Isolement et culture de cellules embryonnaires de rat neurones: un protocole rapide

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de cultiver les neurones corticaux ou hippocampiques dans des conditions sans sérum. Ceci est accompli en disséquant d’abord les embryons de rat pour obtenir les cortex ou hippopotes. La deuxième étape consiste à incuber le tissu cérébral avec le triple le express pour une digestion enzymatique en douceur.

Ensuite, les tissus seront rincés avec de l’hibernat E et un milieu de culture trituré mécaniquement et complet. Pour obtenir une suspension unicellulaire, l’étape finale consiste à compter et à plaquer les neurones dissociés sur des boîtes recouvertes de poly de lysine ou des lames de verre recouvertes de poly de lysine. In fine, cette méthode permet l’isolement et la culture des neurones dans des conditions sans sérum et sans support glial.

Les cultures neuronales peuvent être utilisées pour l’immunochimie, la préparation et l’électrophysiologie. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que nous avons remplacé la trypsine par une enzyme plus douce. Nous avons omis les moyens du tissu avant la digestion enzymatique, ainsi que l’utilisation du traitement par DNA.

De plus, les Cortes ou hippopotames disséqués peuvent être stockés dans un milieu d’hibernation à quatre degrés jusqu’à une semaine avant leur dissociation. Pour préparer d’abord la solution de LDO, ajoutez cinq millilitres d’eau stérile double distillée à cinq milligrammes de LDP pour obtenir une solution mère d’un milligramme par millilitre. Mélangez la solution mère en la pipetant plusieurs fois, puis utilisez-la immédiatement ou conservez-la entre deux et huit degrés Celsius.

Pour enrober les plats de culture. Diluer la solution mère PDL avec de l’eau stérile double distillée jusqu’à la concentration finale de 10 microgrammes par millilitre. Ensuite, pipetez une solution de trois millilitres dans une boîte de 60 millimètres pour couvrir la surface de culture.

Après cela, secouez le plat pour assurer un revêtement uniforme de la surface de culture. Ensuite, incubez-le à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, retirez la solution PDL par aspiration.

Brièvement, lavez le plat deux fois avec trois millilitres d’eau stérile double distillée. Après le deuxième lavage, retirez complètement l’eau par aspiration. Dans cette procédure, mélanger la solution mère PDL d’un milligramme par millilitre et la solution mère stratifiée d’un milligramme par millilitre dans de l’eau stérile doublement distillée à la concentration finale de 10 et cinq microgrammes par millilitre respectivement.

Ensuite, pipetez suffisamment de solution dans les puits d’une lame de verre à deux chambres pour couvrir la surface de culture. Ensuite, secouez doucement la chambre pour assurer un revêtement uniforme. Après cela, incubez le plat enrobé à température ambiante pendant la nuit.

Le lendemain, retirez la solution de revêtement stratifié PDL par aspiration. Brièvement, lavez le plat deux fois avec un millilitre d’eau stérile double distillée Après le deuxième lavage. Retirez complètement l’eau par aspiration dans cette étape, voyage chaud LE express et neuro basal B 27, milieu complet dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius.

Ajoutez ensuite trois millilitres de solution d’hibernation froide E dans chacune des quatre boîtes de culture de 60 millimètres et 13 millilitres de celle-ci dans un tube conique en polypropylène haute clarté BD Falcon de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez 25 à 30 millilitres de milieu de dissection froid dans chacune des trois boîtes de culture de 100 millimètres pour laver les embryons immédiatement après leur retrait du sax amniotique. Ensuite, sacrifiez un rat enceinte E 17 et vaporisez son bas-ventre avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, coupez médialement la peau et les muscles avec une paire de ciseaux. Pour exposer l’utérus et les embryons, retirez tous les fœtus et placez-les dans une boîte stérile de 100 millimètres contenant un excès de dissection froide. Medium préparé plus tôt.

Ensuite, coupez les embryons du sac amniotique à l’aide d’une paire de petits ciseaux. Placez-les ensuite dans la deuxième boîte de 100 millimètres contenant le fluide de dissection à froid. Lavez les embryons à température ambiante en inclinant doucement le plat pendant cinq à 10 secondes.

Ensuite, transférez les embryons rincés dans la troisième boîte de 100 millimètres contenant le milieu de dissection Sous un stéréomicroscope, extrayez le cerveau de chaque embryon de rat en retirant la peau et le crâne avec une paire de pinces incurvées. Placez environ cinq cerveaux dans un plat de 60 millimètres avec de l’hibernation E froide. Gardez ensuite les plats sur de la glace. Prenez une parabole à la fois sous le microscope de dissection.

Séparez les hémisphères et isolez les cortex cérébraux. Retirez ensuite le mésencéphale et les méninges. Recueillez tous les cortex disséqués dans un tube conique transparent de 15 millilitres contenant 13 millilitres d’hibernation froide.

E.Laissez les cortex cérébraux sur de la glace jusqu’à ce que toutes les dissections soient terminées. Transférez le tube dans une hotte de culture tissulaire. Laissez ensuite les cortex se déposer au fond du tube et retirez soigneusement le supranatin.

Ensuite, ajoutez 13 millilitres d’hibernat frais E dans le tube conique de 15 millilitres. Laissez les cortex se déposer au fond du tube et retirez soigneusement le surnageant. Encore une fois, répétez ces procédures deux fois de plus et après le dernier lavage, retirez soigneusement tous les supports.

Ensuite, digérez les cortex cérébraux en ajoutant un à deux millilitres de trip le express chaud. Scellez le capuchon du tube avec du paraform. Placez ensuite le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après cela, vaporisez le tube avec de l’éthanol à 70 %. Ajoutez ensuite 10 millilitres d’hibernation E.Laissez les cortex se déposer au fond du tube et retirez le surnageant. Répétez cette étape trois fois pour laver le voyage Le express.

Et dans la dernière étape, retirez soigneusement tous les supports. Tritréfère doucement les cortex environ quatre à cinq fois dans deux millilitres de milieu neurobasal B 27 complet. À l’aide d’un pâturage en verre poli au feu, Pasteur tritrate les cortex quatre à cinq fois avec une pipette pasteure en verre stérile de plus petit diamètre.

Laissez ensuite les morceaux de tissu restants se déposer. Après cela, transférez la suspension cellulaire unique supérieure dans un nouveau tube de 15 millilitres en laissant derrière vous les morceaux de tissu déposés. Ensuite, diluez davantage la suspension cellulaire jusqu’à 10 à 12 millilitres avec le neuro basal B 27, milieu complet pour diluer les cellules pour le comptage.

Ajoutez 10 microlitres de suspension cellulaire à 490 microlitres de solution de comptage 50 x dans une plaque tubulaire de 1,5 millilitre. Les cellules du PDL ont revêtu des plaques à une densité de 50 000 cellules par centimètre carré. Les neurones peuvent être utilisés pour des expériences après quatre à cinq jours in vitro.

Voici une image représentative d’un noyau de neurone cortical affecté par la GFP P max et l’immuno marqué par l’anticorps red map two. Et voici la culture in vitro de cinq jours de neurones corticaux de rat isolés des cortex, qui avaient été maintenus à quatre degrés Celsius pendant une semaine dans l’hibernation E plus B 27 après leur dissection originale des embryons. Les neurones ont été plaqués sur une lame de verre à deux chambres recouverte de PDL et de laminine comme décrit précédemment.

L’immunofluorescence verte indique l’expression de la carte deux dans les processus neuronaux et les noyaux cellulaires sont indiqués en bleu. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures environ si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de cultiver des neurones dans des conditions sans sérum et sans Anglia.