细胞和生物膜细胞外成分的定量并发
December 10th, 2013
提出了一种用于同时定量和比较生物膜内三种细胞和细胞外成分的方案。该方法涉及使用共聚焦激光扫描显微镜、生物膜结构分析和可视化软件以及统计分析软件。
该程序的总体目标是量化和比较用抗菌剂处理后三种细胞和细胞外生物膜成分的同时三维分布。这是通过首先制造然后抛光树脂复合试样来实现的。在第二步中，在标本上生长感兴趣的生物膜，然后用抗菌剂处理。
接下来，用细胞外聚合物物质、核酸和蛋白质的荧光染料对生物膜进行染色，然后通过共聚焦激光扫描显微镜成像。在最后一步中，重建叠加荧光染料的三维图像，以促进生物膜成分的同步可视化，并从生物膜图像计算结构参数。最终，可以对生物膜结构参数（例如生物体积和平均生物膜厚度）进行统计分析，以比较处理组和对照组之间的差异。
与现有方法相比，该程序的主要优点是它使用不同但相互关联的技术来表征在特定条件下生长的生物膜结构中多种成分的分布，演示该程序将是博士后研究员 Fernando Flores 博士和我实验室的研究助理 Kristen Smart 女士要创建标本，首先将一个增量为 0.4 或 TPH 的三个牙科树脂复合材料放入定制中制作不锈钢模具。接下来，用 LED 光固化装置聚合第一个增量 40 秒。在重复第二个增量的步骤后，使用半自动研磨机抛光机将固化试样抛光至可接受的最终表面光洁度。
最后，对标本进行消毒以生长生物膜。首先，在 4 mL 过夜培养基中接种单个变异链球菌菌落，然后在 37 摄氏度下孵育培养物 16 至 18 小时，以达到至少 0.9 的光密度。接下来，以 1 比 100 的比例稀释 10 毫升生物膜生长的培养物。
培养基将无菌树脂复合标本无菌转移至无菌 12 孔板中，然后向每个孔中加入 2.5 mL 稀释的培养物。对于漱口水处理组和对照组，将 2.5 毫升无菌未接种的生物膜生长、培养基添加到无菌对照孔中，然后在 37 摄氏度的微副生条件下在摇床上以 100 RPM 的速度生长生物膜。24 小时后，无菌吸出所有孔中的培养基，每次洗涤后用 2.5 毫升无菌 PBS 吸出生理盐水洗涤每个孔两次，然后用 2.5 毫升新鲜生物膜生长培养基补充每个孔，并将板再孵育 24 小时，如刚才所示，生物膜总生长持续时间为 48 小时， 吸出生长培养基，然后将 2.5 毫升漱口水分配到每个处理组井中，将 2.5 毫升无菌超纯水分配到对照组中。
在轨道振荡器上以 150 RPM 的速度搅拌板，然后在 60 秒后，从孔中吸出漱口水和超纯水，以染色生物膜的外切多糖成分。将每个生物膜与 50 μL LOR 偶联物在室温下避光孵育 30 分钟。然后用 2.5 ml TC 缓冲液洗涤标本两次，每次洗涤后吸出，并在室温下避光，用 50 μL 细胞九滴对每个生物膜中的核酸染色 30 分钟。
清洗标本两次后，在室温下用 50 μL Cipro red 对每个生物膜中的蛋白质成分进行 30 分钟的染色，避光保存。洗涤标本 3 次后，将它们转移到每孔含有 6 毫升无菌超纯水的六孔板的各个孔中，以便于通过共聚焦显微镜进行可视化，以获取处理组和对照组生物膜内每个组分染色的图像。将共聚焦激光扫描显微镜的激光设置为以下设置，以便通过 Exor 偶联染色检测外多糖，使用 633 纳米激光和 659 至 749 纳米发射波段通过 Cyto Nine 染色检测核酸。
使用 488 纳米激光器和 495 至 500 纳米发射波段，对于通过 Cipro 红色染色剂检测蛋白质，请使用 543 纳米激光和 615 至 651 纳米发射波段。然后使用具有 0.9 数值孔径和 2.2 毫米工作距离的 63 倍浸渍镜头。在堆叠之间模式下使用顺序扫描以 400 赫兹的频率收集共聚焦激光扫描显微镜图像，以优化同一生物膜内多个染色剂图像的捕获。
分析共聚焦激光扫描显微镜图像后，使用速度图像分析软件中的 3D 渲染器菜单选项创建每个生物膜内叠加成分染色的重建 3D 图像。接下来，旋转 3D 图像以获得生物膜的最佳视图。然后捕获生物膜重建的快照，并以合适的图像文件格式导出快照。
最后，对生物膜内外多糖核酸和蛋白质成分的并发分布进行视觉分析。在重建的图像中，使用 ISA 3D 软件计算生物膜结构参数，例如生物体积和平均生物膜厚度，在本表中，显示了使用统计分析软件计算的生物膜结构参数的平均值和标准差值。用漱口水处理的生物膜的结构参数的平均值和标准差值与对照组中生物膜的结构参数显着不同，在红色混合模型中突出显示。
统计分析表明，Biotene PBF 漱口水产生的生物膜结构在两种树脂复合材料上与对照组显着不同，而 Listerine 全效护理漱口水在两种树脂复合材料上均未产生显着差异，清楚地表明两种漱口水处理后剩余的细胞和细胞外生物膜成分存在差异。生物膜内外切多糖、核酸和蛋白质的并发分布可以通过使用 velocity 软件生成的 3D 重建进行可视化。在该图中，在 0.4 上生长的对照组生物膜的代表性重建显示蓝色被分配给外切多糖。
在变异链球菌生物膜中，绿色分配给核酸，红色分配给蛋白质。中间空间可能被水或其他未经过荧光标记的生物膜成分占据。在该图中，显示了在 TPH 三种树脂复合材料上生长的对照组生物膜的代表性重建，其颜色代表与上图相同的成分。
该程序已应用于医学、牙科、地质学和海洋科学等各种学科。由于许多底物和生物膜可以替代这里使用的底物和生物膜。
概述
本文介绍了一种用于定量和比较生物膜中细胞和细胞外成分的三维分布的协议。该方法采用共聚焦激光扫描显微镜和统计分析来评估抗菌剂对生物膜结构的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 生物膜研究
- 抗菌治疗
背景
- 生物膜是由微生物群落形成的复杂结构。
- 了解其组成对于开发有效的抗菌策略至关重要。
- 现有方法通常缺乏同时分析多个组分的能力。
- 本研究旨在通过一种新颖的协议来解决这一差距。
研究目的
- 定量和比较抗菌处理后生物膜成分的分布。
- 利用先进的成像技术进行详细分析。
- 增强对生物膜对抗菌剂反应的理解。
使用的方法
- 树脂复合材料样品的制备和抛光。
- 在样品上生长生物膜，随后进行抗菌处理。
- 用荧光染料对生物膜进行染色以便成像。
- 生物膜结构参数的统计分析。
主要结果
- 使用共聚焦显微镜成功成像多种生物膜组分。
- 定量分析显示处理组和对照组之间存在显著差异。
- 通过3D重建实现了生物膜结构的增强可视化。
- 统计分析提供了关于生物膜在处理条件下行为的见解。
结论
- 该协议有效地表征了生物膜组分及其分布。
- 它为研究生物膜对处理的反应提供了一种全面的方法。
- 该方法可以应用于各种与生物膜相关的研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
This methodology addresses a critical gap in biofilm research by enabling concurrent quantification of three key components—extracellular polymeric substances, nucleic acids, and proteins—within 3D biofilm architecture. For biopharma R&D, this supports mechanistic de-risking of antimicrobial candidates by providing multi-parametric structural readouts that reflect functional biofilm integrity. The approach enhances predictive confidence in lead identification by linking compound treatment to concurrent changes in biofilm composition and thickness, informing go/no-go decisions earlier in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of antimicrobial effects on multiple biofilm constituents simultaneously, clarifying mechanism of action beyond single-component assays.
- Operational Value: Provides quantitative structural parameters (biovolume, mean thickness) that support hypothesis testing and target validation in antimicrobial screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible 3D imaging and quantification workflows for evaluating compound efficacy against complex biofilm structures.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through distinct but interconnected staining, imaging, and analysis steps compatible with high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by allowing comparison of biofilm architecture across substrates and treatment conditions, relevant to oral and mucosal infection models.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying structural changes in biofilm components that correlate with functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead optimization, providing structural phenotyping data that informs mechanistic understanding and preclinical translation of antimicrobial agents.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing how treatments differentially affect biofilm matrix, nucleic acid, and protein distribution.
- Screening: Delivers assay standardization and quantitative outputs (biovolume, thickness) that enable reliable comparison of compound effects across biofilm components.
- Analytics: Provides structural parameter measurements and statistical analysis capabilities (mixed models) that help teams compare conditions and assess significance.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling structural comparison of biofilms grown on clinically relevant substrates like dental resins.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and quantification platform applicable across antimicrobial, antifouling, and biofilm-disrupting compound programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through concurrent, multi-component structural analysis.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized staining, imaging, and statistical analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by delivering multi-parametric data that better reflect biofilm complexity than single-readout assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that significantly alter biofilm architecture across multiple components.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal laser scanning microscopy, fluorescence staining, and 3D image analysis software (e.g., ISA3D, Velocity).
- Dependent on access to CLSM with specific laser and emission band settings for multiplex fluorophore detection.
- Necessitates cross-team standardization of biofilm growth, staining, and imaging protocols to ensure reproducibility across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different microbial strains, biofilm models, or substrate types beyond S. mutans on dental resins.
- Practical limitations include spectral overlap challenges in dye selection and computational complexity in quantifying multiple fluorochromes, as noted in the source material.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:45
Specimen Fabrication
2:23
Biofilm Growth
4:00
Antibacterial/Mouthwash Treatments
4:33
Staining
5:36
Imaging Using Confocal Laser Scanning Microscopy
6:55
Biofilm Visualization and Structural Analysis
7:56
Results: Representative Biofilm Component Staining for Mouthwash Treatment and Control Groups
9:52
Conclusion
