用荧光素酶在小鼠细菌性感染的形象

生物发光细菌感染在动物活体成像的方法进行了阐述。病原体被修改，以表达荧光素酶，使光全身显像在活的动物感染。荧光素酶表达的病原体可感染动物模型和疾病过程中产生的生物发光成像在实时可视化。

以下实验的总体目标是获得活体动物感染的定量图像，该图像可以允许在宿主组织和器官内定位感染生物体。麻醉小鼠首先在气管内感染生物发光细菌。然后给受感染的小鼠注射 Luciferian，这样就可以在 IVIS 系统中进行实时成像。

获得全身图像后，就会采集受感染的肺部。可以对分离的器官进行成像，以证明病原体的真实定位。成像后，将肺匀浆并稀释接种在细菌生长培养基上以定量微生物载量。

最终，获得的结果可以实时显示宿主中存在的病原体的位置和数量。与现有方法相比，该技术的主要优点是可以通过实时成像来可视化和监测活体动物中的病原体，从而深入了解微生物感染的空间指标。演示此程序的将是我实验室的博士后研究员 Mihi Chang 博士和我实验室的研究员 SWAT Cillo。

从腹膜内开始，向 6 至 12 周龄的瓣膜 C 小鼠注射预混麻醉溶液，每克小鼠体重含有 100 微克氯胺酮和 10 微克甲苯噻嗪。将小鼠放回笼子中，直到麻醉剂生效。要确定麻醉是否完全，请挤压每只鼠标的脚垫，确保没有发生踏板反射反应。

一旦动物完全麻醉，取一只老鼠并将其放在插管上。仰卧站立。使用胶带将鼠标的腿和手臂固定在支架上。

将橡皮筋固定在插管架上。然后将其放在鼠标的上门牙下方。一旦鼠标固定，用镊子轻轻地将舌头从嘴中拉出。

接下来，用耳镜轻轻地将窥器插入小鼠的嘴内，找到位于口咽腹侧食道前方的喉口。确定喉口后，将一根 22 号的 1 英寸导管插入气管，其中包含导丝，直到导管座到达切牙。拆下导丝并将导管连接到塑料泵。

然后将空气推入导管。如果插管正确，小鼠的胸部会膨胀。一旦确认导管的正确放置，将 50 微升所需浓度的生物发光细菌溶液移液到导管中，并连接一个装有 50 微升空气的 1 毫升注射器，将溶液推入小鼠的肺部。

取出导管两到三次，将鼠标放回笼子中，让它从麻醉中恢复过来。在进行生物发光成像之前，使用异氟醚麻醉小鼠。一旦小鼠完全麻醉，将它们从诱导室中取出并轻轻涂抹光学软膏以保护动物的眼睛。

在成像过程中，将小鼠放在成像室中，并将麻醉歧管上的一个鼻锥放在成像室中。在小鼠之间使用挡光板，以防止相邻动物受试者之间的光反射。最后，向每只小鼠腹膜内注射每克体重 150 微克的 Lucifer。

让路西法在动物体内分散 10 分钟。然后开始成像。启动活体成像软件并初始化 IVIS 成像系统。

要先设置参数，请单击 sequence setup。然后选择发光和照片成像模式。选择摄影发光和结构光图像作为图像序列的一部分，以启用 DLIT 3D 重建。

接下来，将曝光时间设置为 1 分钟。然后将像素合并调整为中等，将 F 制光圈调整为 1。将激发滤光片设置为块，将发射滤光片设置为打开以进行 3D 重建，从而启用不同波长的多个滤光片。

为了准确定位信号源，请选择与正在可视化的小鼠数量相对应的 FOV。定义所有设置后，在采集控制面板的图像向导中单击添加以添加序列设置，然后单击采集以在采集过程中开始成像序列。在编辑图像窗口中记录实验详细信息和条件并保存图像。

最后，将小鼠从成像室中取出并放回笼子中。持续监测动物，直到它们从麻醉中恢复过来。对于组织成像，对小鼠进行人道安乐死。

此时，无菌收获每只小鼠的肺并将器官转移到无菌培养皿中。将含有受感染肺的培养皿放入成像室中，并以本视频前面所述的相同方式获取生物发光图像。获得图像后，从成像室中取出培养皿，使用无菌镊子，使用均质器将肺部转移到含有 1 毫升无菌 PBS 的试管中，使肺部匀浆 2 至 5 分钟。

在无菌 PBS 中制备肺匀浆的连续稀释液。然后将 100 μL 的每种稀释液接种到含有选择性培养基的培养皿上。在 37 摄氏度下孵育培养物，直到细菌菌落清晰可见。

然后计算 CFU 以评估感染程度。启动 Living Image 软件并从文件浏览器中打开所需的图像文件。在工具调色板中。

单击图像调整以修改校正和过滤设置以及色阶阈值。要量化发光强度，请使用感兴趣区域或 ROI 下拉列表中的 ROI 工具，选择 ROI 形状编号和大小。然后单击 ROI 测量并保存定量数据输出以重建 3D 图像。

首先，加载图像序列，包括结构光图像。单击工具选项板中的表面地形。然后在下拉列表中，选择 reconstruct 选项卡以生成表面形貌。

接下来，从工具调色板中选择 DILT 3D 重建。单击下拉列表中的属性选项卡，然后将组织属性和源光谱设置为 muscle。单击 analyze（分析）选项卡，然后选择要分析的波长。

然后单击 start。调整完所有设置后，单击 reconstruct 开始 3D 分析。3D 重建完成后，单击结果选项卡选择 3D 视图以显示结果，可以查看光子密度、数据体素和算法参数，保存结果并导出数据和图像以供进一步分析。

如图所示，右侧的两只小鼠在气管内感染了 10 到 6 CFU 的生物发光细菌，从肺部区域产生强烈的信号，而左侧未感染的小鼠则不会。类似的分析仅使用受感染小鼠的解剖肺证实，发光来自肺部，而不是来自其他一些紧密并列的组织。从样品发出的信号可以很容易地量化为感兴趣区域内的总通量。

断层扫描分析证实，这些图像中显示的红框发光位置位于由 3D 重建确定的包含小鼠肺的区域内。最后，左侧测得的光子密度曲线与右侧模拟的光子密度曲线之间的相似性证明了重建的良好质量。观看此视频后，您应该对如何对感染先例的动物进行成像并分析图像以进行定位和量化回忆。