones de l’hippocampe ou corticaux sont isolés chez des souris E 15,5 et transfectés par affection nucléologique avec des plasmides codant pour des protéines de fusion fluorescentes telles que la protéine fluorescente rouge. Les neurones transfectés sont ensuite plaqués dans des chambres d’imagerie pour des études à court terme. Pour les cultures à long terme, les cellules gliales sur des lamelles de verre sont inversées sur des cultures hippocampiques ou corticales Pour fournir un soutien trophique, des neurones individuels peuvent ensuite être imagés pour montrer la localisation dynamique des protéines de fusion dans les axones ou les dendrites des neurones.

Bonjour, je suis Eric Dent, professeur adjoint d’anatomie à l’Université du Wisconsin à Madison. Aujourd’hui, trois de mes étudiants de premier cycle, Chris Wezelman, Jason Bwe et Derek Lombard, vont démontrer une procédure d’isolement du placage et de maintien des cultures de neurones corticaux et hippocampiques pour la culture à court et à long terme. Ces cultures peuvent être utilisées pour étudier la dynamique des protéines de fusion fluorescentes tout au long du développement neuronal, de la croissance initiale des neurites au développement des axones et des dendrites et à la synaptogenèse.

Pour préparer les chambres à l’imagerie, les neurones embryonnaires, hippocampiques et corticaux de souris. Commencez avec des boîtes de Pétri de 35 millimètres avec des trous de 15 millimètres percés dans le fond et toutes les fraises retirées. Fait fondre un mélange de vaseline de paraffine à trois pour un dans un tube conique en le plaçant dans un bain d’eau bouillante.

Ensuite, utilisez un petit pinceau pour enduire le dessous du plat autour du trou. Assurez-vous de mélanger le mélange de vaseline de paraffine entre les chambres car il se séparera. Placez la lamelle de recouvrement sur le trou.

Une fois que tous les plats ont été préparés, placez-les dans un four à 80 degrés Celsius jusqu’à ce que le mélange de paraffine soit fondu. Cela devrait prendre environ 10 minutes. Retirez ensuite la vaisselle sur une surface plane et laissez le mélange de paraffine prendre pendant au moins une minute.

Retournez la vaisselle et placez-la sous une hotte. Allumez la lumière UV pendant 30 minutes pour stériliser à la fois l’intérieur des couvercles et le fond des chambres. Couche suivante.

Le couvercle de la chambre glisse avec de la lycine poly D pendant une heure. Ensuite, rincez abondamment les lamelles revêtues trois à cinq fois avec un filtre stérile à l’eau déminéralisée pour éliminer toute trace de tampon d’alésage Après le rinçage final, utilisez un aspirateur pour sécher les chambres. Ceux-ci peuvent être utilisés immédiatement ou stockés dans une salle de culture tissulaire pour plus tard. Utiliser.

Les chambres revêtues doivent être utilisées dans la semaine suivant la préparation si des cultures à long terme doivent être préparées. Les couches nourricières de la glie corticale devront être commencées deux à trois semaines avant de poursuivre les dissections corticales ou hippocampiques. Placez les cerveaux de quatre souris P un à P trois dans une boîte contenant du milieu de dissection froid et placez-le sous la lunette de dissection.

Retirez les bulbes olfactifs, les deux hémisphères cérébraux et les méninges. Transférez les hémisphères dans une nouvelle parabole ne contenant aucun support. À l’aide d’une lame de rasoir stérile propre, émincez les cortex aussi finement que possible.

Ensuite, à l’aide d’une pipette en plastique, transférez le tissu haché dans un tube conique de 50 millilitres contenant 12 millilitres de dissection à froid. Douleur moyenne. Ajoutez de la trypsine et de l’ADN aux concentrations finales de 0,25 % et 0,1 % respectivement. Incuber dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes avec un tourbillon intermittent.

Après l’incubation, retirez le tube du bain-marie et nettoyez-le soigneusement avec de l’éthanol à 70 % avant de l’introduire dans le tissu. Hotte de culture. Pipetez le tissu cortical de haut en bas.

Avec une pipette de 10 millilitres environ 10 à 15 fois ou jusqu’à ce que la plupart des morceaux disparaissent, remettez le tube dans le bain-marie pendant encore 10 minutes en tourbillonnant par intermittence. Encore une fois, nettoyez soigneusement le tube avec de l’éthanol à 70 % et ramenez-le dans le tissu. Hotte de culture.

Pipetez le tissu cortical de haut en bas. Comme auparavant, avec une pipette de cinq millilitres, ajoutez 15 millilitres de glial chaud, de moyen et de centrifugeuse à 1000 tr/min pendant 10 minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension les cellules granulées dans 20 millilitres de milieu glial frais.

Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules. Ensuite, plaquez cinq à 7,5 millions de cellules dans 15 millilitres de milieu glial par fiole de 75 centimètres carrés. Placez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius après un jour et tous les deux à trois jours suivants en culture, délogez toutes les cellules lâches en frappant le flacon contre la surface du capot.

Retirez le milieu ainsi que toutes les cellules délogées et remplacez-le par 15 millilitres de glial frais. Les cellules gliales moyennes peuvent être récoltées après une à deux semaines de croissance dans les flacons lorsqu’elles sont environ à 100 % confluentes. Pour préparer des lamelles individuelles recouvertes de glie, commencez par placer six acides nitriques nettoyés et stérilisés.

Un couvercle rond de 25 millimètres se glisse dans un plat de 10 centimètres et à l’aide d’un petit pinceau, placez trois points du mélange de vaseline de paraffine à trois. Sur chaque couverture, glissez-le dans un motif triangulaire. Placez deux points sur les bords de la lamelle pour l’ancrer au plat.

Traitez les plats ouverts avec une lumière UV pendant 30 minutes. Enduire les lamelles de poly D lysine pendant une heure. Ensuite, lavez abondamment trois à cinq fois avec un filtre stérile à l’eau déminéralisée et laissez sécher en retirant les cellules gliales de l’incubateur.

Jeter le support et laver avec cinq millilitres de trypsine préchauffée. Ajoutez trois millilitres de trypsine dans le ballon et laissez incuber pendant une minute à 37 degrés Celsius. Une fois les cellules détachées, ajoutez cinq millilitres de milieu glial pour arrêter le trippin.

Retirez le GL de la fiole en le pipetant de haut en bas 10 à 15 fois. Transférez ensuite le média dans une centrifugeuse à tube conique de 15 millilitres à 1000 tr/min pendant huit minutes. Après la centrifugation, suspendre les cellules dans 10 millilitres de milieu glial.

Ensuite, après avoir compté les cellules cinq fois, 10 à la cinquième cellule dans 12,5 millilitres de milieu glial par boîte de 10 centimètres contenant les lamelles de couverture. Remplacez le milieu par un milieu glial préchauffé frais tous les deux à trois jours la veille de la dissection neuronale. Retirez le milieu glial et remplacez-le par un milieu sans sérum.

Utilisez ce sérum sans sérum glial plus tard. Lors d’une inondation, de cultures corticales ou hippocampiques, un C est ajouté à une concentration finale de cinq micromolaires. Afin d’éviter la prolifération gliale de l’affection du nucléo, réactivez par transfection, comme indiqué dans les instructions du fabricant, puis réchauffez la solution à température ambiante.

Placez un plat contenant de la cervelle de souris E 15.5 dans un milieu de dissection froid. Sous microscope de dissection, utilisez une aiguille de tungstène pliée pour retirer les deux néocortex. Ensuite, à l’aide d’une micro-pince, retirez les méninges et placez les cortex dans une nouvelle boîte de milieu de dissection froid.

L’hippocampe et le cortex sont visibles le long de la face médiale de l’hémisphère cérébral à l’aide de petits ciseaux d’iris. Retirez soigneusement l’hippocampe. Ensuite, retirez le cortex restant.

Répétez la dissection sur les cerveaux de toute la portée. Placez les hippopotames Camp Cortices dans des microtubes séparés de 1,5 millilitre remplis d’un millilitre de dissection froide. Douleur moyenne. Placez les tubes sur de la glace Après avoir disséqué tous les cortex chez l’hippopotame Campi.

Ajoutez 110 microlitres de trypsine à 2,5 % dans les micro-tubes contenant le tissu et placez les tubes dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. À l’aide d’une pipette P 1000, retirez autant de liquide que possible du tube. Ajoutez ensuite un millilitre de milieu de placage dans chaque tube et lavez le tissu en inversant doucement le tube de la micro-fuge.

Répétez le lavage deux fois Après le lavage final, ajoutez un millilitre de milieu de placage. Utilisez une pipette P 1000 pour trier les morceaux 15 fois. Transférez ensuite le surnageant et les cellules dans un nouveau tube conique de 15 millilitres contenant quatre millilitres de milieu de placage, en laissant les morceaux qui restent dans un tube de micro-fuge.

Faites tourner le tube de 15 millilitres à 350 tr/min pendant sept minutes avec la pause après la centrifugation, jetez le surnageant et ajoutez 100 microlitres de température ambiante prémélangée. Solution d’affection nuculaire pour chaque transfection, pipeter vers le haut et vers le bas cinq fois pour mélanger le transfert suivant. 100 microlitres de la solution d’affection nucléaire et du mélange cellulaire dans chaque nouveau tube de microfuge contenant une quantité appropriée d’ADN, un à deux microgrammes d’ADN par transfection pour les cultures à long terme, permettront de marquer moins de 10 % des neurones de la culture.

Alors que cinq à 10 microgrammes d’ADN par transfection entraîneront une efficacité de transfection plus élevée pour la culture, ajoutez la suspension cellulaire et le mélange d’ADN à un vêtement d’électroporation. Placez ensuite le vete dans l’électro. Pour les neurones du SNC de souris, réglez le programme d’effecteur de nucléo sur oh 0 0 5 fonctionnant rapidement, ajoutez 500 microlitres de milieu de placage d’avant-guerre et équilibré au qve et transférez la solution cellulaire dans un nouveau tube de micro-fuge de 1,5 millilitre.

Ajoutez suffisamment de milieu de placage pour porter le volume de chaque transfection à un millilitre. Après avoir compté les cellules de trois à cinq fois 10 puissance troisième cellule centimètre carré pour les jeunes cultures, ou cinq à 10 fois 10 puissance troisième cellule, pourcentage du mètre carré pour les cultures à long terme, généralement cinq fois 10 puissance cinquième ou une fois 10 puissance six. Les cellules sont utilisées par transfection pour préparer des cultures à court terme.

Une heure après le placage, inondez les boîtes de culture de 35 millimètres avec deux millilitres de dioxyde de carbone chaud équilibré et sans sérum inondé. Les chambres d’imagerie permettent d’obtenir une très faible teneur en sérum inférieure à 0,5 %Les cultures à court terme n’ont pas besoin d’être cultivées avec une couche nourricière gliale et n’ont pas besoin d’être anguillées. Pour préparer des cultures à long terme, ajoutez un millilitre d’affection gliale à un milieu exempt de sérum.

Retirez une lamelle recouverte de GL contenant trois points de vaseline de paraffine et retournez-la sur le trou de 15 millimètres de la parabole 35. Ajoutez ensuite un autre millilitre de milieu pour nourrir les cultures à long terme. Remplacez un tiers du milieu sans sérum tous les deux à trois jours.

Après cinq à sept jours de culture, la cytosine arabe IDE ou aee est ajoutée à une concentration finale de cinq micromolaires afin d’empêcher la prolifération gliale. Les images appariées suivantes de neurones hippocampiques vivants représentatifs montrent à la fois une image de contraste interférentiel différentiel et une micrographie fluorescente correspondante. Chacune de ces cellules a été transfectée avec EGFP, tubuline et DS rouge deux chez des vecteurs PA.

Au cours de la première étape, les neurones se fixent d’abord et, sur une période d’environ un jour, font saillie en forme de feuille la melo podia et Filip podia en forme de doigt autour de la périphérie du corps cellulaire. Au cours de la deuxième étape, les protubérances initiales se différencient en plusieurs neurites émanant du corps cellulaire, restant généralement d’une longueur d’environ 30 à 50 microns. Au cours de la troisième étape, de manière stochastique, l’un des neurites commence à s’étendre rapidement pour devenir l’axone.

Les autres neurites restent courts et sont qualifiés de processus mineurs. La plupart des neurones de l’hippocampe et de la corticale ont progressé jusqu’au stade trois de deux à trois jours en culture au cours de la quatrième étape, qui se produit au cours de la semaine suivante ou deux processus mineurs, s’épaississent, s’allongent et se ramifient pour devenir les dendrites ici, ceux-ci sont indiqués en vert. Pendant ce temps, l’axone s’amincit au fur et à mesure qu’il continue de croître et de se ramifier au bout de deux à trois semaines.

En culture, les dendrites se différencient en formant des épines dendritiques, de petites protubérances le long des dendrites. Les neurones du cinquième stade varieront dans leur forme et leur taille, mais la plupart devraient subir cette série d’étapes de développement. Les neurones transfectés peuvent ne pas progresser à travers ces étapes si la surexpression des protéines perturbe le développement neuronal.

De plus, les neurones peuvent ne pas progresser à travers tous les stades de développement. Si les lamelles ne sont pas nettoyées correctement ou si la polylysine n’adhère pas correctement, la glie peut également proliférer considérablement, surtout si un C n’est pas utilisé. Il s’agit d’une image en contraste de phase d’une culture vieille de deux semaines dans laquelle les cellules gliales ont envahi la culture dans les cultures à long terme.

Changer de média trop fréquemment ou pas assez fréquemment peut également compromettre la viabilité des neurones. Il s’agit d’une image en contraste de phase d’une culture dans laquelle la plupart des neurones sont morts et les neurones restants ont des corps cellulaires rétrécis et des processus perlés. À titre de comparaison, il s’agit d’une image en contraste de phase de neurones sains de l’hippocampe à deux semaines de culture. Notez les corps cellulaires plus grands et l’absence de battements dans les processus.

De plus, à ce stade, les processus dendritiques se sont épaissis et il existe un filigrane étendu des processus axonaux. Une fois maîtrisés, l’embryon, la corticale et la dissection, la transfection et le placage de toute la portée de fœtus peuvent être effectués en deux heures s’ils sont effectués correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les neurones de l’hippocampe et de la corticale sont très sensibles aux perturbations mécaniques.

De plus, il est important de garder les solutions aussi froides que possible pendant l’isolement des neurones pour maintenir l’activité métabolique faible. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie de cellules vivantes et l’enregistrement physiologique de l’activité peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont les protéines de fusion fluorescentes d’intérêt se séparent dans différentes régions du neurone. Si la localisation des protéines est associée à des changements dans l’activité synaptique, ou comment les fonctions de ces protéines sont affectées par différents traitements pharmacologiques.