Name: RNA干扰在蜱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习通过注射双链RNA在蜱虫中进行RNA干扰的技术，用于研究蜱虫生物学和基因功能。该方法有助于探索蜱虫基因表达及其在病原体传播中的作用。

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我们感谢实验室成员的有益讨论和技术支持。本视频演示得到了俄克拉荷马州立大学兽医健康科学中心兽医病理生物学系及研究副院长办公室的支持。本研究由西班牙科学与创新部（项目编号 BFU2008-01244/BMC）、西班牙高等科学研究理事会（CSIC）内部项目 PA1002451（JF 负责）、Walter R. Sitlington 食品动物研究讲席（KMK 负责）、CVHS 2009 年 RAC 基金、俄克拉荷马州农业实验站动物健康基金以及美国农业部国家研究计划竞争性基金（编号 2007-04613）资助。

1. 生成双链RNA。
<ol>
<li>合成含有T7启动子序列的寡核苷酸引物 体外 转录与dsRNA的合成（例如，用于 Dermacentor variabilis subolesin 使用寡核苷酸引物 D8AAT75： 
5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3' 和 D8DVT73：5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'）</li>
<li>使用10 pmol的每种寡核苷酸引物和1-10 ng蜱总RNA，通过RT-PCR扩增目标基因。</li>
<li>纯化PCR产物。</li>
<li>使用以下方法合成dsRNA 8 μL 纯化后的PCR产物</li>
<li>通过分光光度法定量dsRNA。</li>
</ol>
2. 用dsRNA注射蜱虫。
2.1. 注射用蜱虫的准备。
<ol>
<li>首先，将蜱虫置于一系列溶液中进行清洗：将蜱虫放入50 mL一次性离心管中，振荡混匀，然后通过覆盖在管口的细孔金属筛网倾倒溶液，以保留蜱虫。清洗蜱虫的溶液顺序为自来水、3%过氧化氢、两次蒸馏水洗涤、70%乙醇，再用蒸馏水洗涤两次。</li>
<li>用纸巾将蜱虫吸干。</li>
<li>根据实验需要，将蜱虫按每组20至50只进行计数，将每组蜱虫放入一个1.25盎司带紧密盖子的塑料杯中，并标记实验组编号。</li>
</ol>
2.2. 蜱虫注射团队。
RNAi 实验团队由三人组成：（1）一人负责将每只蜱虫放置在固定于红色牙科蜡片上的双面胶带上，（2）一人负责对蜱虫进行注射，（3）一人负责在注射后监测蜱虫，向蜱虫呼出 CO2 以激活其活动，并将存活的蜱虫计数后放入标有实验组编号的容器中。所有团队成员均须佩戴一次性手套。
2.3. 注射用蜱虫的放置。
<ol>
<li>使用 Dumont 精细镊子捕捉一只蜱虫，并将其腹面朝上放置在固定于 3 英寸 × 6 英寸红色牙科蜡片上的双面胶带上。将 5 只蜱虫紧密地成组放置。</li>
<li>用一小条遮蔽胶带覆盖这 5 只蜱虫的口器部分，以进一步固定它们，同时保持虫体大部分暴露，以便蜱虫注射操作者能够观察注射过程（图 1）。</li>
</ol>
2.4. 蜱虫注射。
<ol>
<li>将在外骨骼腹面右下象限注射蜱虫。</li>
<li>首先使用配有½英寸、29号针头的Monoject胰岛素注射器在外骨骼上刺出一个小孔（图2a）。</li>
<li>立即使用定制的Hamilton注射器（配1英寸、33号针头，尖端呈45°斜面）向蜱虫注射0.2–0.5 μL的dsRNA溶液（每μL含5 × 1010 – 5 × 1011 个分子）（图2b）。应将针头充分插入蜱虫体腔，以确保dsRNA的准确定位和保留。部分液体可能从注射部位溢出（图2c）。注射时应注意避免过量，否则会导致血淋巴流失，可能引起蜱虫死亡。</li>
<li>每完成一个实验组的注射后，需清洁Hamilton注射器，再用于下一个实验组。先从盛有3%过氧化氢的烧杯中吸取液体，然后排入废液容器，重复15次；再从盛有无菌水的烧杯中吸取液体，排入废液容器，同样重复15次。操作时应注意避免弯曲Hamilton注射器的推杆，一旦弯曲，推杆将无法顺畅移动，影响注射蜱虫时所需的轻柔操作。</li>
</ol>
2.5. 注射后蜱虫的处理。
<ol>
<li>用精细镊子立即从双面胶带上拾取已注射的蜱虫，并将其放入塑料回收容器中（约6英寸×6英寸，容器边缘贴有遮蔽胶带以防止蜱虫逃逸）。蜱虫在注射后会短暂地不活跃，但很快应开始在容器内爬行。</li>
<li>呼出气一氧化碳2 将蜱虫放入恢复容器后，立即施加刺激以帮助激活蜱虫。一旦蜱虫开始爬行并恢复活动，注射造成的伤口将迅速愈合，其存活概率显著提高。</li>
<li>根据实验分组数量统计蜱虫，并将其放入带有紧密盖子的标记塑料杯中。在注射下一实验组之前，应注射备用蜱虫以替换任何已死亡的蜱虫。</li>
</ol>
2.6. 蜱虫的保存。
<ol>
<li>将蜱虫置于湿度培养箱中（12小时光照：12小时黑暗光周期，温度22–25°C，相对湿度95%），保持1天。</li>
<li>将蜱虫放入蜱虫饲喂装置中，每个实验组一只，将其粘附于绵羊体表，并让其与等量未注射的雄性或雌性蜱虫（选择未注射的性别）共同吸血。收集吸血至饱血的雌性蜱虫，或在饲喂10天后、或当对照组雌性蜱虫自然脱离宿主时将其从绵羊身上取下，并进行称重。</li>
<li>将蜱虫放入纸盒中，继续置于湿度培养箱内直至产卵完成。通过称量该组所有蜱虫所产卵块的总质量来评估产卵情况。</li>
</ol>
2.7. RNAi后蜱表型的分析。
<ol>
<li>通过测定饱血后存活的蜱虫数量、蜱虫体重、产卵情况及卵的孵化率，评估蜱虫的表型。然而，根据靶向基因及研究目的的不同，也可进行其他分析。</li>
</ol>
3. 通过RT-PCR分析验证基因沉默效果。
<ol>
<li>在取食后，从对照组注射和dsRNA注射组的个体蜱虫中解剖分离唾液腺和肠道。</li>
<li>从各个组织样本中提取总RNA。</li>
<li>通过实时RT-PCR分析各组织中靶基因的转录水平，并使用genNorm方法（Bio-Rad iQ5标准版2.0版本中实现的ddCT方法）以蜱虫16S rRNA为内参对RNA水平进行归一化。</li>
<li>在反应结束后运行解离曲线，以确保仅形成单一扩增产物，并且每个样本的扩增产物均在相同的温度范围内一致解链。</li>
<li>使用Student's t检验（P=0.05）比较对照组注射与dsRNA注射蜱虫之间的mRNA水平（归一化的Ct值）。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
本文所述方案已在我们的实验室中用于多种硬蜱科蜱类的RNA干扰实验（表1）。注射到蜱体内的dsRNA量需根据蜱的大小进行调整；体型较大的蜱种可容纳更大的注射体积。阴性对照组蜱应注射无关的dsRNA。可使用多种dsRNA作为阳性对照，例如subolesin14-19,22-25,27-32,34和beta-actin20,21。请注意，在不同处理之间必须清洗注射器，以避免dsRNA溶液交叉污染。若操作正确，注射后24小时内蜱的死亡率应低于5%。图3展示了蜱基因敲低后的典型表型，其中一组蜱被注射了多种dsRNA混合物，用于筛选蜱保护性抗原。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>蜱虫种类</td>
 <td>注射dsRNA</td>
 <td>参考文献</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ixodes scapularis</td>
 <td>cDNA文库，subolesin，肌动蛋白，核苷酸酶，NF-kB，akirin</td>
 <td>21, 22, 29, 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dermacentor variabilis</td>
 <td>亚铁蛋白1，蛋白酶体26S亚基，肌动蛋白，变异性蛋白，亚铁蛋白1，硒蛋白M和W2a，造血干细胞/祖细胞样蛋白，vATP酶，泛素，GST，亚基蛋白 </td>
 <td>15, 19, 22, 24, 26, 30-32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dermacentor marginatus</td>
 <td>subolesin</td>
 <td>22</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amblyomma americanum</td>
 <td>cDNA文库，subolesin，akirin</td>
 <td>17, 22, 30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amblyomma hebraeum</td>
 <td>subolesin，voraxin</td>
 <td>28</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rhipicephalus sanguineus</td>
 <td>Rs86，亚基蛋白</td>
 <td>22, 23</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>微小牛蜱</td>
 <td>GST、泛素、硒蛋白、Bm86、Bm91、subolesin、GI、GIII、EF1a、鞭状丝蛋白、von Willebrand因子 
 因子 </td>
 <td>16, 18, 25, 27</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rhipicephalus annulatus</td>
 <td>泛素，subolesin，EF1a，GIII</td>
 <td>16</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1.已应用RNAi实验方案的蜱虫物种。
 <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="蜱虫在皮肤上吸血，特写图像，寄生虫学研究，吸血行为分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 将蜱虫腹面朝上放置于粘附在红色牙科蜡片上的双面胶带上。每5只蜱虫为一组放置，随后在口器部位覆盖一小条医用胶带，以进一步固定蜱虫，同时便于注射时观察蜱虫体部。
 <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="蜱虫移除过程示意图，显示使用镊子安全取出的各个步骤。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 注射操作包括：(a) 使用装有29号针头的胰岛素注射器刺入蜱虫外骨骼的右下象限，以创建注射位点；(b) 在该位点立即使用配有33号针头的汉密尔顿注射器注入dsRNA；(c) 此过程很可能导致部分蜱虫血淋巴/体液外泄。
 <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="在动物皮肤上进行蜱虫感染治疗测试，包含评估subolesin有效性的阴性对照和阳性对照。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 采用RNA干扰技术筛选美洲钝眼蜱（Amblyomma americanum）保护性抗原的六组蜱虫实验面板。通过与阳性对照（subolesin RNAi）和阴性对照（无关dsRNA）比较，可观察到蜱虫的表型变化。本实验对各组RNA干扰在蜱虫死亡率、体重及产卵量方面的影响进行了统计学分析。

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<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li>
<li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

尽管已有其他方法用于蜱虫的RNA干扰（RNAi）14, 33，但本文所述的双链RNA（dsRNA）注射方法在未吸血（表1）和已吸血蜱虫中应用最为广泛16,25,34。研究表明，RNAi是研究蜱虫基因功能、蜱虫-病原体相互作用界面特征以及蜱源保护性抗原的筛选与鉴定的有力工具14,35。特别是，RNAi已成为蜱虫功能分析中最有效的技术手段35。
从方法学角度来看，RNAi 将可能发展出更为高效的技术，从而实现在大量个体中进行基因敲低。应进一步优化dsRNA诱导的蜱虫RNAi机制，以促进对该物种中这一遗传学方法的深入理解与应用35,36。RNAi在蜱虫中可能产生的脱靶效应程度，也是一个亟待全面解决的重要问题14,27。最终，RNAi 很可能将为研究蜱虫的基因调控、系统生物学以及蜱-病原体相互作用提供全面的贡献，并可能对防控蜱虫侵染及蜱传病原体传播的疫苗研发产生重要影响。

<table><tbody><tr><td>Access RT-PCR 系统</td><td>Promega</td><td>A1250</td><td></td></tr><tr><td>Purelink PCR 纯化试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-02</td><td></td></tr><tr><td>Megascript RNAi 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1626M</td><td></td></tr><tr><td>红色牙科蜡</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72674</td><td></td></tr><tr><td>塑料杯，1.25 盎司及杯盖</td><td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>各种规格</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Monoject</td><td></td><td>配备 &amp;#189;&quot;、29 号针头</td></tr><tr><td>Hamilton 注射器</td><td>Hamilton</td><td>701SN,33/.375&amp;#8221;/45DGR</td><td>定制</td></tr><tr><td>TriReagent</td><td>Sigma</td><td>93289</td><td></td></tr><tr><td>iScript One-Step RT-PCR 试剂盒（含 SYBR Green）</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8892</td><td></td></tr><tr><td>实时 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>多种型号</td><td>请参见 &lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

蜱虫中的rna干扰

RNA Interference in Ticks

蜱是野生和家养动物及人类体表专性吸血的外寄生虫，被认为是全球范围内仅次于蚊子的人类疾病传播媒介1，也是影响全球畜牧业最重要的传播媒介2。蜱分类上属于蛛形纲蜱螨亚纲、寄螨目、硬蜱亚目，全球分布，从北极地区至热带地区均有发现3。尽管已采取多种措施控制蜱的侵扰，这些外寄生虫仍对人类和动物健康构成严重威胁4,5。
RNA干扰（RNAi）6是一种基于核酸的反向遗传学方法，通过干扰基因表达来确定基因功能或其对代谢通路的影响。小干扰RNA（siRNA）是RNAi通路中的效应分子，该通路由双链RNA（dsRNA）启动，导致细胞质中与dsRNA触发序列相同的mRNA发生强烈且序列特异性的降解7-9。迄今为止研究的所有真核生物中均发现了由dsRNA引发的转录后基因沉默机制，RNAi已迅速发展成为多种生物体中用于功能基因组学研究及其他应用的重要工具10。
RNAi 已成为在蜱虫及其他缺乏或无法可靠实施基因操作替代方法的生物体中使用最广泛的基因沉默技术5,11。直到最近应用 RNAi 技术之前，对蜱虫的遗传学表征一直十分有限12,13。在 RNAi 技术可用后的短时间内，它已被证明是研究蜱虫基因功能、蜱虫-病原体相互作用界面以及蜱源保护性抗原的筛选与表征的有力工具14。本文描述了一种通过向未吸血蜱虫注射 dsRNA 实现 RNAi 的方法。通过该实验方法所获得的知识，有望显著促进人们对基础生物系统的理解，并推动用于控制蜱虫侵染及阻断蜱传病原体传播的疫苗的研发15-19。

介绍了一种通过向未进食蜱虫注射双链RNA（dsRNA）进行RNA干扰（RNAi）的方法。RNAi是蜱虫中最常用的基因沉默技术，因为在蜱虫中其他遗传操作方法的应用受到限制。

蜱虫中的RNA干扰

蜱虫是野生和家养动物以及人类体表专性吸血的外寄生虫，作为病原体传播媒介，其重要性在全球范围内仅次于蚊子……

本实验的总体目标是通过注射法展示在蜱虫中进行RNA干扰的技术。首先合成目的基因的双链RNA，然后将RNA注射入蜱虫体内，随后将蜱虫置于湿度培养箱中孵育24小时。经过这一静置期后，将蜱虫置于动物（如绵羊）身上使其最终完成吸血。通过实时荧光定量逆转录 PCR 检测吸血相关参数，包括蜱虫体重、蜕皮情况、卵的发育状态以及目标基因的表达水平。最终，可通过评估蜱虫生物学参数及利用实时荧光定量逆转录 PCR 检测基因表达水平，获得基因沉默对蜱虫生物学功能影响的结果。我们的研究团队致力于蜱虫相关研究，旨在阐明蜱虫与病原体相互作用界面的分子事件，并利用这些基础信息开发控制蜱虫侵染以及病原体向人类和动物传播的方法。RNA干扰技术已成为该研究领域的重要工具，因为这是目前唯一可用于蜱虫基因操作的方法。许多蜱虫基因的功能尚不清楚。RNA干扰技术使我们能够定义蜱虫基因及其表达在蜱虫生物学多个方面的功能，包括交配、繁殖、摄食、消化、唾液腺功能以及蜱虫作为病原体传播媒介的能力。本次实验操作将由本实验室的蜱虫RNA干扰团队进行演示，成员包括Ed Lewin博士、研究生Busby以及本人。首先合成含有T7启动子序列的寡核苷酸引物，用于体外转录生成双链RNA。例如，皮肤中心变异链球菌。使用此处所示的寡核苷酸引物 D eight A a T 75 和 D eight DVT 73。以每种寡核苷酸引物 10 皮摩尔和蜱总 RNA 1 至 10 纳克为模板，通过逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）扩增目标基因。接下来，纯化PCR产物。然后取8微升或约100纳克产物用于合成双链RNA。为准备蜱虫注射，首先将蜱虫按以下顺序依次洗涤：自来水、3%过氧化氢、蒸馏水两次、70%乙醇，最后用蒸馏水再洗涤两次。每次洗涤均在50毫升一次性离心管中通过振荡进行，然后将溶液经细网金属筛过滤。将蜱虫在纸巾上静置干燥，根据实验需要，将蜱虫分装为每组20至50只。将每组放入带紧密贴合盖子的1.25盎司塑料杯中，并用实验组名称标记每个杯子。接下来，组建一个由三人组成的RNAi小组，负责执行注射操作。第一人将每只蜱虫固定在粘附于3英寸×6英寸红色牙科蜡片上的双面胶带上。第二名人员注射蜱虫，第三名人员在注射后监测蜱虫，向蜱虫呼出二氧化碳以激活它们，并将存活的蜱虫计数后转移至标有实验组编号的杯子中。所有团队成员都必须佩戴一次性手套。开始蜱虫注射操作时，使用杜蒙特精细镊子捕捉一只蜱虫，将其腹面朝上放置在固定于红色牙科蜡片上的双面胶带上，将蜱虫紧密地按每组五只进行分组。用一小条医用胶带覆盖全部五只蜱虫的口器部分。为了进一步固定蜱虫，应使其大部分身体暴露在外，以便注射者能够观察注射过程。使用装有29号半英寸针头的单孔弹射式胰岛素注射器，在蜱虫外骨骼腹面右下象限刺一个小孔。随后，立即使用自制的哈密尔顿注射器，配合33号一英寸、45度斜面针尖的针头，向蜱虫体内注射0.2至0.5微升的双链RNA溶液。将针头深入蜱虫体腔，以确保双链RNA的准确递送和有效滞留。尽管注射后会有液体释出，但将注射针头深入放置可确保将足量的双链RNA注入蜱虫体腔，从而引发基因沉默。应注意避免过度注射，以免导致蜱虫体液流失及死亡。注射后应立即用精细镊子从双面胶带上拾起蜱虫，并将其放入塑料恢复容器中。注射后，蜱虫会短暂地保持不活跃状态，但很快应开始在培养皿中爬行。通过向蜱虫呼出二氧化碳来激活它们。一旦蜱虫开始爬行并恢复活动，注射造成的伤口将迅速愈合，它们极有可能存活下来。统计每个实验组中的蜱虫数量，并将每组放入带有紧密盖子的标记塑料杯中。在注射下一组实验蜱虫之前，更换当前组中死亡的蜱虫。在注射下一组实验蜱虫之前，用新鲜的3%过氧化氢充满并排出 Hamilton 注射器，以清洁注射器。重复15次，随后用无菌水洗涤15次。操作时注意不要弯曲Hamilton注射器的推杆，否则推杆将无法顺畅移动，并影响对蜱虫注射时所需轻柔操作的响应。注射完成后，将蜱虫置于一个容器中，容器内盛有水和硫酸钾，以维持高湿度环境，培养一天。接下来，将单个蜱虫放入粘附在绵羊上的蜱虫饲喂装置中，并让其与等量未注射的雄性或雌性蜱虫共同吸血，选择未被注射的性别。当雌性蜱虫完成约10天的吸血，或对照组雌性蜱虫已自然脱落时，从饲喂装置中收集并轻轻刷下雌性蜱虫。将每组蜱虫置于湿度培养箱中孵育，直至产卵完成。通过称量每组所有蜱虫所产卵块的总质量，按组评估产卵量，以评价蜱虫吸血后的表型变化。确定存活蜱虫的数量，并计算蜱虫体重、卵的位置以及卵的受精率。根据靶向基因和研究目的，可进行其他分析以通过逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）确认基因沉默效果。饲喂后，分别从对照组注射和双链RNA注射组的蜱虫个体中解剖分离唾液腺和肠道组织，然后从各个组织样本中提取总RNA。通过实时反转录聚合酶链式反应（real-time R-T-P-C-R）分析各组织中目标基因的转录本，并以蜱源16S核糖体RNA作为内参对RNA水平进行归一化。采用基因归一化（gene norm）方法，在反应结束后运行熔解曲线，以确保仅形成单一扩增产物，且所有样本的扩增产物均在一致的温度范围内发生变性。利用学生t检验（student's T-test）比较对照组注射与双链RNA注射蜱之间mRNA水平的归一化CT值。本文所述方案已在我们的实验室用于多种外寄生蜱类的RNAi实验。注射到蜱体内的双链RNA量根据蜱的大小而变化。较大的蜱种能够容纳更大的注射体积。参考文献可在该实验方案的配套书面部分中找到。若操作正确，注射程序在24小时后应导致低于5%的死亡率。此处展示的是在蜱虫中进行基因敲低后的典型表型，其中一组蜱虫被注射了双链RNA混合物，用于筛选蜱源保护性抗原。在通过光学显微镜检查的蜱虫中，可观察到蜱虫组织中的细胞退化现象。表型变化可能同时伴随功能丧失。例如，SUBIN 基因的 RNA 干扰（RNAi）会导致雄性蜱虫不育，使其无法与雌性蜱虫成功交配。也可采用其他方法来评估基因沉默对基因和蛋白质表达以及蜱虫生物学的影响，包括实时逆转录聚合酶链式反应（real-time R-T-P-C-R）、光学显微镜、电子显微镜或共聚焦显微镜观察，以及基因组学或蛋白质组学分析。RNA干扰技术也可在蜱虫细胞培养中进行，为研究蜱虫细胞与病原体之间的相互作用提供了一种体外实验方法。

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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蜱虫中的RNA干扰

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