RNA干扰在蜱

该程序的总体目标是展示通过注射对蜱虫进行 RNA 干扰的技术。这是通过首先合成目标基因的双链 RNA 来实现的。然后将 RNA 注射到蜱虫中，然后将它们在湿度室中保存 24 小时。

在此保持期之后，允许蜱虫以动物为食，例如绵羊最终蜱虫。通过实时 R-T-P-C-R 测定喂养参数，例如体重、蜕皮和卵子位置，以及目标基因或目标基因的表达。最终，通过实时 R-T-P-C-R 评估蜱生物参数和基因表达，可以获得证明沉默靶基因对蜱生物学影响的结果。

我们小组与蜱虫合作，试图表征蜱病原体界面的分子事件，以利用这些基本信息来开发控制蜱虫侵扰和病原体向人类和动物传播的方法。RNA 干扰已成为这项研究中的重要工具，因为它是蜱虫基因作的唯一可用方法。许多蜱基因的功能尚不清楚。

RNA 干扰使我们能够定义蜱基因和基因表达在蜱生物学的许多方面的作用，包括交配、繁殖、摄食、消化、唾液腺功能以及蜱媒介传播病原体的能力。演示该程序的是我们实验室的蜱 RNA 干扰团队、研究生 Ed Lewin 博士以及 Busby 和我自己。为了生成双链 RNA，首先合成含有 T 7 启动子序列的寡核苷酸引物，用于 RNA 的体外转录。

例如，derma center vari lesin。使用此处所示的寡核苷酸引物 D 8 A a T 75 和 D 8 DVT 73。使用 10 皮摩尔的每种寡核苷酸引物和 1 至 10 ng的蜱总 RNA，通过 R-T-P-C-R 扩增靶基因。

接下来，纯化 PCR 产物。然后使用 8 μL 或大约 100 ng 合成双链 RNA。要首先准备注射用蜱虫，请在以下系列溶液中清洗蜱虫，自来水 3% 过氧化氢蒸馏水两次，70% 乙醇，最后用蒸馏水洗涤两次。

在 50 毫升一次性离心管中通过摇动进行每次洗涤。然后通过细网丝网倾析溶液。在纸巾上将蜱虫块干，然后根据实验将蜱虫分成 20 到 50 只一组。

将每组放入一个 1.25 盎司的塑料杯中，并盖上紧密的盖子，并在每个杯子上贴上实验组的标签。接下来，组建一个由三人组成的 RNAi 团队，他们将执行注射过程。第一个人将每个蜱虫放在贴在 3 x 6 英寸的红色牙蜡上的双胶带上。

第二个人注射蜱虫，第三个人监测注射后的蜱虫，在蜱虫身上呼吸二氧化碳以激活它们，并将活的蜱虫计数并转移到标有实验组号的杯子中。所有团队成员必须佩戴一次性手套 要开始蜱虫注射过程，请使用 dumont 细镊子捕捉蜱虫，并将其腹侧朝上放在贴在红色牙蜡片上的双胶带上 将蜱虫紧密定位为五组。在所有五个蜱虫的口器上贴一小条遮蔽胶带。

为了进一步抑制它们，让身体的大部分暴露在外，以便蜱虫注射器可以观察到注射过程。要注射蜱虫，请使用装有 29 号半英寸针头的单喷射胰岛素注射器在外骨骼腹面的右下象限刺穿一个孔。接下来，立即使用定制的 Hamilton 注射器和 33 号斜面点的 1 英寸 1 英寸针头向蜱虫注射 0.2 至 0.5 微升双链 RNA 溶液，将针头放入蜱腔中，以确保双链 RNA 的放置和保留。

即使注射后释放出液体，将注射针头深处放置将确保足够的双链 RNA 沉积到蜱腔中，从而导致基因沉默，应注意不要过度吸收。注射蜱虫，这会导致血淋巴液流失和蜱虫死亡。注射蜱虫后，立即用细镊子从双层胶带上捡起它们，并将它们放入塑料回收容器中。

注射后，蜱虫会短暂保持不活动状态，但很快就会开始在培养皿周围爬行。通过将二氧化碳吸入蜱虫来激活它们。一旦蜱虫爬行并活跃起来，注射伤口就会迅速愈合，它们很可能会存活下来。

计算每个实验组中的蜱虫，并将每个组放入带有盖紧盖子的标记塑料杯中。在注入下一个实验组之前，替换当前组中死亡的任何刻度。在注射下一个实验组之前，通过用新鲜的 3% 过氧化氢填充然后排出注射器来清洁 Hamilton 注射器。

15 次，然后用无菌水洗涤 15 次。注意不要弯曲 Hamilton 注射器的柱塞，否则柱塞将无法平稳移动，也无法响应蜱虫注射所需的轻柔触摸。注射后，将蜱虫放入装有水和硫酸钾容器的腔室中，保持高湿度和一天。

接下来，将单个蜱虫放入粘在绵羊身上的蜱虫喂食室中，并让它们用相同数量的注射 unin 的雄性或雌性蜱虫喂养，以未注射的性别为准。在雌性蜱虫完成摄食约 10 天后，或者当对照雌性蜱虫下食后，宿主在湿度室中孵育每组蜱虫，直到卵位置完成。通过称量一组中所有蜱虫产生的卵质量来评估喂食后的蜱表型，从而按组评估卵的位置。

确定存活下来的蜱虫数量并计算蜱虫重量以及卵子位置和卵的生育能力。根据研究的目标基因和目标，可以进行其他分析以确认 R-T-P-C-R 的基因沉默。喂食后，从对照注射组和双链 RNA 注射组中解剖单个蜱虫的唾液腺和肠道，然后从单个组织样本中提取总 RNA。

通过实时 R-T-P-C-R 分析单个组织中的靶基因转录物，并针对蜱 16 s 核糖体 RNA 使 RNA 水平正常化。使用基因常模方法，在反应结束时运行解离曲线，以确保仅形成一个扩增子，并且每个样品的扩增子在相同的温度范围内一致变性，比较对照注射和双链之间 mRNA 水平的标准化 CT 值。使用学生的 T 检验注射 RNA 的蜱虫。

此处描述的方案已在我们的实验室中用于许多不同外泌蜱物种的 RNAi。注射到蜱虫中的双链 RNA 的量随蜱虫的大小而变化。较大的蜱虫种类可以容纳更大的体积。

参考文献可以在协议随附的书面部分找到。如果方案正确完成，则 24 小时后注射程序的死亡率应低于 5%。此处显示了蜱虫基因敲低后的典型表型，其中一组蜱虫注射了用于筛选蜱保护性抗原的双链 RNA 池。

在通过光学显微镜检查的蜱虫中，可能会观察到蜱组织中的细胞变性。表型变化也可能伴有功能丧失。例如，SUBIN 的 RNAI 导致不育雄性在 RNA 干扰和蜱虫之后无法与雌性成功交配。

其他方法可用于确定基因沉默对基因和蛋白质表达以及蜱生物学的影响，包括实时 R-T-P-C-R、光电子或共聚焦显微镜。基因组学或蛋白质组学。RNA 干扰也可以在蜱细胞培养物中进行，并为研究蜱细胞病原体相互作用提供了一种体外方法。