Name: 口腔生物膜的生物化学，结构和转录综合评价分析工具盒介导变形链球菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 了解口腔生物膜的综合分析方法，结合荧光成像技术与定制软件，实现胞外多糖和细菌的同步可视化，并解析变形链球菌转录组变化。该方法为口腔健康研究提供了重要的结构生物学工具。

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作者谨感谢 Gary Xie 博士和 Herbert Lee 在 MDV 开发方面的贡献。我们还感谢 Simone Duarte 博士、Ramiro Murata 博士、Jae-Gyu Jeon 博士、Jacqueline Abranches 博士以及 Stacy Gregoire 女士在工具箱分析组件方面提供的技术和科学支持。本研究部分由美国国立牙科与颅面研究所（National Institute of Dental and Craniofacial Research）提供的 USPHS 研究基金 DE018023 资助。

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<li>Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharides+produced+by+Streptococcus+mutans+glucosyltransferases+modulate+the+establishment+of+microcolonies+within+multispecies+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms.</a> J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).</li>
<li>Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+naturally+occurring+agents+in+combination+with+fluoride+on+gene+expression+and+structural+organization+of+Streptococcus+mutans+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms.</a> BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).</li>
<li>Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Streptococcus+mutans+transcriptome+in+response+to+starch+and+sucrose+during+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development.</a> PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).</li>
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<li>Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Streptococcus+mutans+biofilm+accumulation+and+polysaccharide+production+by+apigenin+and+tt-farnesol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol.</a> J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).</li>
<li>Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+apigenin+on+gtf+gene+expression+in+Streptococcus+mutans+UA159%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).</li>
<li>Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+basis+of+the+role+of+starch+and+sucrose+in+Streptococcus+mutans+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).</li>
<li>Cury, J. A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+purification+of+total+RNA+from+Streptococcus+mutans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms.</a> Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).</li>
<li>Xiao, J., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+and+dynamics+of+exopolysaccharide+matrix+and+microcolonies+formation+by+Streptococcus+mutans+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms.</a> J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).</li>
<li>Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+of+macromolecules+within+an+in+vitro+model+of+supragingival+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque.</a> Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).</li>
<li>Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r, Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li>
<li>Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >, Crielaard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+metabolic+activity+indicator+in+Streptococcus+mutans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms.</a> J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

在本研究中，我们展示了分析工具箱（EPS/细菌成像与微阵列数据挖掘/处理）的两个关键组成部分，以及该系统所整合的多种检测方法的多功能性与实用性。显然，该工具箱有助于在不同实验条件下，对生物膜的生化特性、结构特征和基因表达等多个方面进行综合（比较性）和同步分析，所采用的方法基于一种 体外 模型7 考虑到结构组织、生理反应和转录组响应的动态而复杂的变化， S. mutans （以及其他病原体）在生物膜中的作用，整合性分析有助于进一步理解生物膜如何调节口腔内的致病性。我们目前正在将物种特异性标记以及宏基因组学/宏蛋白质组学分析整合到分析工具箱中，这将增强我们深入研究多物种生物膜模型中复杂生态相互作用和结构变化的能力。5
此外，该工具（以及所有生物测定方法）具有灵活性，可通过附加组件（如宏蛋白质组和硬表面分析；正在进行中）进行升级，并可针对口腔生物膜研究以外的应用进行调整或修改。例如，MDV 可能对其他使用全基因组分析以比较多种实验条件的生物膜相关领域特别有帮助，例如不同（突变）菌株之间的比较转录组分析，或...

<table><tbody><tr><td>Syto 9</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Syto 60</td><td>Invitrogen</td><td>S11342</td><td></td></tr><tr><td>与Alexa 647偶联的葡聚糖</td><td>Invitrogen</td><td>D22914</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1000双光子激光扫描显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于全面分析由变异链球菌介导的口腔生物膜的生化、结构及转录组学评估工具箱

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

生物膜是由微生物细胞构成的高度动态、有序且结构化的群落，这些细胞被包裹在密度和成分各异的胞外基质中1, 2。通常情况下，生物膜的形成始于微生物在表面的初始附着，随后形成细胞簇（或称微菌落），并进一步发展和稳定，这一过程发生在复杂的胞外基质环境中。大多数生物膜基质中含有胞外多糖（EPS），口腔生物膜也不例外；尤其是与龋病相关的生物膜，主要由变异链球菌介导3。这些EPS由微生物（如关键贡献者S. mutans）通过胞外酶合成，例如以蔗糖为主要底物的葡萄糖基转移酶3。
由于牙齿表面形成的生物膜持续暴露于口腔内复杂的饮食-宿主-微生物相互作用所带来的环境挑战中，对其开展研究尤为困难。深入理解生物膜基质的结构组织与成分、细胞生理学以及转录组/蛋白质组特征在应对这些复杂相互作用时发生的动态变化，将有助于进一步推动当前关于口腔生物膜如何调控致病性的认知。因此，我们开发了一套分析工具箱，通过结合常用和新型技术以及自主开发的数据分析软件，从结构、生化和分子水平上促进生物膜的分析。我们将标准分析方法（比色法检测、实时定量PCR和微阵列）与新型荧光技术（用于同时标记细菌和胞外多糖）相结合，并配套特定的数据分析软件，以应对口腔生物膜研究的复杂性。
该工具箱包含四个不同但相互关联的步骤（图1）：1）生物测定，2）原始数据输入，3）数据处理，以及4）数据分析。我们采用体外（in vitro）生物膜模型和特定实验条件，以展示该工具箱的实用性与灵活性。该生物膜模型简单、可重复，并可在同一实验中同时进行多个重复4, 5。此外，该模型支持时间序列评估、多种微生物物种的共培养5，以及不同实验条件的影响分析（例如处理干预6；敲除突变株与亲本菌株的比较5；碳水化合物的可利用性7）。本文中，我们介绍工具箱的两个具体组成部分：（i）用于微阵列数据挖掘/整理（MDV）和荧光成像分析（DUOSTAT）的新软件，以及（ii）原位（in situ）胞外多糖（EPS）标记技术。同时，我们提供一个实验案例，展示该工具箱如何辅助生物膜的分析、数据的组织、整合与解释。

在牙面形成的生物膜具有高度复杂性，并持续暴露于各种内在和外源性的环境挑战中，这些挑战会调控其结构、生理状态及转录组。我们开发了一套工具箱，用于研究口腔生物膜的组成、结构组织及基因表达，该工具箱亦可适用于其他生物膜研究领域。

生物膜是由微生物细胞构成的高度动态、有序且具有结构的群落，这些细胞嵌入在密度各异的胞外基质中，……

牙齿表面形成的生物膜具有高度复杂性和特定结构。这些微生物群落嵌入在细胞外基质中，持续暴露于各种环境挑战之下。本研究的总体目标是展示一种分析工具箱中的两个特定组成部分，该工具箱旨在通过结合一种新型荧光成像技术与定制的数据处理和分析软件，促进针对口腔生物膜复杂特性的结构与分子研究。首先选择特定的生物膜、转录组和结构分析实验方法，包括一种新的共聚焦成像方法，用于同时可视化胞外聚合物（EPS）和细菌，以此实现上述目标。该实验流程的第二步是从生物测定中收集原始数据。第三步是使用特定软件处理原始数据，其中包括新开发的用于共定位分析的 duo stat 软件。最后一步是分析过程数据，包括使用微阵列数据挖掘与组织软件——微阵列数据可视化工具（Microarray Data Visualizer，MDV）。最终可以获得结果，展示口腔病原体在复杂饮食和宿主-微生物相互作用条件下，如何改变其转录组以及生物膜的结构。借助我们独特整合的分析工具箱，可实现更全面的生物膜分析与数据解读。大家好，我叫Michelle Kuh，是罗切斯特大学医学中心口腔生物学中心的副教授。今天，我们介绍一个用于生物膜分析的分析工具箱。该工具箱有助于回答生物膜研究领域中的关键问题，例如生物膜细胞的结构、其与胞外基质的排列方式，以及它们在转录组水平上如何响应复杂的环境挑战。我叫Jean，女性，是K博士实验室的一名博士后研究员。今天我将演示我们工具箱中的成像部分。大家好，我是Aise Klein，Ks博士实验室的研究助理教授。今天，我将介绍用于微射线数据分析的MDV软件。在此实验流程中，使用涂有唾液的羟基磷灰石圆片作为牙齿表面的替代物，并在其上培养生物膜。首先，在24孔板的每个孔中加入2.8毫升接种了变形链球菌（S. mutants）的培养基，同时避光操作；然后向每孔加入终浓度为1 µM的右旋糖酐偶联LOR 647染料，并用移液器反复吹打数次，以充分混匀染料与培养基。接下来，使用无菌镊子夹取无菌的唾液涂层羟基磷灰石圆盘，将其在无菌AB缓冲液中浸洗两次，以去除多余的唾液或未结合的唾液成分。然后将圆盘垂直放入含有染料的培养基中，确保每个圆盘完全浸没。用铝箔纸包裹培养板，在37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育20小时，以使生物膜形成，并使偶联染料整合到细菌细胞产生的胞外多糖中。首先标记细菌细胞，准备一个24孔板，每孔加入2.8毫升无菌milli Q水。向每孔加入1.5微升胞嘧啶染料，使其终浓度为1微摩尔，并避光保护。生物膜形成后，从培养箱中取出含有圆片的培养板，进行后续操作。用0.89%氯化钠溶液洗涤每个圆片，然后将其转移至含有细胞染料的新培养板中。用铝箔包裹培养板，在室温下孵育30分钟。染色完成后，用镊子将生物膜从金属丝上取下，放入含有氯化钠的培养皿中，洗涤方式与之前相同。然后用铝箔包裹培养皿。生物膜现已准备好通过激光扫描共聚焦显微镜进行可视化观察。在每个生物膜上随机选择5至10个位置进行扫描，并在每个位置生成Z系列图像。为了实现三维重建，使用镜像软件打开共聚焦图像并对其进行处理。使用 Amira 程序生成的共聚焦图像的三维渲染图显示了通过所述方法在惰性表面上形成的 S 突变体生物膜。细菌细胞和微菌落以绿色显示，嵌入含有胞外多糖的生物膜基质中。以红色显示的是所选区域的放大视图，展示了微生物尺度下细菌与其胞外多糖（EPS）结构之间的特定空间关系。使用 duos stat 程序量化不同生物膜组分（如细菌与胞外多糖）之间的共定位程度。首先，在 MATLAB 5.1 版本中设置新开发的 duos stat 程序的路径，并打开包含两种生物膜组分 Z 系列图像的图像文件夹。接着，选择两个将进行关联分析的通道。两个图像堆栈在所有维度上的像素大小必须相同，且每个堆栈中的图像数量必须一致。为每个通道设置阈值，并按照软件界面中的说明操作，将数据输入数据处理文件进行分析。该图展示了双堆栈如何定量解析细菌与DBS之间的空间关系。在生物膜中，Duo stack 可计算细菌和胞外聚合物（DPS）从圆盘表面到流体相的垂直分布，如图中绿色线条代表细菌、红色线条代表 DPS 的分布情况。它还可计算细菌与 DPS 在生物膜厚度方向上的共定位情况。如黄色线条所示，数据显示在整个生物膜深度范围内，DPS 的比例高于细菌，且大部分细菌细胞与 DPS 相关联，尤其在中层及以上区域更为明显。Duo stat 结合三维渲染，有助于更深入理解生物膜中细菌与 DPS 的结构组织及其相互作用。为了确保从生物膜中获得高质量的RNA，我们建议按照Curian KU于2007年发表的文章中所述的生物膜特异性方案进行RNA提取。在该期刊中，cDNA微阵列制备和定量实时PCR检测采用的是分析生物化学的标准操作流程。为了便于分析微阵列实验产生的大量数据，我们开发了一款数据挖掘与组织软件——微阵列数据可视化工具（Microarray Data Visualizer，MDV），该软件可在www.oralgen.anl.gov在线获取。在将数据提交至MDV之前，使用在线提供的BRB阵列工具软件进行统计分析，例如采用随机方差模型的配对T检验，分类比较的P值阈值设定为0.001。在本示例中，分析了在三种不同糖浓度和四个时间点下生长的变形链球菌生物膜。进行了配对比较，生成三个BRB文件：条件A为0.5%蔗糖加1%淀粉对比1%蔗糖，条件B为0.5%蔗糖加1%淀粉对比0.5%蔗糖，条件C为0.5%蔗糖对比1%蔗糖。该图示表示使用 BRB 芯片工具通过标准分类比较方法，在各个条件和时间点检测到的差异表达基因数量，由此得到大量基因，称为 BRB 原始数据。为了演示 MDV 的使用，我们将重点分析 30 小时时间点的数据，并使用 Excel 将 BRB 原始数据转换为以制表符分隔的 MDV 文本文件。务必删除基因位点标签编号后所附的所有字母，例如在名称 SMU dot 1432 C 中，删除字母 C，然后打开 MDV。打开文件菜单，选择“选择注释来源”。当对话框出现时，选择“平坦文件”（flat file）选项。使用浏览按钮选择包含基因本体编号、通路功能分类数据和基因名称注释信息的文件。进入文件菜单，导入每个已转换为 MDV 格式的文件。每个文件代表一种实验条件。比较实验条件A、B和C中表达的基因。在本示例中，使用维恩图功能。本次演示重点关注与蔗糖和淀粉联合作用特异性相关的差异表达基因。该基于维恩图的功能可用于可视化不同条件下特有及共有表达基因的数量，有助于我们筛选出适合进一步分析的基因。此处我们仅选择在条件A或条件B中特异性表达的差异表达基因，而不包括在条件C中检测到的基因（如图中灰色所示）。MDV极大地减少了需要分析的基因总数，同时过滤掉了与实验情况无关的基因。从文件菜单中选择导出选项以保存数据。由于这些文件是制表符分隔的文件，因此可以在 Excel 中打开，以便对数据输出进行整理并转换为所需的图形显示形式。在 Excel 中对数据进行组织后，可实现 MDV 输出结果的图形化展示。该图展示了在生物膜发育的不同阶段，淀粉与蔗糖组合处理影响下的独特功能基因亚群差异表达的总体情况。在生物膜发育30小时时，S突变体转录组受到的影响比其他时间点更为显著。该结果帮助我们精确定位了与研究假设相关的特定功能基因子集，同时考虑了时间效应，从而促进了基因筛选及后续验证过程。通过这一流程，还可开展生化与蛋白质组学方法，以回答其他问题，例如生物膜内生物体的特定生理与代谢响应是什么。这种全面且综合的分析将有助于进一步理解生物膜如何在室内腔体这一高度动态且复杂的环境中调节致病性。有关更多细节，请查看与此视频文章附带的PDF文件。

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