Name: 一个用于钩 端螺旋体 生物膜定量、结构和功能分析的模块化工作流程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 了解钩端螺旋体生物膜定量分析方法，结合结晶紫染色、共聚焦显微镜和扫描电镜技术，建立标准化模块化工作流程，用于研究生物膜结构与功能及其在感染中的作用。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们衷心感谢AXA研究基金通过博士后奖学金（编号：15-AXA-PDOC-037）、新喀里多尼亚巴斯德研究所（IPNC）和新喀里多尼亚大学（UNC）通过博士生奖学金，以及法国国家科研署（ANR）在项目编号SPIraL-19-CE35-0006-01下的资助所提供的资金支持。本出版物中提及的商标或商业产品仅用于说明实验过程中所使用的材料，此类提及并不构成新喀里多尼亚巴斯德研究所对任何商业利益的认可、推荐或背书。

<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilm%3A+A+review+on+formation%2C+infection%2C+antibiotic+resistance%2C+control+measures%2C+and+innovative+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilm: A review on formation, infection, antibiotic resistance, control measures, and innovative treatment.</a> Microorganisms. 11 (6), (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+An+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: An emergent form of bacterial life.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Mendhe, S., Badge, A., Ugemuge, S., Chandi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+biofilms+on+chronic+infections+and+medical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Impact of biofilms on chronic infections and medical challenges.</a> Cureus. 15 (11), e48204(2023).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+From+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sociobiology+of+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The sociobiology of biofilms.</a> FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+dish+biofilm+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter dish biofilm formation assay.</a> J Vis Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Beenken, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression in Staphylococcus aureus biofilms.</a> J Bacteriol. 186 (14), 4665-4684 (2004).</li>
<li>Wilson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+assessment+methods+for+biofilm+growth%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Rev+J+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review.</a> Res Rev J Eng Technol. 6 (4), (2017).</li>
<li>Yildiz, F. H., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+biofilms%3A+So+much+the+same+yet+so+different%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Vibrio biofilms: So much the same yet so different.</a> Trends Microbiol. 17 (3), 109-118 (2009).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1 (Unit 1B.1), (2005).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Crit Rev Microbiol. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>Ristow, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+saprophytic+and+pathogenic+Leptospires%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by saprophytic and pathogenic Leptospires.</a> Microbiology. 154 (Pt 5), 1309-1317 (2008).</li>
<li>Chiani, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Leptospira+spp.+in+a+mosaic+of+wetlands+used+for+livestock+raising+under+differing+hydroclimatic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of Leptospira spp. in a mosaic of wetlands used for livestock raising under differing hydroclimatic conditions.</a> Appl Environ Microbiol. 89 (6), e0197122(2023).</li>
<li>Yamaguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+interactions+of+Leptospira+interrogans+with+proximal+renal+tubule+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterizing interactions of Leptospira interrogans with proximal renal tubule epithelial cells.</a> BMC Microbiol. 18 (1), 64(2018).</li>
<li>Santos, A. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+formation+in+Rattus+norvegicus+%28Norway+rats%29+natural+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm formation in Rattus norvegicus (Norway rats) natural reservoirs.</a> PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009736(2021).</li>
<li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biofilm+formation+of+pathogenic+Leptospira+spp.+in+the+vitreous+humor+of+horses+with+recurrent+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">In vivo biofilm formation of pathogenic Leptospira spp. in the vitreous humor of horses with recurrent uveitis.</a> Microorganisms. 9 (9), (2021).</li>
<li>Dos Santos Ribeiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+biofilms+from+an+urban+community+in+Salvador%2C+Brazil%2C+shelter+previously+uncharacterized+saprophytic%C2%A0Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Environmental biofilms from an urban community in Salvador, Brazil, shelter previously uncharacterized saprophytic Leptospira.</a> Microb Ecol. 86 (4), 2488-2501 (2023).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogenic+leptospiral+protein+encoding+gene+%28lipL32%29+in+environmental+aquatic+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogenic leptospiral protein encoding gene (lipL32) in environmental aquatic biofilms.</a> Lett Appl Microbiol. 62 (4), 311-315 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospirosis%3A+Toward+a+better+understanding+of+the+environmental+lifestyle+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Water%22%5BJournal%5D)">Leptospirosis: Toward a better understanding of the environmental lifestyle of Leptospira.</a> Front Water. 5, 1195094(2023).</li>
<li>Dias, C. S., Pinna, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+biofilms%3A+Implications+for+survival%2C+transmission%2C+and+disease+management%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Leptospira biofilms: Implications for survival, transmission, and disease management.</a> Appl Environ Microbiol. 91 (2), e0191424(2025).</li>
<li>Gomes, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+production+of+Leptospira+spp.+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Sci+Vet%22%5BJournal%5D)">Biofilm production of Leptospira spp. strains.</a> Acta Sci Vet. 46 (1), 5(2018).</li>
<li>Thibeaux, R., Kainiu, M., Goarant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+and+quantification+using+the+96-microtiter+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation and quantification using the 96-microtiter plate.</a> Methods Mol Biol. 2134, 207-214 (2020).</li>
<li>Vinod Kumar, K., Lall, C., Vimal Raj, R., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-existence+and+survival+of+pathogenic+Leptospires+by+formation+of+biofilm+with+Azospirillum%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Co-existence and survival of pathogenic Leptospires by formation of biofilm with Azospirillum.</a> FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), fiv051(2015).</li>
<li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Commun. 5, 4462(2014).</li>
<li>Rollet, C., Gal, L., Guzzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-detached+cells%2C+a+transition+from+a+sessile+to+a+planktonic+phenotype%3A+A+comparative+study+of+adhesion+and+physiological+characteristics+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Biofilm-detached cells, a transition from a sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Microbiol Lett. 290 (2), 135-142 (2009).</li>
<li>Haake, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hamster+model+of+leptospirosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hamster model of leptospirosis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 12 (Unit 12E.12), (2006).</li>
<li>Cagliero, J., Huet, K., Matsui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+golden+Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+leptospirosis-associated+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of golden Syrian hamster as an animal model to study leptospirosis-associated immune responses.</a> Methods Mol Biol. 2134, 243-255 (2020).</li>
<li>Gomes-Solecki, M., Santecchia, I., Werts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+leptospirosis%3A+Of+mice+and+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Animal models of leptospirosis: Of mice and hamsters.</a> Front Immunol. 8, 58(2017).</li>
<li>Guedes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+enrichment+used+in+the+EMJH+medium+%28Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris%29+for+the+cultivation+of+Leptospira+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Argent+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improvement of the enrichment used in the EMJH medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) for the cultivation of Leptospira spp.</a> Rev Argent Microbiol. 54, 95-99 (2022).</li>
<li>Iraola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+sequencing+reveals+wide+expression+reprogramming+of+basal+and+unknown+genes+in+Leptospira+biflexa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Transcriptome sequencing reveals wide expression reprogramming of basal and unknown genes in Leptospira biflexa biofilms.</a> mSphere. 1 (2), e00042-e00116 (2016).</li>
<li>Davignon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptospira+interrogans+biofilm+transcriptome+highlights+adaption+to+starvation+and+general+stress+while+maintaining+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Leptospira interrogans biofilm transcriptome highlights adaption to starvation and general stress while maintaining virulence.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 10 (1), 95(2024).</li>
<li>Thibeaux, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zoonotic+pathogen+Leptospira+interrogans+mitigates+environmental+stress+through+cyclic-di-GMP-controlled+biofilm+production%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">The zoonotic pathogen Leptospira interrogans mitigates environmental stress through cyclic-di-GMP-controlled biofilm production.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 6 (1), 24(2020).</li>
<li>Lawrence, J. R., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+for+analysis+of+microbial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy for analysis of microbial biofilms.</a> Methods Enzymol. 310, 131-144 (1999).</li>
<li>Bridier, A., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+confocal+laser+scanning+microscopy+in+deciphering+biofilm+tridimensional+structure+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity.</a> Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).</li>
<li>Werner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratified+growth+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 70 (10), 6188-6196 (2004).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+techniques+for+in+situ+analysis+of+the+biofilm+matrix+%28structure%2C+composition%2C+dynamics%29+by+means+of+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Advanced techniques for in situ analysis of the biofilm matrix (structure, composition, dynamics) by means of laser scanning microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1147, 43-64 (2014).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).</li>
<li>Relucenti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+biofilm+imaging%3A+Focus+on+SEM+and+VP-SEM+pros+and+cons%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for biofilm imaging: Focus on SEM and VP-SEM pros and cons.</a> Biology (Basel). 10 (1), (2021).</li>
<li>Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+cells+for+SEM%2C+AFM+and+TEM+by+hexamethyldisilazane%3A+A+study+on+hepatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: A study on hepatic endothelial cells.</a> J Microsc. 186 (Pt 1), 84-87 (1997).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务或非财务利益。所有作者均已审阅并批准了本声明。

本方案介绍了一种模块化且整合性的研究流程，用于研究 钩端螺旋体 生物膜，整合定量生物量（结晶紫）9,27，动态变化（延时相差成像），三维结构组成（使用特异性探针的共聚焦激光扫描显微镜）38，超微结构（扫描电子显微镜）及功能评估（仓鼠感染）。通过在各模块中使用相同的培养体系，可最大限度减少批次效应，并实现实验内的交叉验证，这对于生长缓慢且脆弱的螺旋体尤为重要。各模块相互补充：CV定量 &#34;多少&#34; 延时显示 &#34;多快，&#34; CLSM 显示 &#34;内部包含什么，&#34; SEM可解析 &#34;其构建方式&#34; 以及 在体内 检测提供 &#34;功能验证&#34; 纳入 L. biflexa 展示了在不同物种间的适应性，凸显了更快更密集的生物膜形成能力，并强调了方法学的灵活性35.
每个模块的成功均依赖于接种物的质量和生理状态。处于对数中期的浮游培养物（3-5天），应具有高度运动性且无聚集体，以获得可重复的黏附和生物膜发育结果。应仅使用低传代次数的分离株，以确保生物膜形成的稳健性和可重复性。
结晶紫（CV）分析法因其快速、可扩展性和高通量而成为整个工作流程的核心9,27。该方法可用于对突变株、培养基或抗生物膜化合物进行快速筛选。然而，由于Leptospira生物膜脆弱且具有异质性，操作时必须轻柔，并需进行重复验证。CV染色法无法区分致密型与多孔型结构，也不能检测基质成分——因此其作用主要是作为深入结构分析的初步筛选手段。
延时成像通过实时揭示生物膜的动力学过程，弥补了这一空白。它能够捕捉运动性聚集体的出现、融合及固定过程，揭示终点检测法所遗漏的瞬时现象。环境稳定性（温度、湿度、自动对焦）至关重要。这些记录显示，即使结晶紫染色测得的生物膜生物量看似稳定，其动态过程仍可能存在差异——表明生物膜深层结构正在发生重组或活力丧失。
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）可在无脱水假象的情况下提供三维结构和化学成分信息39。活/死细胞染色揭示了生物膜内部的细胞活力梯度，这与先前报道的氧气扩散受限及代谢分层现象一致6,40。凝集素和核酸染料可显示丰富的胞外DNA及特定糖类基序，从而实现对基质组分的定量与表征41,42。CLSM数据常显示出内部空腔结构，这与延时成像中观察到的集体性重排现象相呼应38。然而，其局限性包括探针特异性、光漂白效应以及衍射极限所限制的轴向分辨率；因此，应在实验前对显微镜设置和染料性能进行标准化校验，以确保不同实验间结果的可靠性与可比性。
SEM 提供互补的超微结构分辨率43在早期阶段，可分辨出新生的聚集体；在成熟阶段（&#8776; 15-21天），显示出极性结构：基部为粗糙、具通道的层，用于附着和物质交换；顶部为较光滑、富含基质的表面37仔细的固定、HMDS干燥以及与共聚焦数据的关联可减轻因脱水或塌陷造成的伪影44.
这四个模块共同实现了内部交叉验证：当结晶紫染色法（CV）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和扫描电子显微镜（SEM）结果一致时，结论具有较高可靠性；当结果出现分歧时，这些差异本身也具有信息价值——例如可揭示生物量增加但活力降低，或生物量不变但基质成分发生改变等情况。
目前仍存在若干内在局限性。Leptospira 生物膜具有异质性和脆弱性，因而对操作和脱水极为敏感。结晶紫染色法可测定总生物量，但无法反映细胞活性16；共聚焦激光扫描显微镜受限于光学分辨率极限38；扫描电镜则存在制样过程中产生假象的风险。由于氧气梯度的存在，深层菌体出现死亡属预期现象6，但此类偏差在不同实验条件下具有一致性和可比性。生物膜成熟通常在15至21天左右趋于平台期，此阶段与营养限制相关的转录特征密切相关36。而更晚期的发育阶段仍缺乏充分表征。
体内 实验可提供功能背景。通过腹腔注射，可检测生物膜来源的细胞在毒力或持留性方面是否与浮游细胞存在差异。尽管腹腔接种并非自然感染途径，但其提供了一种可控的比较模型36。聚集体的异质性会引入一定变异，但通过一致的操作和匹配的接种量可减轻该影响。重要的是，生物膜的持留特性（例如由胞外基质介导的应激耐受性）并不一定转化为更强的急性毒力，这凸显了生物膜形成的生态学意义而非致病性作用24。
该模块化设计支持可扩展的应用。若需快速筛选，结晶紫染色法和延时成像已足够；若需获得机制性认识，则共聚焦激光扫描显微镜和扫描电镜可提供组分与结构层面的更高分辨率。各模块可整合酶处理或化学干预（如DNase、糖苷酶）、针对多糖或核酸的替代探针，或微流控系统以检测生物膜对流动的响应。同一接种物还可用于转录组学或蛋白质组学分析，从而将生物膜表型与基因调控直接关联（例如c-di-GMP信号通路、饥饿应答）。该体系同样适用于突变株筛选、环境扰动测试以及抗生物膜或抗毒力化合物的评估。
这一整合性工作流程将孤立的观察结果转化为对Leptospira生物膜的多维度系统认知。通过结合高通量检测（CV）、动态监测（延时成像）、化学成分与三维结构分析（CLSM）以及超微结构观察（SEM），该方法能够真实地揭示Leptospira菌群的可移动性、多孔性及极性特征。在前期研究17,35,36的基础上，本方法进一步证明，协调性的模块化实验能够揭示单一方法无法观察到的现象——例如生物量上升而存活率下降，或不同物种间动力学行为的差异。最终，该方法支持在不同物种、突变株和实验条件下进行具有可比性、可重复性且功能相关的分析，为机制性微生物学研究、生态适应性探索以及抗生物膜策略的设计提供了坚实基础。

生物膜是由微生物形成的结构化群落，其中细胞被自身分泌的胞外聚合物基质（EPS）所包埋，该基质由多糖、蛋白质、核酸和脂类组成1。该基质提供机械稳定性，介导细胞对表面的黏附，并通过增强微生物对干燥、氧化应激和抗菌剂等环境压力的耐受性，提高其存活能力2,3。在致病菌中，生物膜有助于细菌长期存留、逃避免疫识别并导致慢性感染4,5。
与自由漂浮且代谢相对均一的浮游细胞相比，生物膜相关细胞表现出改变的基因表达、生长速率和代谢活性6。这些差异使细胞对环境压力、抗生素和宿主防御具有更强的耐受性，同时支持群体感应、营养保留和空间有序性等协调行为7,8。
生物膜的形成已在Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus和Vibrio cholerae等模式生物中得到广泛表征，这些研究共同塑造了我们对生物膜生活方式在遗传、结构和生理基础方面的理解。Pseudomonas的相关研究表明，胞外多糖和群体感应共同作用，塑造复杂的三维生物膜结构9,10。对Staphylococcus的研究则强调了表面蛋白和胞外DNA在增强生物膜凝聚力和抗生素耐受性方面的重要作用11,12。对Vibrio属物种的研究进一步揭示了生物膜形态的显著多样性及其在水生环境中的生态意义¹³。总体而言，这些系统为生物膜研究提供了坚实的理论和方法框架，这一框架由标准化实验方案14以及对现有技术的批判性评估所强化15,16，共同凸显了在研究Leptospira等研究较少的细菌的生物膜形成时，采用统一方法的必要性。
螺旋体属成员 钩端螺旋体，钩端螺旋体病的致病因子，长期以来被认为主要以浮游状态存在。近期研究通过实验已证实多种钩端螺旋体均能形成稳定的生物膜17尽管一些研究表明环境中的生物膜形成18 以及宿主相关联的19 环境中，其他研究已通过实验验证了钩端螺旋体在肾小管中形成生物膜的能力 Rattus norvegicus20 马的玻璃体液21以及检测环境生物膜中的钩端螺旋体属物种22,23. 解析调控这些条件与机制的因素 钩端螺旋体 因此，生物膜对于理解环境传播、储存库持续存在以及疾病发病机制至关重要24,25.
现有的Leptospira生物膜检测方法较为零散，从定性的显微镜观察17,26到终点比色法或结晶紫染色27,28均有涉及。尽管这些研究为生物膜的形成提供了宝贵的见解，但往往缺乏实时监测生物膜成熟与分散过程所需的动力学分辨率，也缺少共聚焦显微镜或电子显微镜所提供的超微结构背景信息。持续监测和三维结构分析被认为是全面揭示生物膜形成与分散动态特性的关键14,15。这些局限性阻碍了不同研究之间的可比性，也限制了对影响生物膜形成与分散的因素或干预措施进行系统性评估，凸显出建立一种标准化、多读数输出的工作流程的必要性，以可重复且全面的方式捕捉Leptospira生物膜的结构与功能动态。
为了解决这些不足，我们开发了一种集成化、模块化的实验流程，可从同一系列培养物中整合六种互补的检测读数。首先，采用高通量结晶紫（CV）微量滴定板法，在多个时间点定量测定附着生物量。其次，在96孔板中进行时间分辨的分步分离检测，通过OD₄₀₅对总菌体、液相（未附着或部分脱落）以及附着（生物膜）群体进行分馏，以追踪其在生物膜形成与分散过程中的动态变化。术语 液相 用于涵盖浮游样和脱离的细胞，承认自由生活表型与表面相关表型之间存在的动态连续性29,30第三，延时相差成像可非侵入性地记录细胞黏附、聚集体运动及融合过程的动力学变化。第四，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）可获得完整的三维重建图像，并结合活/死细胞及基质探针信号，实现基于深度的存活率分析和基质分布图谱。第五，基于膜或盖玻片支撑的扫描电子显微镜（SEM）能够以高分辨率解析细胞外结构以及基底-顶端极性。此外，一个 体内 采用腹腔注射生物膜聚集体至易感的金黄叙利亚仓鼠模型中，以评估毒力，该模型是钩端螺旋体病研究中一种敏感且成熟的动物模型31,32,33将生物膜表型与致病潜力相关联，提供补充功能背景 体外 分析。
与单一模态方法相比，该平台具有多项优势：（i）可同步获取定量数据（循环伏安法和分步光密度）和结构信息（共聚焦激光扫描显微镜/扫描电子显微镜）；（ii）非破坏性地动态监测早期黏附、生长、成熟及分散过程；（iii）利用靶向探针进行三维活性和基质特性表征；（iv）对胞外基质结构进行超微结构成像；（v）在易感仓鼠模型中直接评估生物膜相关性与浮游状态下的毒力功能，上述各项均可在标准BSL-2设施条件下实现。通过采用多孔板格式以及可拆卸的玻璃或聚碳酸酯基底，该工作流程支持对环境变量、抗菌化合物或突变文库进行重复筛选，同时保持无菌性、高通量以及各模块间的交叉验证。
专注于生态学、持留性、宿主-病原体相互作用或抗生物膜发现的研究实验室可采用其中的单个模块或完整流程。所需资源仅限于酶标仪、配备环境控制功能以进行延时成像的倒置显微镜、共聚焦显微镜和扫描电镜（SEM）设施，以及适用于仓鼠模型的标准动物实验设施，从而实现广泛的适用性及在不同研究间的可重复比较。

<table><tbody><tr><td>0.1 &amp;micro;m 无菌亲水性聚碳酸酯膜</td><td>it4ip</td><td>1000M25/861N101/13</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 无菌玻璃盖玻片</td><td>SPL</td><td>330164</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛（PFA）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>21G 针头</td><td>BD Medical</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>24 孔微孔板</td><td>NUNC</td><td>143982</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>Ibidi</td><td>81218-200</td><td></td></tr><tr><td>35-mm 玻璃底 Hi-Q4 培养皿</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>96 孔微孔板</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>抗荧光淬灭封片剂&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>29410</td><td></td></tr><tr><td>碳镀膜仪</td><td>Leica Microsystem</td><td>Em ACE600</td><td></td></tr><tr><td>CFDA/SE 示踪剂</td><td>Biolegend</td><td>423801</td><td></td></tr><tr><td>导电碳胶</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>77816</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫（CV）</td><td>Sigma</td><td>C3886</td><td></td></tr><tr><td>暗场显微镜</td><td>Leica Microsystem</td><td>11888846</td><td>Leica DM4000 B 配备暗场聚光镜（货号&amp;deg; 11505142）</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR Chemicals</td><td>83813.36</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Supelco</td><td>1.00063</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷</td><td>Acros Organics</td><td>120581000</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Memmert</td><td>IN30</td><td></td></tr><tr><td>倒置共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystem</td><td>Leica DMI6000 TCS SP8 X</td><td>共聚焦显微镜 SP8</td></tr><tr><td>配备相差光学系统的倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>CELL-S2</td><td>BioStation IM-Q</td></tr><tr><td>钩端螺旋体 EMJH 培养基基础&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD&amp;nbsp;279410</td><td>用于钩端螺旋体的 EMJH 培养基</td></tr><tr><td>四氧化锇（OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>BCCG9181</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶&amp;nbsp;</td><td>Biotium</td><td>40017</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT300</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>15453149</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计 Varioskan Lux</td><td>Thermo Scientific</td><td>VLBL00GD0</td><td></td></tr><tr><td>无菌磷酸盐缓冲液</td><td>Biosolve</td><td>0016232301BS</td><td></td></tr><tr><td>注射器（1 mL）</td><td>Chirana</td><td>CH03002L</td><td></td></tr><tr><td>SYTO9 绿色荧光核酸染料&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于leptospira生物膜定量、结构与功能分析的模块化工作流程

A Modular Workflow for Quantitative, Structural and Functional Analysis of Leptospira Biofilms

在此，我们介绍一套整合的实验方案，用于培养、定量监测、结构与功能表征 钩端螺旋体 随时间推移对 spp. 生物膜进行分析。该工作流程结合了结晶紫微量滴定板法，用于在多个时间点定量生物膜生物量；采用时间分辨的分步分离方法，区分附着态（生物膜）与非附着态（液相）的细菌群体；结合延时相差显微成像，实现无损的动力学观察；利用共聚焦激光扫描显微镜生成完整的三维重建图像，并结合基质探针信号读出；以及采用膜支撑的扫描电子显微镜进行超微结构分析。同时，我们详细描述了一种标准化操作流程，用于收集完整的生物膜聚集体，并将其制备后经腹腔注射至易感的金黄地鼠模型，从而实现对生物膜相关毒力的直接评估。 体内 以及配对的浮游生物对照组。
该方案针对致病性菌株Leptospira interrogans Manilae L495 进行优化，各模块可便捷地应用于其他Leptospira物种及突变体文库，以比较其生物膜形成能力。上述协调统一的模块共同为筛选抗生物膜策略、探究遗传决定因素以及阐明生物膜在Leptospira持久定植与致病过程中的作用提供了坚实的基础。

当接种物制备正确时，培养物将在3-5天内进入对数中期，OD405值约为0.2-0.4，在暗视野显微镜下可见明亮且高度运动的菌群（≥90%的细胞具有运动性），无可见的菌体聚集体。制备不佳的接种物表现为细菌运动迟缓，视野中运动性不均一；此类培养物通常形成较弱的生物膜，应予以弃用。实际操作中，接种前立即平行检测运动性和OD值，可最大程度减少实验失败。在接种阶段建立这些质量控制标准，是预测后续各项应用成功与否的最重要指标。尽管该方法针对L. interrogans血清型Manilae L495优化，但同样适用于Leptospira biflexa Patoc菌株，以验证其跨物种适用性。L. biflexa通常形成的生物膜较L. interrogans更松散且更薄，但在适当调整参数后，其特征性的发育过程和结构特征仍可被检测到。因此，包含这两种物种可凸显该工作流程对致病性和腐生性Leptospira的广泛适应性。
在30 °C的湿化培养箱中静态培养21天后（或根据所用Leptospira物种的适当时间），生物膜在玻璃盖玻片和亲水性聚碳酸酯膜上均可用肉眼观察到。成功生长的生物膜在2至3周后会形成典型的结晶紫染色特征，如点状、分支状或网状的表面附着痕迹（图2A）。
在典型实验中，野生型 L. interrogans Manilae L495 在第3周时表面覆盖率达到约50%，而低生物膜表型突变株的平台期接近约20%，高生物膜表型则可达约70–80%，从而为筛选建立了实用的动态范围。生物膜形成的程度也可能因钩端螺旋体（Leptospira）的物种和菌株不同而有所差异；例如，L. biflexa Patoc 菌株形成可见生物膜的速度更快，既往研究认为接种后120小时即可形成成熟的生物膜结构35。
结晶紫染色法为定量生物膜生物量提供了一种可靠且可重复的方法。在发育良好的生物膜中，染色后盖玻片或膜区域会呈现深紫色，表明附着的生物量较高（图2A）。染色和溶解过程中的视觉提示也可作为判断实验方案是否成功的有用指标。例如，结晶紫分布不均或染色过浅，可能是由于接种细胞量不足、液体蒸发或洗涤过于剧烈导致早期生物膜脱落所致。
在570 nm处的吸光度读数反映了残留染料的量，因此可代表相对生物膜密度（图2B）。在代表性实验中，钩端螺旋体（L. interrogans）在最佳条件下培养时，各重复样本之间的OD₅₇₀读数一致且可重复，表明生物膜形成稳定。相比之下，若在更换培养基过程中对样品进行过度移液操作，则常观察到重复样本间出现较大差异，提示细胞贴附不良或生物膜部分脱落。此类变异性应被视为技术问题的信号，相关样本应予以剔除，或需仔细复查实验方案。值得注意的是，在相似条件下，短螺旋体（L. biflexa）Patoc菌株在玻璃盖玻片和聚碳酸酯膜上均能形成更广泛的生物膜，这体现在更高的CV吸光度值上，表明该方案适用于不同钩端螺旋体（Leptospira）物种，具有良好的适应性和有效性。
成功的扫描电镜（SEM）制备可在第3天即观察到细胞外基质的沉积，随后在成熟生物膜中呈现出显著的极性结构：粗糙且具有通道的基底面（通常含有&gt; 5 µm的通道）锚定着多孔的内部结构，而较光滑的顶端面则嵌有密集体基质中的螺旋体（图2C, D, E, F）。高倍视野常可捕捉到分支状的细胞外丝状结构及偶见的蘑菇样突起，这些特征与延时成像所见的融合动态相对应（补充视频1）。在次优的制备样本中，可能出现基质塌陷、电荷积累及细胞轮廓模糊等现象，通常反映后固定不充分、导电涂层不足或干燥不良。当基底-顶端极性及广泛存在的通道清晰可见时，SEM的观察结果与共聚焦显微镜对厚度和孔隙率的估算高度一致，表明制备与成像均成功完成。
在有效的时间序列中，孤立的点状结构在24-72小时内出现，并逐渐融合成更大的聚集体，这些聚集体在空间受限之前横扫表面（图3A, B, C）。定量分割结果显示，总覆盖面积单调增加，而聚集体数量先上升、达到峰值后下降，此过程在约12至216小时之间以碰撞和融合为主导。这种动力学特征（面积增加、聚集体数量减少）表明为活跃的聚集过程，而非简单的沉降现象。失败或临界状态的实验缺乏早期点状结构，表现为平坦的面积-时间曲线，或因温度/湿度不稳定导致的焦距漂移。通常，在30 °C、95%湿度的稳定环境中，并在每个时间点使用自动对焦，可恢复清晰的动态轨迹，适用于突变体或不同处理之间的比较。
成熟生物膜的代表性Z轴层叠图像显示泡沫状、多层结构，厚度通常超过50 µm，其中大多数细胞染色呈活细胞（SYTO 9阳性），偶见中心空腔，提示生长过程中发生的集体重排现象（图3D）。可使用基质探针检测基质成分：WGA标记多糖表位，BOBO-3标记丰富的胞外DNA，而蛋白特异性染料在细胞相关信号之外贡献甚微（图3E）。结果不理想的情况包括堆叠过薄或不连续、以碘化丙啶信号为主、严重光漂白或增益设置不一致，这些因素均会削弱定量比较的可靠性。在激光功率、探测器增益和针孔大小保持恒定的条件下，结合分析厚度、生物体积及活/死细胞比例，可确认生物膜成熟状态，并支持与扫描电镜超微结构及结晶紫生物量的直接比较。
生物膜形成过程 钩端螺旋体 通常会经历不同的阶段，但具体时间和数值可能因物种或品系而异。使用 L. interrogans 以参考菌株 Manilae L495 为例，预期在 21 天内的发展过程包括初始阶段（第 0–3 天），此阶段细菌主要呈浮游状态，生物膜形成极少（图4A）。随后进入指数生长期（第3-7天），浮游细菌和生物膜相关细菌数量均增加，达到约9 × 10⁸ 个细胞/mL，并伴随生物膜聚集体的形成与扩展。在第7至12天期间，浮游细菌数量显著下降，而生物膜相关细菌数量达到峰值，约占总菌群的80%。最后，在成熟期（第12-21天），生物膜细菌数量减少，浮游细菌数量未见回升，但生物膜的尺寸和结构复杂性持续增加。观察这一系列变化表明，该方案能够有效捕捉生物膜动态发育与成熟过程 钩端螺旋体 生物膜
当操作正确时，感染程序使用含有约 2 x 10⁸ 条钩端螺旋体的接种物，溶于 200 µL EMJH 培养基中，接种物来源于明确定义的浮游培养物（5 天）或生物膜培养物（21 天）。尽管这两种培养类型代表了不同的生理状态，但这种差异是有意设计的，因为实验旨在确定 钩端螺旋体 生物膜——以代谢活性降低和结构分化为特征——仍保留引发感染的能力。转录组学研究证实了这一差异，显示浮游状态与生物膜状态之间基因表达存在显著变化 钩端螺旋体35,36生物膜聚集体被小心收集，以保持其结构完整，经21 G针头推注后仍保持完整，注射前已确认。图4C，D）。腹腔注射后，金黄叙利亚仓鼠通常在3至5天内表现出钩端螺旋体病的临床症状（如精神萎靡、毛发竖立、卧地不动）。仅注射EMJH培养基的阴性对照组动物未见任何疾病症状。临床症状的发展进程和严重程度以及安乐死时间与接种物有关：浮游细菌通常引起更早且更急性的症状，而生物膜来源的聚集体可能引起延迟但持续的感染（图4B每日监测两次，持续最长21天，可完整捕捉疾病发展全过程。
<img alt="Bacterial growth analysis; absorbance graph, agar plate colony images, SEM results of biofilm structures." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig2.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="Figure 2"> 
图2结晶紫染色、定量分析及超微结构成像 钩端螺旋体 生物膜。（A）在不同基质上生长的生物膜经结晶紫（CV）染色。 CV染色可实现对不同物种和底物的生物膜结构及初始附着模式的可视化。 L. interrogans 在聚碳酸酯滤膜上；ii. L. biflexa 在聚碳酸酯滤膜上；iii. L. interrogans 在玻璃盖玻片上；iv. L. biflexa 在玻璃盖玻片上。 （B）通过结晶紫吸光度（OD570 nm）测定生物膜形成的定量示例 随着时间的推移 L. interrogans 和 L. biflexa该动力学读数可同时捕捉早期黏附和生物量积累的动态过程，凸显了致病性与腐生性物种在生物膜生长方面的差异。该图已根据原图修改。27. (C-E) 扫描电子显微镜（SEM）观察 L. interrogans 生物膜 (c) 3天龄生物膜，显示早期微菌落形成及初始胞外基质沉积；(d) 14天龄生物膜，呈现成熟结构特征，具有大量基质及三维空间组织；(e-f) 3周龄生物膜，表明长期培养下结构的进一步巩固及胞外基质的成熟。结晶紫（CV）染色、定量OD测定与扫描电镜（SEM）成像相结合，可全面概述生物膜从初始黏附至成熟超微结构形成的发育过程，从而实现不同物种及不同培养时长之间的直接比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞生长和形态的显微镜图像；图版序列显示随时间变化的组织结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig3.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="Figure 3"> 
图 3。Leptospira 生物膜形成的可视化。 使用 BioStation 获取的相差图像显示了在 (A) 48 小时、(B) 96 小时和 (C) 144 小时时的生物膜发育情况。(D) Leptospira 生物膜的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）三维重建图像，显示总生物体积及正交切片以实现三维可视化。(E) 成熟生物膜经 DAPI（绿色）和 WGA（红色）染色后的共聚焦图像，分别标记细菌细胞和胞外基质成分。本图经修改自37。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="生物膜生长曲线和存活率图，405 nm 吸光度随时间变化，实验装置试管，样品。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69511/69511fig4.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 4"> 
图 4．浮游和生物膜组分的时间分辨定量分析及Leptospira生物膜的功能评估。 （A）通过405 nm吸光度测定的生物膜形成动力学。在每个时间点，从整个孔、生物膜组分以及含有浮游钩端螺旋体的上清液中读取数据，从而区分附着细菌与自由游动细菌。（B）注射生物膜聚集体、浮游钩端螺旋体或EMJH对照后仓鼠的典型存活曲线。注射生物膜的动物毒力降低，部分可存活21天，而注射浮游钩端螺旋体则导致快速死亡。（C-D）生物膜完整性的初步验证：注射前可在注射器中观察到聚集体（C），且在通过21 G针头后仍保持完整（D，白色箭头），证实生物膜结构在操作过程中得以保留。本图经修改自36。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69511/69511fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案提供了一种模块化的生物安全二级（BSL-2）工作流程，结合结晶紫生物量测定、延时相差动力学分析、共聚焦三维/基质成像、扫描电镜超微结构观察以及一种 体内 仓鼠感染模型用于培养、定量、表征及研究 钩端螺旋体 生物膜功能作用，支持在不同实验室间对突变体和抗生物膜干预措施进行标准化评估。

一种用于Leptospira生物膜定量、结构与功能分析的模块化工作流程

在此，我们介绍一套整合的实验方案，用于钩端螺旋体的培养、定量监测、结构与功能表征。

我们将生物膜视为能够促进环境和宿主中持久存在的保护性结构，研究其形成动态、分子组成、适应性特征及其在感染中的作用。在实验室中结合结晶紫生物膜检测、时间序列成像、共聚焦显微镜、扫描电子显微镜和转录组学技术，通过整合性的多维度分析推动生物膜研究。首先，在平底螺旋盖玻璃试管中，使用EMJH培养基培养钩端螺旋体细胞。在30摄氏度下有氧条件下静置培养菌液，直至其达到对数生长中期。确保菌液在405纳米处的光密度值介于0.2至0.4之间，相当于每毫升含有2×10⁸至5×10⁸个细胞。在20倍放大倍率下使用暗视野显微镜观察，确认细胞呈典型形态且无成团现象。将处于对数中期且无节律性生长的已验证培养物用新鲜EMJH培养基按1:100的比例稀释，使浓度约为每毫升1×10⁶个细胞，并通过轻轻颠倒混匀，切勿涡旋振荡。接着使用无菌镊子将一张0.1微米的无菌亲水性聚碳酸酯膜平整地放置于无菌24孔板（带盖）每个孔的底部。向每孔加入1毫升无菌EMJH培养基，在30°C条件下预浸泡膜2小时。接下来，从每个孔中移除浸泡液，注意不要移动膜的位置，然后加入1.5毫升稀释的细菌悬液，确保膜牢固地保持在孔底。随后，将一个盛有水的托盘放入培养箱内以维持湿度。将培养板置于30°C条件下静置培养，以促进生物膜的形成。对于生长缓慢的菌株，可将培养板放置长达三周。在所需时间点，小心吸出尽可能多的培养基，注意不要扰动生物膜。用一毫升无菌 PBS 轻柔地冲洗每个孔，同时保持膜紧贴底部。 向每个孔中加入 1 毫升含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，在 37 摄氏度孵育 30 分钟，以固定生物膜样本。孵育结束后，移除固定液，并用 1 毫升 PBS 轻柔冲洗两次。向每个孔中加入 1 毫升 0.1%（质量体积比）结晶紫溶液，在室温孵育 15 分钟，确保盖玻片完全浸没。然后弃去每孔中的结晶紫染液，并用一毫升 PBS 洗涤两次。倾斜培养板，沥干所有残留液体。将培养板置于室温下自然晾干，直至底物完全干燥，最好过夜晾干。接下来，向每个孔中加入500 µL洗脱缓冲液，该缓冲液由体积比50%乙醇和50%冰醋酸组成。反复吹打混匀，以充分溶解生物膜中结合的染料。然后，将每个样品中的200 µL转移至光学透明的96孔微孔板中。在570纳米处测定吸光度，并从经过所有步骤处理的未接种对照组中减去背景值。记录至少三次技术重复的平均值和标准差。按照之前所示方法获取培养板中的生物膜。向孔中加入含有4%多聚甲醛和1%戊二醛的0.2摩尔磷酸钠缓冲液（pH 7.4）。将固定后的样品在37摄氏度下孵育30分钟。去除固定液，并用PBS冲洗样品两次，以保留表面附着的生物膜，同时尽量减少脱落。现在将盖玻片浸入用 PBS 稀释的 1% 四氧化锇溶液中，孵育一小时，以增强扫描电子显微镜的对比度。随后用 PBS 冲洗基底两次。依次将样品浸入梯度乙醇系列中，每个浓度浸泡 10 分钟，进行脱水处理。接下来，加入 500 µL 六甲基二硅氮烷，孵育 5 分钟。然后更换为新鲜的六甲基二硅氮烷，再孵育额外 5 分钟。之后，去除多余的溶液，将样品置于通风橱中完全自然晾干。现在使用双面导电碳胶带将干燥的样品固定到扫描电子显微镜样品台（stub）上。对样品进行溅射镀膜，覆盖一层约10纳米厚的金或铂，以增强成像时的电子反差。最后，将制备好的样品台装入扫描电子显微镜中，并使用合适的样品 holder 进行固定。如果可能，将样品室抽真空过夜，以提高成像质量。然后使用合适的放大倍数，在5至15千伏条件下采集二次电子图像，以观察生物膜的超微结构。经过21天培养后，结晶紫染色在钩端螺旋体（leptospira interrogans）和双曲钩端螺旋体（leptospira biflexa）的聚碳酸酯滤膜和玻璃盖玻片上均显示出可见的生物膜形态。每种物种均表现出独特的结构特征，如点状、分支状或网状形态。在所有时间点，弯曲钩端螺旋体生物膜在570纳米处的吸光度值均高于问号钩端螺旋体，表明前者结晶紫滞留量更高，生物量积累更多。扫描电子显微镜观察问号钩端螺旋体生物膜显示：3天龄生物膜中已出现早期胞外基质沉积；14天时形成具有三维结构的成熟且具通道的基底层；至21天时，基质完全整合，结构致密，发育成熟。我们优化的实验方案通过同步来自相同培养物的互补性读数，提高了结果的稳健性，降低了变异性，并揭示了单一方法难以获取的动态与结构信息。通过整合互补性分析，我们的研究实现了生物膜评估的标准化，阐明了钩端螺旋体的动态行为与结构特征，将结构特征与毒力关联起来，并增强了可重复的比较性研究。未来的研究将通过构建突变体来关联调控机制与生物膜的形态及动态变化，阐明生物膜在环境中的持久性，并评估破坏生物膜信息传递或促进其分散的策略。

a-modular-workflow-for-quantitative-structural-functional-analysis

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一个用于钩 端螺旋体 生物膜定量、结构和功能分析的模块化工作流程

在牙面形成的生物膜具有高度复杂性，并持续暴露于各种内在和外源性的环境挑战中，这些挑战会调控其结构、生理状态及转录组。我们开发了一套工具箱，用于研究口腔生物膜的组成、结构组织及基因表达，该工具箱亦可适用于其他生物膜研究领域。...

用于全面分析由变异链球菌介导的口腔生物膜的生化、结构及转录组学评估工具箱

本文描述了一种合成操纵子的设计，该操纵子编码卷曲纤维的分泌装置及其结构单体。E.

通过构建单个合成卷曲菌毛操纵子工程化黏附性细菌

本文介绍了一种同时定量和比较生物膜中三种细胞内及细胞外组分的实验方案。该方法涉及共聚焦激光扫描显微镜、生物膜结构分析与可视化软件以及统计分析软件的使用。...

生物膜中细胞与胞外组分的同时定量

本方法学论文的目的是介绍一种微流控系统的使用，用于构建包含人类龈上牙菌斑中常见菌种的多物种生物膜。 文中重点阐述了描述生物膜结构、生物膜活性的方法，以及一种用于培养依赖性或培养非依赖性分析的生物膜收获技术。...

高通量技术的应用 体外 用于构建口腔多物种生物膜的微流控系统

本研究介绍了可重复方法的开发，用于研究生物膜抑制剂及其对生物膜的影响 枯草芽孢杆菌...

研究方法学 枯草芽孢杆菌 生物膜作为小分子生物膜抑制剂表征的模型

本方案描述了一种在真菌菌丝上培养并利用共聚焦显微镜和电子显微镜对细菌生物膜进行定性分析的新方法。...

一种利用共聚焦显微镜和电子显微镜对丝状真菌菌落上细菌生物膜进行定性多尺度分析的新方法

我们介绍了微生物菌落生物膜的固定、石蜡包埋和切片技术。在制备好的样品中，可通过显微镜观察生物膜的亚结构及报告基因表达模式。...

微生物菌落生物膜的石蜡包埋与显微切片技术用于显微分析

细菌细胞成像是一种新兴的系统生物学方法，旨在解析调控大型大分子机器功能的静态与动态过程。本文通过整合定量活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术，用于研究Legionella pneumophila...

应用活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析时空动态特征的 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统

抗菌剂诱导的变化 铜绿假单胞菌 不同临床分离株在囊性纤维化及慢性肺部感染患者培养物中的生物膜结构存在差异。经共聚焦显微镜观察后，可利用 COMSTAT...

量化抗菌剂的影响 体外 使用 COMSTAT 软件分析生物膜结构

本文描述了Caffrey膜结构与功能生物学研究组采用的手动设置膜蛋白在脂质介相中结晶实验的步骤。...

利用脂质介相结晶膜蛋白以进行结构测定

了解钩端螺旋体生物膜定量分析方法，结合结晶紫染色、共聚焦显微镜和扫描电镜技术，建立标准化模块化工作流程，用于研究生物膜结构与功能及其在感染中的作用。

一种用于Leptospira生物膜定量、结构与功能分析的模块化工作流程

探索更多视频