Ixodes scapularis 的蜱人工膜饲喂

尽管人工膜饲喂已有先例，但我们的方案更易于建立，并可通过一些修改适用于其他蜱种。人工膜饲喂的主要优势在于，它能够实现对病原体和处理因素的暴露，而这些在动物饲喂条件下可能难以实现。该人工膜饲喂系统经过适当测试以确定最佳取食刺激剂，并调整最佳膜厚度后，也可应用于其他节肢动物物种。

制备合适厚度的膜需要一些练习。务必使用千分尺在膜的多个位置测量其厚度。我们实验室的博士后 Benjamin Cull 将协助我演示该操作流程。

首先，用70%乙醇擦拭一个平整、无孔的表面（例如玻璃板或臂架的陶瓷涂层金属底座），然后在其上覆盖一层塑料薄膜。确保塑料薄膜平整，无气泡或褶皱。将100%人造丝镜头清洁纸用胶带固定在准备好的表面上。

用胶带将纸张四边固定，确保其平整且略微绷紧。准备0010硬度的硅胶混合物：将硅胶试剂盒的A、B两组分各取5毫升，加入一次性容器中。轻轻混合两种液体，再加入1.5毫升正己烷。

继续搅拌，直至混合物均匀且充分混合。使用小刮刀将硅胶混合物均匀涂布在镜头纸上，并静置一分钟，以确保硅胶充分渗透至镜头纸中。随后，用刮刀施加少量向下的压力，稳定地将多余的硅胶刮至一侧。

使用刮刀进行第二次操作时，不要施加向下的压力，以去除任何硅胶线条并形成光滑的层。仅针对幼虫，将饲喂室顶部多次浸入Fluon氟聚合物树脂中，每次浸涂之间需使其充分干燥，以形成均匀的涂层。将膜置于无尘环境中（例如密闭的化学通风柜或生物安全柜）至少固化24小时。

接下来，将硅胶A和B按等比例混合，制备硬度为30的硅胶混合物，用于将小室固定在膜上。将聚碳酸酯小室约四分之一英寸的部分浸入硅胶混合物中，然后将其放置在膜片上，注意避免与任何胶带重叠。让固定用硅胶至少固化24小时。

使用手术刀，小心地沿每个已固定的培养室周围切割膜，修整边缘，使其能够平滑地放入六孔板的孔中，避免与孔壁发生明显摩擦。保留培养室外部足够的材料，以最大程度地保留膜的完整性。从膜片的每个角和中心位置切下一小块剩余的膜。

取下每块膜上的塑料包裹膜，使用千分尺测量各膜片以确定平均膜厚度。将进样室连同每个室配用的一个O型圈放入玻璃烧杯中，在121摄氏度下高压灭菌至少20分钟以进行灭菌。待进样室冷却后再使用。

取出预先制备并经过高压灭菌的膜室，在其周围放置O型圈，向每个膜室中加入足量70%乙醇以完全覆盖膜表面。将膜室置于六孔板中静置5分钟，随后检查膜室与膜之间以及膜本身是否存在泄漏。倒出膜室中的乙醇，然后在生物安全柜或层流罩内自然晾干。

为了加热并激活血液中的补体，将血液在 56 摄氏度下加热 40 分钟，并向机械去纤维蛋白的牛血中添加每升 2 克的葡萄糖。待膜干燥后，在腔体内部加入约 20 微升的取食刺激剂，并倾斜腔体使液体均匀覆盖表面。当取食刺激剂干燥后，立即用毛刷或镊子将蜱虫加入腔体中。

用封口膜密封顶部，因为水浴的热量可能导致其破裂。然后将每孔或每个腔室的 5 毫升加热并激活的血液加入锥形管中，并置于设定为 36 摄氏度的水浴中。向每 5 毫升血液的管中加入 5 微升 3 毫摩尔 ATP 以及 50 微升 100 倍浓度的青霉素-链霉素-两性霉素 B 储存液，混匀后将 4.5 毫升血液转移至六孔板的一个孔中。

轻轻将小室放入孔中，调节小室上的O形圈高度，使膜位于血液中，但小室侧壁周围的液面不超过小室边缘。然后以一定角度将小室放入血液中，避免血液与膜之间形成气泡。将六孔板的盖子盖在喂养室上方。

将带有小室的六孔板及其盖子放入已准备好的34摄氏度水浴中。向血液管中每孔加入5微升3毫摩尔ATP以及50微升100倍浓度的青霉素-链霉素-两性霉素B储备液，并将4.5毫升血液转移至一个新的六孔板的孔中，操作如前所示。从水浴中取出带有蜱虫小室的六孔板，移除小室并从孔中取出。

用10毫升无菌的1×PBS冲洗小室和膜的外部，以去除血液。使用经高压灭菌的滤纸轻轻吸干膜和小室，除去多余的PBS。如果小室内有大量冷凝水，请在用新鲜的封口膜密封之前，先用经高压灭菌的滤纸吸干湿润部位。

然后将封口膜重新覆盖在小室顶部，将蜱虫小室放入装有新鲜血液的新六孔板中，必要时调整O形圈高度。对板上的每个小室重复上述步骤。

最后，将六孔板的盖子盖在小室上方，并将新的六孔板放回34摄氏度的水浴中。此处展示的是正在吸血但尚未完全饱血的肩突硬蜱若虫的持续取食过程。附着部位周围的黑色或棕色斑点是取食过程中或取食后可收集的霜状物，可用于制备促吸血剂。

可见部分吸血的肩突硬蜱若虫附着在膜上。此处还可观察到吸血后蜕下的幼虫蜕壳。本表列出了蜱虫吸血数量及卵块重量。

幼虫和若虫饱血实验条件下，在血液中除添加本技术所用的补充成分外，还需加入鹿器官匀浆物。此处，成功饱血的定义为：饱血后成功蜕变为下一存活阶段的蜱虫，或成功产卵的饱血雌蜱。在滤纸膜上涂抹硅胶以获得合适厚度需要一定操作经验，因此使用前务必测量膜的厚度。

膜饲法可使蜱接触病原体或抗生素。饲喂后可评估这些物质对蜱生物学特性的影响，如蜕皮成功率、产卵和存活情况。