Name: 用荧光素酶在小鼠细菌性感染的形象 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习利用荧光素酶对小鼠细菌性感染进行活体成像的技术。通过气管内接种发光细菌并结合IVIS系统，研究人员可实时追踪病原体在宿主肺部的定位与动态变化，为感染性疾病研究提供定量分析方法。

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作者感谢Cirillo实验室成员在本研究过程中提供的宝贵讨论和帮助。我们感谢Joshua Hill博士以及James Samuel博士实验室在本实验方案拍摄过程中提供的协助。本研究由比尔及梅琳达·盖茨基金会资助项目（项目编号48523）以及美国国立卫生研究院资助项目（项目编号AI47866）提供经费支持。

1. 经气管插管进行肺部感染
<ol>
<li>称重小鼠，必要时可在耳朵上做标记以便于识别。</li>
<li>通过腹腔注射给予氯胺酮（100 μg 每克小鼠体重）和赛拉嗪（10 μg 每克小鼠体重）以麻醉小鼠。</li>
<li>将小鼠放入笼中，直至完全麻醉。挤压其足垫以检查足底反射，小鼠应表现为反射减弱或无反射反应。</li>
<li>将小鼠仰卧位放置于插管架上。</li>
<li>将橡皮筋固定在插管架上，然后将其置于小鼠上门齿下方。使用胶带将小鼠的四肢固定在插管架上。</li>
<li>使用镊子轻轻将舌头移出口腔。</li>
<li>将带有耳镜的扩张器插入小鼠口腔内，观察口咽部，直至可见喉部开口。</li>
<li>将套有导管的引导丝推进气管，直至导管接头处到达门齿位置。取出引导丝，向导管内注入空气，观察胸部是否扩张，以确认插管位置正确。</li>
<li>使用1 mL注射器通过导管注入50 μL细菌溶液（图中所示为本实验室构建的表达红萤光素酶（CBRLuc）的卡介苗（BCG），但也可使用其他发光细菌菌株）。</li>
<li>将小鼠放回笼中，并在麻醉恢复期间进行观察。</li>
</ol>
2. 动物麻醉及生物发光成像前准备
使用 XGI-8 气体麻醉系统通过异氟烷对小鼠进行麻醉。
<ol>
<li>操作 XGI-8 麻醉系统前，称量每个活性炭过滤罐的重量，并在罐体上记录重量和日期。若其重量超过初始重量 50 克，则需更换新的过滤罐。</li>
<li>检查蒸发器中的异氟烷液位，必要时进行补充。</li>
<li>打开 XGI-8 麻醉系统前方的排风泵，并将流速设定为 8 lpm（升/分钟）。</li>
<li>打开高压氧气瓶的氧气供应，并将压力设定为 55 psig。</li>
<li>打开 XGI-8 麻醉系统前方的氧气开关（绿色）。</li>
<li>打开至成像室的气体流量，以设定气体流速。先设定为 0.25 lpm，然后关闭气体流量。</li>
<li>打开至麻醉诱导室的气体流量，以设定气体流速。先设定为 1.5 lpm，然后关闭气体流量。</li>
<li>打开蒸发器中的异氟烷，浓度设定为 2–2.5%。异氟烷浓度可根据所用动物数量及其体重进行适当调整。</li>
<li>将小鼠放入诱导室并盖上盖子，然后打开至诱导室的气体流量。使小鼠在室内停留 5–10 分钟，直至完全麻醉。</li>
<li>在小鼠眼部涂抹眼用软膏以保护其眼睛，并将小鼠放入成像室的麻醉多通路装置中的一个鼻罩内。在小鼠之间使用光屏蔽板，以防止光线反射至相邻的动物受试者。</li>
<li>通过腹腔注射给予荧光素（150 μg/克体重）。</li>
</ol>
3. 生物发光成像
<ol>
<li>启动活体成像软件。</li>
<li>如果系统尚未初始化，请初始化 IVIS 成像系统。</li>
<li>在 IVIS 采集控制面板中点击“序列设置”以设定成像参数。 
在成像模式中选择生物发光和摄影成像。若需进行 DLIT 三维重建，请将摄影图像、生物发光图像和结构光图像均纳入成像序列。 
将曝光时间设置为 0.5 秒至 10 分钟。 
根据样本预期亮度设置 binning 和 F/stop 参数。 
将激发滤光片设为“阻断”，发射滤光片设为“开放”，除非仅需采集特定波长的光信号。若进行 DLIT 三维重建，需设置多个不同波长的发射滤光片，以实现光源的精确定位。 
根据待成像小鼠数量或动物体表区域，将视场（FOV）设为 A 至 D 级别：单只小鼠选择 A 或 B，2–3 只小鼠选择 C，4–5 只小鼠选择 D。</li>
<li>在采集控制面板的图像向导中点击“添加”，将序列设置加入成像程序。</li>
<li>点击“采集”开始成像序列。 
若进行 DLIT 三维重建，系统将针对不同波长的多个发射滤光片分别采集生物发光图像，同时采集摄影图像和结构光图像。</li>
<li>采集过程中，“图像”和“编辑图像信息”面板将保持可见。请在“编辑图像信息”中尽可能详细填写每次实验的相关信息，以便后续图像的追踪管理，并及时保存图像数据。</li>
<li>从小动物成像舱中取出小鼠，并将其放回笼中。观察小鼠从麻醉中恢复的情况，确保其未受到显著影响。动物需持续监测直至完全清醒（通常为 1–2 分钟）。</li>
</ol>
4. 离体 肺部细菌定量的成像与菌落形成单位分析
<ol>
<li>在安乐死前，以与成像时相同的方式向小鼠腹腔注射荧光素酶底物（luciferin）。</li>
<li>在注射荧光素酶底物5分钟后，通过腹腔注射100 mg/kg戊巴比妥钠（pentobarbitol）对小鼠实施安乐死。</li>
<li>使用无菌镊子和剪刀从小鼠体内取出肺组织，并置于无菌培养皿中。</li>
<li>将含有离体器官的培养皿放入成像室，以与活体小鼠成像相同的方式采集生物发光图像。</li>
<li>成像完成后，使用无菌镊子将离体器官从培养皿中取出，并在1 mL PBS中进行匀浆处理。</li>
<li>进行系列稀释后，将组织样品接种至适当的選擇性培养基上。若需重新接种，匀浆后的组织样品可保存于-80°C。此外，匀浆组织也可用于RNA或DNA提取，通过qPCR定量细菌数量。</li>
</ol>
5. 生物发光成像分析
<ol>
<li>启动“Living Imaging Software”并浏览图像文件。</li>
<li>使用“Tool Palette”调整图像。点击“Image Adjust”以修改校正/滤波设置以及单个颜色标度的最小/最大值。</li>
<li>使用下拉列表中的ROI工具对光强度进行定量分析。选择ROI的形状、数量和大小。将ROI框拖动到图像上的目标区域。确保所有ROI具有相同的大小和形状。点击ROI测量，并保存、复制和/或导出定量数据。</li>
<li>对于DLIT 3D重建，加载包含结构光图像的图像序列。在“Tool Palette”中点击“Surface topography”。在下拉列表中，点击“Reconstruct”选项卡以生成表面拓扑图。随后窗口中将显示一个表面网格。</li>
<li>在“Tool Palette”中选择DLIT 3D重建。在下拉列表中，点击“Properties”选项卡以设置组织属性和光源光谱，大多数情况下推荐使用肌肉参数。在下拉列表中，点击“Analyze”选项卡以选择分析波长。点击“Parameter”选项卡，确认默认值或根据需要调整DLIT参数。点击“Reconstruct”选项卡以开始3D分析。</li>
<li>当3D重建完成后，3D视图将显示重建结果。点击“results”选项卡，查看光子密度、体素及DLIT算法参数的分析数据。</li>
<li>将3D重建分析的结果保存和/或导出为图像和数据文件。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
感染了生物发光细菌的小鼠以及未感染的小鼠对照组的生物发光图像如图1所示。经肺部感染生物发光细菌的小鼠在肺部产生显著的发光信号（图1）。发光强度以感兴趣区域（R.O.I，region of interest）内的总通量进行量化（图2）。为确认信号来源于生物发光细菌并可与阴性对照进行比较，将光强度的定量数据根据从肺组织获得的细菌菌落形成单位（CFU）进行归一化处理。可通过基于小鼠体表断层扫描的DLIT三维重建进一步分析信号的位置和强度11。这些分析方法可实现对生物发光信号的定量与定位。对感染小鼠体内发光源进行三维重建的结果表明，光信号来源于小鼠的肺部（图3）。小鼠肺组织的离体（ex vivo）成像结果进一步证实，发光信号来自肺组织，而非其他邻近组织或器官（图2C）。
<img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="活体成像；小鼠荧光强度，背侧、腹侧、左侧、右侧视图；科研分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 携带CBRluc标记的生物发光细菌感染小鼠的肺部感染发光成像。 左侧为未感染的对照小鼠，右侧为两只感染小鼠。通过气管内途径感染表达CBRluc的细菌（n=2）。注射荧光素10分钟后，在四个位置（背侧、腹侧、左侧和右侧）采集发光图像，持续10分钟。 
<img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="小鼠生物发光成像；背侧、腹侧视图，肺部；荧光强度测量；柱状图结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 表达 CBRluc 的细菌感染小鼠后获得的定量光强度。 （A, B）分别来自背侧和腹侧位置的小鼠感兴趣区域（ROI）分析的发光图像，以及ROI内光总通量的定量结果。左侧为未感染小鼠，右侧为两只感染小鼠。发光图像采集自未感染及感染CBRlux的小鼠肺部（n=2）。通过ROI分析对肺部周围光强度进行定量。C）未感染（上方）与感染（下方两组肺组织）小鼠肺部的离体（ex vivo）成像。在安乐死前5分钟注射荧光素，随后进行图像采集。定量数值已根据CFU进行归一化处理。
<img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="光子密度模拟，实测值与模拟值对比；三维图、图形分析、光学研究结果。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 来自肺部感染小鼠的生物发光源的三维重建。 通过气管内注射表达CBRluc的细菌使小鼠感染。使用从540 nm到700 nm的系列波长的不同发射滤光片采集图像序列。该图像序列用于含有结构化图像的动物体内发光源的三维重构。A) 显示小鼠在不同视角下的断层成像：前视、后视、左视和右视。光源显示为体素（三维小鼠内部的红色方框），经重建确定其位于肺部。B) 实测与模拟数据的光子密度图。通过比较实测与模拟的光子密度曲线可评估重建质量。高质量的重建结果表现为实测与模拟的光子密度曲线高度相似。

<ol><li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li>
<li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).</li>
<li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li>
<li>Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+coding+click+beetle+luciferases+can+elicit+bioluminescence+of+different+colors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors.</a> Science. 244, 700-702 (1989).</li>
<li>Wet, J. R. de, Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+firefly+luciferase+cDNA+and+the+expression+of+active+luciferase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).</li>
<li>Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistries+and+colors+of+bioluminescent+reactions%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review.</a> Gene. 173, 5-11 (1996).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).</li>
<li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li>
<li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).</li>
</ol>

动物实验按照德克萨斯大学奥斯汀分校机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee of Texas A&amp;M大学

尽管遵循这些方案通常能够获得高质量的图像，但为了从成像研究中获取准确且一致的数据，仍需考虑一些关键问题。发光图像的计数值应控制在600至60,000之间，以确保信号高于背景水平且相机未发生饱和。若获得的信号低于600，应调整曝光条件以提高计数值；若信号超过60,000，则表明相机在某些区域已饱和。当相机饱和时，不应在饱和区域进行定量分析，但在非饱和区域仍可进行定量，有时也必须进行。此外，若用于三维重建掩膜的区域内包含饱和区域，则无法准确完成三维重建。通过调整图像采集时的曝光时间、像素合并（binning）和光圈值（F/stop），以及修改成像区域或动物体位，可控制所获得的信号，从而实现数据的定量分析。因此，在许多实验中，建议在多种曝光条件下持续对动物进行成像，以确保至少有一组图像处于可进行定量分析的所需范围内。
需要牢记的是，任何报告基因的表达都可能影响细菌的毒力，因此有必要开展预实验，评估用于成像的重组菌株中报告基因对适应性的潜在影响。这是生物发光成像的局限性之一，因为它需要在细菌中表达外源基因。这一问题通常可通过使用针对目标细菌物种优化密码子使用的构建体、滴定报告基因的表达水...

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>MP Biomedicals</td><td>158307</td><td></td></tr><tr><td>荧光素</td><td>GMT</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清溶液</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>导管（22G × 1&amp;#8221;）</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>导丝</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3491</td><td></td></tr><tr><td>带窥器的八爪仪</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3748</td><td></td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 系统</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XGI-8 气体麻醉系统</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>活体成像软件</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明鼻罩</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光屏蔽隔板</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用荧光素酶对小鼠细菌感染进行成像

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

成像是一种可用于监测生物过程的重要技术。特别是，可以在活体动物体内实时追踪癌细胞、干细胞、特定免疫细胞类型、病毒病原体、寄生虫和细菌的存在1-2。与动物模型中分析感染的传统策略相比，将生物发光成像应用于病原体研究具有诸多优势3-4。感染可在同一只动物体内随时间推移被连续可视化观察，无需通过安乐死来确定病原体的位置和数量。光学成像能够对所有组织和器官进行全面检查，而非仅限于已知先前受感染部位的取样。此外，在继续实验前，可直接确认病原体是否成功接种至特定组织，从而排除接种失败的动物。由于成像技术可对每只动物进行个体化追踪，因此可有效控制动物间的个体差异。成像技术有望显著减少所需实验动物数量，因其能够在多个时间点获取数据，而无需通过组织取样来测定病原体载量3-4。
本实验方案描述了利用生物发光成像技术对表达荧光素酶的重组细菌菌株进行活体动物感染可视化的方法。荧光甲虫（CBRLuc）和萤火虫荧光素酶（FFluc）以荧光素为底物5-6。CBRluc 和 FFluc 产生的光波长范围广泛，介于 500 nm 至 700 nm 之间，因此这些荧光素酶非常适合作为活体动物模型光学成像的报告分子7-9。这主要是因为波长大于 600 nm 的光可避免被血红蛋白吸收，从而更有效地穿透哺乳动物组织。通过基因工程手段将荧光素酶导入细菌，使其产生可检测的发光信号10。通过气管内接种的方式将生物发光细菌接种至小鼠肺部，以实现实时监测感染过程。注射荧光素后，使用 IVIS 成像系统采集图像。成像过程中，采用 XGI-8 气体麻醉系统以异氟烷对小鼠进行麻醉。所获得的图像可用于定位和定量发光信号源，分别代表细菌感染部位及细菌数量。成像结束后，对匀浆组织进行菌落形成单位（CFU）测定，以确认细菌的存在。通过使用多种剂量的细菌，建立细菌数量与发光强度之间的相关性。该成像技术可用于病原机制研究以及抗菌化合物和疫苗疗效的评估。

本文描述了在活体动物中进行细菌感染生物发光成像的方法。通过改造病原体使其表达荧光素酶，从而实现对活体动物体内感染的光学整体成像。可利用表达荧光素酶的病原体感染动物模型，并通过生物发光成像实时观察疾病的发展过程。

成像是一种可用于监测生物过程的有价值技术。特别是，癌细胞、干细胞、特定……的存在

以下实验的总体目标是获得活体动物感染的定量图像，从而能够定位病原体在宿主组织和器官中的分布。首先通过气管内接种的方式使小鼠感染发光细菌，随后向感染小鼠注射荧光素（Luciferin），以便在IVIS系统中进行活体成像。获取全身图像后，采集受感染的肺组织。可对分离的器官进行成像，以显示病原体的真实定位。成像完成后，将肺组织匀浆，并在细菌培养基上进行梯度稀释涂布，以定量分析微生物载量。最终获得的结果可实时显示病原体在宿主内的位置和数量。该技术相较于现有方法的主要优势在于，可通过实时成像在活体动物中对病原体进行可视化观察和动态监测，从而深入了解微生物感染的空间动态特征。本次实验操作将由本实验室的博士后研究员 Mihi Chang 博士和研究人员 SWAT Cillo 演示。首先，对6至12周龄的C型小鼠进行腹腔注射，注射液为预混的麻醉剂，每克小鼠体重含100微克氯胺酮和10微克赛拉嗪。将小鼠放回笼中，直至麻醉生效。为确认麻醉是否完全，可轻捏每只小鼠的足垫，确保无踩踏反射反应。待动物完全麻醉后，取一只小鼠放置于插管台上，使其仰卧。使用胶带将小鼠的四肢固定在台面上。将橡皮筋固定在插管架上，然后将其置于小鼠的上门齿下方。待小鼠固定后，用镊子轻轻将舌头从口中拉出。接下来，将带有耳镜的阴道扩张器轻柔地插入小鼠口腔内，找到位于食管前方、口咽部腹侧的喉部开口。确定喉部开口后，将一根带有导丝的22号一英寸导管插入气管，直至导管接头处到达门齿。取出导丝，将导管连接至塑料泵。然后将空气推入导管。如果插管位置正确，小鼠的胸部会膨胀。确认导管位置正确后，用移液器吸取50 µL所需浓度的生物发光细菌溶液，注入导管中，并连接一个装有50 µL空气的1 mL注射器，将溶液推入小鼠肺部。两到三次，拔出导管并将小鼠放回笼中，使其从麻醉状态中恢复。在进行生物发光成像前，使用异氟烷对小鼠进行麻醉。待小鼠完全麻醉后，将其从诱导室中取出，并轻轻涂抹眼用油膏以保护动物的眼睛。成像过程中，将小鼠逐一放入成像室，并连接麻醉气体混合装置上的一个鼻罩。在小鼠之间使用遮光挡板，以防止相邻动物之间产生光线反射。最后，每只小鼠按每克体重150微克的剂量经腹腔注射Lucifer。让荧光素在动物体内扩散10分钟，然后开始成像。启动活体成像软件并初始化IVIS成像系统。首先设置参数，点击序列设置。然后选择发光成像和摄影成像模式。在图像序列中选择摄影发光图像和结构光图像，以启用DLIT 3D重建。接下来，将曝光时间设置为一分钟。然后将像素合并（binning）调整为中等，光圈值（F-stop）调整为一。将激发滤光片设置为阻断状态，发射滤光片设置为开启状态，以实现三维重建，并启用多个不同波长的滤光片。为了准确定位信号源，请选择与所观察小鼠数量相对应的视野（FOV）。所有参数设置完成后，点击采集控制面板中图像向导的“添加”按钮，以加入序列设置，然后点击“采集”按钮开始成像过程。在编辑图像窗口中记录实验细节和条件，并保存图像。最后，将小鼠从成像室中取出并放回笼中。持续监测动物，直至其从麻醉状态中恢复。如需进行组织成像，应人道处死小鼠。此时，无菌条件下取出每只小鼠的肺组织，并将器官转移至无菌培养皿中。将含有感染肺组织的培养皿放入成像室，并按照本视频前面所述方法采集生物发光图像。获得图像后，将培养皿从成像室中取出，使用无菌镊子将肺组织转移至含有1 mL无菌PBS的离心管中，使用匀浆器匀浆2至5分钟。用无菌 PBS 对肺组织匀浆进行系列稀释。然后取每种稀释液 100 微升接种于含有选择性培养基的培养皿中。将培养物在 37°C 条件下孵育，直至细菌菌落清晰可见。然后计数菌落形成单位（CFU）以评估感染程度。启动活细胞成像软件，并通过文件浏览器打开所需的图像文件。在工具面板中。单击图像调整以修改校正和滤波设置以及颜色标度阈值。为量化发光强度，从下拉列表中选择感兴趣区域（ROI）工具，选定ROI的形状编号和大小。然后单击ROI测量，并保存定量数据输出以重建3D图像。首先，加载图像序列，包括结构光图像。在工具面板中点击表面形貌。然后在下拉列表中，选择重建选项卡以生成表面形貌。接下来，从工具栏中选择 DILT 三维重建功能。在下拉列表中点击属性选项卡，并将组织属性和光源光谱设置为肌肉。点击分析选项卡，然后选择用于分析的波长。然后点击开始。所有设置调整完毕后，点击重建以启动三维分析。三维重建完成后，选择三维视图，通过点击结果标签查看结果，可查看光子密度、数据体素和算法参数，保存结果并导出数据和图像以供进一步分析。如图所示，右侧两只通过气管接种了10的6次方CFU生物发光细菌的小鼠，其肺部区域产生强烈的信号，而左侧未感染的小鼠则无此信号。仅对感染小鼠的离体肺组织进行类似分析，可进一步证实发光信号来源于肺组织，而非其他邻近组织。样品发出的信号可轻松量化为感兴趣区域内的总通量。断层扫描分析证实，这些图像中以红色方框显示的发光位置位于通过三维重建确定的小鼠肺部区域之内。最后，左侧测得的光子密度曲线与右侧模拟的光子密度曲线之间的相似性表明重建结果具有良好的质量。观看本视频后，您应能够充分理解如何对感染病原体的动物进行成像，并对图像进行分析以实现发光信号的定位与定量。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

用荧光素酶在小鼠细菌性感染的形象

本文介绍了将携带lux标记的细菌给予小鼠，并随后使用IVIS生物发光成像进行活体分析的方法。...

活体生物发光细菌成像 In Vivo

来源： Valentine, M. E., 等 框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的小鼠感染模型中检测毒力减弱情况。 J. Vis. Exp.

利用生物发光技术追踪小鼠体内细菌感染动态

来源：de Vries, C. R., et al., 一种迟发接种的慢性Pseudomonas aeruginosa伤口感染模型。J. Vis. Exp. (2020)。本视频展示了一种生物发光成像技术，用于监测活体小鼠模型中细菌感染的进展。携带 luxABCDE...

小鼠细菌感染的生物发光成像

来源： Valentine, M. E. 等人，框内基因缺失突变体的构建 铜绿假单胞菌 并在简单的感染小鼠模型中检测毒力减弱情况。 J. Vis. Exp.

利用生物发光技术在小鼠模型中对细菌感染进行实时成像

来源：Luyts, N., et al. 利用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗进行纵向随访。J. Vis. Exp. (2021)。本视频展示了利用生物发光的E.

利用生物发光技术在小鼠模型中可视化尿路感染

本视频展示了一种利用表达重组荧光素酶和荧光蛋白的双报告流感病毒A在小鼠模型中追踪病毒感染的方法。该方法可同时用于活体（in vivo）和离体（ex...

一种带有荧光素酶-荧光报告基因的流感病毒用于追踪病毒感染

多模态成像是研究小动物模型中细菌定植的一种有价值的方法。本方案概述了用生物发光的鼠柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）感染小鼠，并利用融合三维漫射光成像断层扫描与μCT成像技术对细菌定植进行长期监测，从而生成鼠柠檬酸杆菌（C.

4D 多模态成像 鼠伤寒柠檬酸杆菌 小鼠感染

利用生物发光细菌实时观察肺炎链球菌毒力因子在急性小鼠肺炎模型中的影响

我们描述了利用报告酶荧光（REF）对感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tuberculosis）的小鼠进行光学成像的方法。该方案有助于在结核病发病机制、治疗及疫苗研究的临床前动物模型中，实现对M.

成像 结核分枝杆菌 在携带报告酶荧光的小鼠中

甲型流感病毒（IAV）是具有传染性的呼吸道病原体，可引起每年的流行和偶发的大流行。本文介绍了一种利用新型重组荧光素酶和荧光双报告甲型流感病毒（BIRFLU）在活体中追踪病毒感染的实验方案。该方法为研究人员提供了在活体内研究甲型流感病毒的优良工具。...

一种用于活体成像与病毒侵染定量检测的荧光素酶-荧光报告流感病毒

本论文描述了通过膀胱内给予携带lux操纵子的尿路致病菌以在小鼠中诱导尿路感染，并利用生物发光成像对细菌载量进行后续的纵向体内分析。...

利用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗进行纵向随访

学习利用荧光素酶对小鼠细菌性感染进行活体成像的技术。通过气管内接种发光细菌并结合IVIS系统，研究人员可实时追踪病原体在宿主肺部的定位与动态变化，为感染性疾病研究提供定量分析方法。

利用荧光素酶对小鼠细菌感染进行成像

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