生物膜中细胞与胞外组分的同时定量

本实验的总体目标是定量分析并比较经抗菌剂处理后，三种细胞内外生物膜组分在三维空间中的同步分布情况。该目标首先通过制备并抛光树脂复合材料样本实现；第二步，在样本表面培养目标生物膜，随后对其进行抗菌剂处理。

接下来，使用荧光染料对生物膜中的胞外聚合物、核酸和蛋白质进行染色，然后通过共聚焦激光扫描显微镜成像。最后一步中，重建叠加荧光染料的三维图像，以实现对生物膜组分的同步可视化，并从生物膜图像中计算结构参数。最终，可对生物膜结构参数（如生物膜体积和平均生物膜厚度）进行统计分析，以比较处理组与对照组之间的差异。

与现有方法相比，本实验方案的主要优势在于采用了一系列独特但相互关联的技术，用以表征在特定条件下生长的生物膜结构中多种组分的分布情况。本实验操作将由本实验室的博士后研究员Fernando Flores博士和研究助理Kristen Smart女士演示。制备样品时，首先将一份0.4毫米或TPH3牙科树脂复合材料填入定制的不锈钢模具中。接着，使用LED光固化仪对第一层材料进行40秒的光固化。完成第一层操作后，重复上述步骤处理第二层材料，随后使用半自动研磨抛光机对固化后的样品进行抛光，直至获得符合要求的最终表面光洁度。

最后，对样本进行灭菌以培养生物膜。首先，将一株变形链球菌的单菌落接种至4毫升过夜培养基中，然后在37°C下培养16至18小时，使菌液达到至少0.9的光密度。接着，将该菌液按1:100的比例稀释于10毫升生物膜生长培养基中。

将无菌的树脂复合材料样本无菌转移至无菌的12孔板中，然后向每个孔中加入2.5毫升稀释后的菌液。对于漱口水处理组和对照组，向无菌对照孔中加入2.5毫升无菌未接种的生物膜生长培养基，随后将12孔板置于37摄氏度、微需氧条件下，以100转/分钟的振荡速度培养生物膜。24小时后，无菌吸取各孔中的培养基，并用2.5毫升无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗每个孔两次，每次清洗后吸除盐水；然后向每个孔中补充2.5毫升新鲜的生物膜生长培养基，按照上述条件继续孵育24小时，使生物膜总生长时间为48小时。生物膜生长完成后，吸除各孔中的培养基，随后向处理组各孔中加入2.5毫升漱口水，向对照组各孔中加入2.5毫升无菌超纯水。

将培养板置于摇床上，以150 RPM的速度充分振荡混匀，60秒后吸去各孔中的漱口水和超纯水，以染色生物膜中的胞外多糖成分。每个生物膜中加入50 µL LOR偶联物，在室温避光条件下孵育30分钟。随后用2.5 mL TC缓冲液洗涤样本两次，每次洗涤后均需吸去缓冲液，并在每个生物膜上加50 µL cyto nine染液，室温避光染色30分钟，以染色核酸成分。

将样本洗涤两次后，在避光条件下，室温孵育50微升Cipro红染料30分钟，对每个生物膜中的蛋白质组分进行染色。再将样本洗涤三次后，转移至六孔板的各个孔中，每孔加入6毫升无菌超纯水，以便通过共聚焦显微镜观察，获取处理组和对照组生物膜内各组分染色的图像。设置共聚焦激光扫描显微镜的激光参数如下：使用Exor偶联染料检测胞外多糖时，采用633纳米激光激发，发射波长范围为659至749纳米；使用cyto nine染料检测核酸时，亦采用相同激发与发射参数。

使用488纳米激光和495至500纳米发射波段；检测Cipro红染料标记的蛋白质时，使用543纳米激光和615至651纳米发射波段。然后采用63倍水浸物镜，数值孔径为0.9，工作距离为2.2毫米。以400赫兹频率采集共聚焦激光扫描显微图像，采用连续扫描模式中的“层间堆叠”方式，以优化同一生物膜内多种染料标记图像的获取。

分析共聚焦激光扫描显微镜图像后，使用 velocity 图像分析软件中的 3D 渲染器菜单选项，对每个生物膜内叠加的组分染色创建重建的 3D 图像。接着，旋转 3D 图像以获得生物膜的最佳视角。然后捕获生物膜重建图像的快照，并以合适的图像文件格式导出该快照。

最后，对生物膜内胞外多糖、核酸和蛋白质组分的共定位分布进行可视化分析。在重建的图像中，使用本表中的 ISA 3D 软件计算生物膜结构参数，如生物膜体积和平均生物膜厚度。该表显示了使用统计分析软件计算得到的生物膜结构参数的均值和标准差。经漱口水处理的生物膜，其结构参数的均值和标准差与对照组生物膜相比存在显著差异，此类数据在混合模型中以红色标出。

统计学分析表明，Biotene PBF 漱口水在两种树脂复合材料上产生的生物膜结构与对照组相比均存在显著差异，而李施德林全面护理漱口水在任一种树脂复合材料上均未产生明显差异，这清晰地表明两种漱口水处理后残留的细胞及细胞外生物膜成分存在差异。生物膜中胞外多糖、核酸和蛋白质的共分布情况可通过 Velocity 软件生成的三维重建图像进行观察。在本图中，展示了在 0.4 上生长的对照组生物膜的代表性重建结果，其中蓝色代表胞外多糖。

在变形链球菌生物膜中，绿色代表核酸，红色代表蛋白质。中间的空间可能被水或其他未进行荧光标记的生物膜组分占据。本图展示了对照组生物膜在TPH三树脂复合材料上生长的代表性重建图像，其中颜色所代表的组分与前一幅图相同。

该方法已广泛应用于医学、牙科、地质学和海洋科学等多个领域，因为许多基底材料和生物膜均可替代本实验中所使用的材料。