口腔生物膜的生物化学，结构和转录综合评价分析工具盒介导变形链球菌

在牙齿表面形成的生物膜非常复杂和结构化。微生物群落缠绕在细胞外基质中，面临持续的环境挑战。这里的总体目标是展示分析工具箱的两个特定组件，旨在通过将新型荧光成像技术与用于数据处理和分析的定制软件相结合，考虑口腔生物膜的复杂性，从而促进结构和分子研究。

这是通过首先选择用于生物膜、转录组和结构分析的特定分析来实现的，包括用于同时可视化 EPS 和细菌的新型共聚焦成像方法。该程序的第二步是从生物测定中收集原始数据。第三步是使用特定软件处理原始数据，包括新开发的用于共定位分析的 duo stat。

最后一步是分析过程数据，包括使用微阵列数据挖掘和组织软件微阵列、数据可视化器或 MDV。最终，可以使用我们独特的集成分析工具箱获得结果，显示口腔病原体如何响应复杂饮食改变其转录组和生物膜的结构，宿主微生物相互作用，提供更全面的生物膜分析和数据解释。大家好，我是 Michelle Kuh，是罗切斯特环球医疗中心孔生物学中心的副教授。

今天，我们提出了一个用于生物膜分析的分析工具箱。该工具箱可以帮助回答生物膜研究领域的关键问题，例如生物膜细胞如何构建、与细胞外基质排列以及它们如何在转录组水平上响应复杂的环境挑战。我叫 Jean，她，是 Dr.Ks 实验室的博士后研究员。

今天，我将演示我们工具箱的成像部分。大家好，我是 Aise Klein。我是 Dr.Ks 实验室的研究助理教授。

今天，我将介绍用于显微射线数据分析的 MDV 软件。在此过程中，唾液涂层的羟基食欲盘用作生长生物膜的牙齿表面替代物。首先，在 24 孔板的每个孔中加入 2.8 毫升接种有 S 突变体的培养基，以保护板在糊精缀合的 LOR 6 47 染料中免受光照，直至终浓度为 1 微摩尔，并上下移液数次以将染料混合到培养基中。

接下来，使用无菌镊子浸入水中，在无菌 AB 缓冲液中清洗无菌唾液涂层的羟基磷灰石圆盘两次，以去除任何多余的唾液或未结合的唾液成分。然后将圆盘垂直放入补充染料的培养基中，确保每个圆盘完全浸没。用铝箔覆盖板，并在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳培养箱中孵育 20 小时，以形成生物膜并将共轭纹理掺入细菌细胞产生的外切多糖中。

要首先标记细菌细胞，请准备一个 24 孔板，每孔含 2.8 毫升无菌 milli Q 水。向每个孔中加入 1.5 μL 细胞九染料，使最终浓度为 1 微摩尔，并保护板避光。生物膜形成后，从培养箱浸渍中取出包含圆盘的板。

在 0.89% 氯化钠溶液中洗涤每个光盘。然后将它们转移到含有细胞九染料的新板中。用铝箔盖住板，并在室温下孵育 30 分钟。

细胞染色浸渍后，像以前一样洗涤生物膜和氯化钠。然后使用镊子将生物膜从金属丝中释放到含有氯化钠的培养皿中。用铝箔包裹培养皿。

生物膜现在可以使用激光扫描共聚焦显微镜通过共聚焦显微镜进行可视化。在 5 到 10 个随机选择的位置扫描每个生物膜，并在每个位置生成 Z 系列。要进行 3D 重建，请打开共聚焦图像并使用镜像软件对其进行处理。

使用该程序生成的共聚焦图像的三维渲染 Amira 显示了使用演示程序在冷漠表面上形成的 S 突变体生物膜。细菌细胞和微菌落以绿色可见，并嵌入含有外切多糖的生物膜基质中。红色表示可以生成选定区域的特写视图，这在微观尺度上说明了特定的细菌 EPS 结构关系。

使用 duos stat 程序量化单独的生物膜成分（如细菌和外切多糖）的共定位量。首先，在 MATLAB 版本 5.1 中设置新开发的 duo stat 的路径，并打开包含两个生物膜组件的 Z 系列图像的图像文件夹。接下来，选择两个将要关联和分析的通道。

这两个图像堆栈在所有维度上必须具有相同的像素大小，并且每个堆栈中的图像数量必须相同。设置每个通道的阈值，并按照软件界面中的说明将数据输入数据处理文件进行分析。该图显示了 duo stack 如何定量解释细菌和 DBS 之间的空间关系。

在生物膜中，Duo 堆栈计算细菌和 DPS 从圆盘表面到液相的垂直分布，如细菌的绿线和 EPS 的红线所示。它还计算细菌和 DPS 在整个生物膜厚度上的共定位。如黄线所示，数据显示在整个生物膜深度中，EPS 的比例高于细菌，并且大多数细菌细胞与 EPS 相关，尤其是从中间层及以上。具有 3D 渲染的 Duo stat 增强了对生物膜中细菌和 DPS 的结构组织和相互作用的理解。

为了确保从生物膜中获得高质量的 RNA，我们建议根据 Curian KU 于 2007 年发表的文章中描述的生物膜特异性方案进行 RNA 提取。在该杂志中，分析生化标准方案用于 CD NA 微阵列制备和定量实时 PCR 检测。为了便于分析微阵列实验生成的大数据集，我们设计了一款数据挖掘和组织软件，即微阵列数据可视化器或 MDV，该软件可在 www.oralgen.anl.gov 在线获取。

在将数据提交给 MDV 之前，使用在线提供的 BRB 数组工具软件进行统计分析，例如具有随机方差模型的配对 T 检验，截止 P 值为 0.001 进行类比较。在这个羊肉的实例分析中，进行了三种不同糖浓度和四个时间点生长的生物膜。对源自三个 BRB 文件的情况进行了配对比较，条件 a 0.5% 蔗糖加 1% 淀粉与 1% 蔗糖条件 B，0.5% 蔗糖加 1% 淀粉与 0.5% 蔗糖和条件 C 0.5% 蔗糖与 1% 蔗糖。

该面板表示使用 BRB 阵列工具通过标准类别比较评估的每个条件和时间点中检测到差异表达的基因数量，这导致大量名为 BRB 原始数据的基因。为了演示 MDV，我们将使用 Excel 专注于 30 小时的时间点。将 BRB 原始数据转换为 MDV 选项卡限制的文本文件。

请务必删除基因位点选项卡号附带的所有字母，例如名称 SMU dot 1432 C.删除字母 C，打开 MDV。打开 file （文件） 菜单，然后选择 select annotation source （选择注释源）。当出现对话框时，选择 平面文件 选项。

使用浏览按钮选择包含基因本体、编号、通路、功能分类数据和基因名称注释的文件。转到文件并导入转换为 MDV 格式的每个文件。每个文件代表一个实验条件。

使用维恩图功能 C.In 本例中比较每个实验条件 A 与 B 与 B 中表达的基因。在本演示中，我们专注于与蔗糖和淀粉组合的影响唯一相关的差异表达基因。基于维恩图的功能用于可视化在这些不同条件下表达的独特和共享基因的数量，并帮助我们识别那些需要选择进行进一步分析的基因。

在这里，我们只选择在条件 A 和/或 B 中独特的差异表达基因，而不选择在 C 中检测到的基因，如灰色所示，如此处所示。MDV 大大减少了要分析的基因总数，同时过滤掉了实验案例中的非相关基因。从 file 菜单中，选择 export 选项以保存数据。

作为选项卡限制文件，这些文件可以在 Excel 中打开，其中数据输出可以组织并转换为所需的图形显示。Excel 中的数据组织允许以图形方式显示 MDV 输出。该图显示了在生物膜发育的不同阶段受淀粉和蔗糖组合影响的独特功能基因亚群的差异表达概述。

在生物膜发育 30 小时时，对 S 突变体转录组的影响比其他时间点更明显。该输出帮助我们精确识别与我们的工作假设相关的特定功能基因子集，同时考虑到促进基因选择和进一步验证过程的时间效应。按照此程序，还可以执行生化和蛋白质组学方法来回答其他问题，例如生物膜内生物体的特定生理和代谢反应是什么。

这种全面和综合的分析肯定有助于进一步了解生物膜如何在高度动态和复杂的环境室内腔中调节致病性。有关更多详细信息，请查看本视频文章附带的 PDF 文件。