Выявление функциональных матриксных металлопротеиназ по Zymography

Общей целью этой процедуры является обнаружение функционального матрикса металлопротеина ais. Это достигается путем предварительной подготовки образца к zy путем добавления загрузочного буфера, свободного от снижающих гибкость агентов. Желатин, гель ZY Graham затем загружают в образец и дают ему покрыться до тех пор, пока отслеживающий краситель не достигнет конца геля.

После электрофореза гель ренатурируется, проявляется, окрашивается и окрашивается. Заключительным этапом процедуры является сканирование геля для анализа данных. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие активность матриксной металлопротеиназы в образцах с помощью анализа плотности полосы.

Здравствуйте, я из лаборатории доктора Кристин, укушенной на кафедре молекулярной физиологии и биофизики в медицинском колледже LER. Сегодня мы покажем вам процедуру определения матрицы metallo Persis по phy. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения матрицы Metallo Persis, секретируемой культивируемой первичной клеткой.

Итак, давайте изучать. Перед началом применения этого протокола необходимо подготовить все матриксные металлопротеиназы или ММП в достаточном объеме для поддержания функции ферментов. Образцы можно использовать сразу или хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Здесь ММП 2, также известная как желатинизация А или коллагеназа четвертого типа, используется для демонстрации визуализации активности МП с помощью синографии. После того, как ферменты MMP были приготовлены, приобретите мешочек с гелем 10% желатина zy gram, содержащий гель внутри кассеты. Промойте кассету деионизированной водой.

Снимите защитную ленту с нижней части кассеты и расческу с верхней части геля. Трижды промойте лунки с трисглицином. Рабочий буфер SDS.

Поместите гель в мини-аппарат для электрофореза с элементами, следя за тем, чтобы меньшая сторона кассеты была обращена внутрь. Зафиксируйте гель на месте с помощью натяжного клина для геля. Заполните верхнюю камеру аппарата проточным буфером с триглицином SDS выше уровня лунок и проверьте наличие утечек.

Нижнюю камеру установки для гель-электрофореза также заполните ходовым буфером. Затем загрузите 10 микролитров белкового молекулярного маркера. Смешайте равное количество образца с гелевым буфером, который не содержит восстановителей.

В отличие от обычной страницы SDS, образцы не кипятят, а вместо этого загружают их непосредственно в лунки геля. Используя гелеобразные насадки, эти лунки могут вмещать до 20 микролитров объема. Закройте мини-ячейку крышкой и подключите электродные шнуры к источнику питания.

Включите источник питания и установите гель на постоянную работу при напряжении 125 вольт в течение 90 минут. Проверьте образование мелких пузырьков на проволоке нижней камеры, указывающих на циркуляцию тока при прохождении в первом геле. Отслеживайте ход миграции каждые 15 минут, используя в качестве индикатора для каждого геля бромфеноловый синий, входящий в состав буфера загрузки.

Приготовьте 100 миллилитров одноразового xmo грамма буфера Rena и 200 миллилитров xmo грамма проявочного буфера, оба в деионизированной воде. Когда бромфеноловый синий краситель для слежения достигнет дна геля, выключите источник питания. Откройте мини-ячейку и удалите гель.

Разделите две стороны кассеты. С помощью гелевого ножа отрежьте уголок, чтобы отметить направление геля. Осторожно извлеките гель из кассеты и поместите его в емкость со 100 миллилитрами Rena Buffer.

Выдержите гель в течение 30 минут При комнатной температуре с нежной растительностью удалите буфер Рены и добавьте в гель 100 миллилитров развивающего буфера. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре с нежной растительностью. Затем удалите проявочный буфер и добавьте в гель еще 100 миллилитров свежего проявляющего буфера.

Инкубируйте гель в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. После ночной инкубации удалите развивающийся буфер и промойте гель, инкубировав его деионизированной водой и нежной растительностью. В течение пяти минут при комнатной температуре повторите эту стирку два раза.

Поместите гель на защитный слой из пластикового листа и удалите пузырьки. Затем отсканируйте гель с помощью фотосканера, чтобы сохранить точное расположение стандартных полос белка, так как они станут едва заметными. После окрашивания гелем.

Испачкайте гель, добавив в гель 20 миллилитров просто синего безопасного морилки. Выдержите гель в течение одного часа при комнатной температуре. При легком перемешивании удалите просто синее безопасное пятно и задержите гель в 100 миллилитрах деионизированной воды при комнатной температуре при слабом перемешивании.

Через час замените гелем свежей деионизированной водой и продолжайте инкубировать гель не менее одного часа. Чтобы проанализировать данные с помощью цитометрии, сначала осторожно извлеките гель из воды и поместите его в пластиковый лист протектора. С помощью фотосканера отсканируйте гель с разрешением 300 точек на дюйм или выше.

Сохраните изображение в формате TIFF. Откройте файл TIFF в Image J или аналогичном программном обеспечении для количественного анализа, чтобы измерить интенсивность канала. Визуализируйте изображение в черно-белом цвете, выбрав тип изображения восьми бит.

Используйте инструмент «Прямоугольное выделение», чтобы обвести первую полосу, нарисовав прямоугольник, который как минимум в два раза больше своей ширины. Выберите гели для анализа. Выберите первую полосу, и будет выбран диапазон.

После этого появится новый прямоугольник. Перемещаем его на следующий бэнд и выбираем Анализировать гели, выбираем следующую полосу. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будут выделены все полосы.

Выберите Анализ гелевых полос для создания графика профиля для каждого канала. Используйте выделение по прямой линии, чтобы нарисовать базовые линии так, чтобы пик интереса был полностью замкнутой областью. Выберите инструмент «Палочка» и щелкните внутри каждого пика, чтобы выбрать его.

Выберите анализ гелей для обозначения пиков, чтобы получить таблицу с площадью для каждого выбранного пика. Эти данные могут быть нанесены на график как таковые или могут быть нормализованы по значению выбранного канала. Эта нормализация особенно важна при объединении значений из нескольких повторяющихся гелей для определения статистической значимости результатов.

Каждая лунка геля, показанного здесь, была загружена отдельной клеточной культурой. Супинат, содержащий разное количество MMP два. Прямое наблюдение за этим гелем показывает очевидные различия в двух концентрациях ММП между некоторыми скважинами.

Например, очевидно, что обе скважины 4 и 5 содержат гораздо больше MMP 2, чем скважины 10 и 11 для объективной количественной оценки полос. Плотная цитометрия использовалась с программным обеспечением Image J. Это программное обеспечение выявило примерно четырехкратную разницу в mmp.

Две суммы между, ну, 11 и скважинами четыре и пять. Аналогичным образом, двукратная разница в количестве MMP two наблюдалась между скважинами 10 и скважинами 4 и 5. Мы просто показываем вам, как определять функциональные метрики.

Металлический персис от xog. Когда вы делаете эту процедуру, важно помнить, что образец нельзя кипятить. В противном случае вы не сможете увидеть никаких полос на геле.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.