一个用于钩 端螺旋体 生物膜定量、结构和功能分析的模块化工作流程

我们研究生物膜作为保护结构，促进环境和宿主的存续，研究其形成动力学、分子组成、适应特征及对感染的贡献。结合晶体生物测定、时间文本成像、共聚焦显微镜、扫描电子显微镜和转录组学，通过集成多维分析推动生物膜研究的发展。首先，在EMJH培养基中，用平底螺旋盖玻璃管培养钩端螺旋体细胞。

在30摄氏度的有氧条件下培养培养，直到达到对数中期。确保培养物在405纳米下达到0.2至0.4的光学密度，相当于每毫升8细胞的2到5乘以10的幂次方。使用20倍放大的暗场显微镜，验证细胞是否为模态且非聚集。

将经验证的中期对数心律失常相培养物以1比100比例稀释于新鲜EMJH培养基中，约得到1乘以10的6细胞每毫升的幂次方，并通过倒置轻柔混合，避免涡旋。现在用无菌镊子将一块0.1微米的无菌亲水聚碳酸酯膜平放在每个孔底部，置于带盖的无菌24孔板中。在每个孔中加入一毫升无菌EMJH培养基，并在30摄氏度下预先浸泡膜两小时。

接着，从每个井中取出浸泡溶液，但不移开膜，加入1.5毫升稀释的细菌悬浮液，确保膜牢固地固定在底部。然后，在孵化器内放置装满水的托盘以保持湿度。在30摄氏度的静止条件下孵育平板，以促进生物膜形成。

对于生长缓慢的菌株，可以放置培养皿长达三周。在指定时间点，小心吸入尽可能多的培养基，同时不扰动生物膜。用一毫升无菌PBS轻轻冲洗每个口，同时保持膜平贴底部。

向每个孔中加入1毫升4%对羟基醛，浸泡在PBS中，并在37摄氏度下培养30分钟以固定生物膜样品。孵育后，去除固定剂，并用一毫升PBS轻轻冲洗两次。向每个井中加入一毫升、体积比0.1%的晶体紫溶液，并在室温下孵育15分钟，确保盖层完全浸没。

然后将每个槽中的晶体紫染料丢弃，并用一毫升PBS冲洗两次。倾斜盘子，把剩下的液体全部倒掉。将盘子置于室温自然风干，直到基质看起来完全干燥，最好过夜。

接着，每口井加入500微升含50%乙醇和50%冰川醋酸的埃卢基安缓冲液。上下移液器，完全溶解与生物膜结合的染色剂。现在，将每个样品200微升转移到光学透明的96孔微板上。

测量570纳米的吸收率，并从所有步骤处理的未接种对照中扣除背景值。记录至少三次技术重复的均值和标准差。如前所述，获取井板中的生物膜。

在0.2摩尔钠缓冲液中、pH 7.4中加入4%对羟醛和1%戊二醛溶液。将固定样本在37摄氏度下孵育30分钟。去除固定剂后用PBS冲洗样品两次，以保留表面附着的生物膜，同时尽量减少脱落。

然后将覆盖套浸入稀释于PBS中的1%四氧化二锇中，培养一小时以增强扫描电子显微镜对比度。然后用PBS冲洗底材两遍。将样品依次浸泡在分级乙醇序列中10分钟进行脱水。

接着，加入500微升六甲基二硅氮烷，培养五分钟。然后更换为新鲜的六甲基二硅氮，再多孵育五分钟。之后，去除多余溶液，让样品在抽烟罩下完全自然风干。

然后用双面导电碳带将干燥样品安装在扫描电子显微镜短片上。溅射涂层在样品上覆盖一层约10纳米厚的金或铂，以增强电子对比度，以便成像。最后，将准备好的样本棒放入扫描电子显微镜，使用相应的样品架。

如果可能，建议在夜间抽空舱室以提升成像质量。然后用适当的放大倍率在5至15千伏获取次级电子图像，以可视化生物膜的超微结构。经过21天的孵育，晶紫染色揭示了聚碳酸酯滤纸和玻璃覆盖套上细端螺旋体Interrogans和双鳍细端螺旋体的可见生物膜图案。

每种物种都展现出独特的建筑足迹，如点状、分枝或网状形态。570纳米的吸收测量确认，在所有时间点，钩端螺旋体生物膜的晶体紫保留率优于细端螺旋体的细端螺旋体，显示菌株生物量积累更高。扫描电子显微镜捕捉到三天前生物膜中的早期细胞外基质沉积，14天时成熟且有通道结构的基底面具三维结构，21天时基质巩固且结构密集。

我们优化的协议同步来自相同培养物的互补读数，提升鲁棒性，减少变异性，揭示动态和结构信息，并支持单一方法。通过整合互补分析，我们的发现规范了生物膜评估，阐明了钩端螺旋体的动态和结构。它们将结构与毒力联系起来，并加强可重复的比较研究。

未来突变体将调控与生物膜形态和动态联系起来，澄清环境的持续性，并评估破坏生物膜信息或促进扩散的策略。