En utilisant la luciférase aux infections bactériennes chez les souris image

Méthodes pour l'imagerie par bioluminescence des infections bactériennes chez les animaux vivants sont décrits. Les agents pathogènes sont modifiées pour exprimer la luciférase permettant d'imagerie optique du corps entier des infections chez les animaux vivants. Les modèles animaux peuvent être infectés par des pathogènes exprimer la luciférase et le cours résultant de la maladie de visualiser en temps réel par imagerie par bioluminescence.

L’objectif global de l’expérience suivante est d’obtenir une image quantitative d’une infection chez des animaux vivants qui peut permettre de localiser l’organisme infectieux dans les tissus et les organes de l’hôte. Les souris anesthésiées sont d’abord infectées par voie intratrachéale par des bactéries bioluminescentes. Les souris infectées sont ensuite injectées avec du Luciférian, ce qui permet d’effectuer une imagerie en direct dans le système IVIS.

Une fois que des images du corps entier ont été obtenues, les poumons infectés sont prélevés. L’imagerie des organes isolés peut être effectuée pour démontrer la véritable localisation de l’agent pathogène. Après l’imagerie, les poumons sont homogénéisés et dilués sur un milieu de croissance bactérienne pour la quantification de la charge microbienne.

En fin de compte, on obtient des résultats qui montrent l’emplacement et le nombre d’agents pathogènes présents dans l’hôte en temps réel. Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode existante est que les agents pathogènes peuvent être visualisés et surveillés chez les animaux vivants par imagerie en temps réel, ce qui donne un aperçu des tics spatiaux de l’infection microbienne. La démonstration de cette procédure sera assurée par le Dr Mihi Chang, boursier postdoctoral dans mon laboratoire, et SWAT Cillo, un chercheur de mon laboratoire.

Commencez par voie intrapéritonéale, en injectant à des souris de la valve C âgées de six à 12 semaines une solution anesthésique prémélangée contenant 100 microgrammes de kétamine et 10 microgrammes de xylazine par gramme de poids de souris. Remettez les souris dans leurs cages jusqu’à ce que l’anesthésique fasse effet. Pour déterminer si l’anesthésie est complète, pressez le repose-pieds de chaque souris et assurez-vous qu’aucune réaction réflexe de pédale ne se produit.

Une fois que les animaux sont complètement anesthésiés, prenez une souris et placez-la sur l’intubation. Tenez-vous allongé sur le dos. Utilisez du ruban adhésif pour fixer les jambes et les bras de la souris sur le support.

Fixez un élastique au support d’intubation. Placez-le ensuite sous les incisives supérieures de la souris. Une fois la souris immobilisée, utilisez une pince pour retirer doucement la langue de la bouche.

Ensuite, insérez doucement le spéculum avec l’otoscope à l’intérieur de la bouche de la souris et trouvez l’ouverture du larynx, qui est située devant l’œsophage sur la face ventrale de l’oropharynx. Une fois l’ouverture du larynx identifiée, insérez un cathéter de calibre 22 d’un pouce contenant un fil-guide dans la trachée jusqu’à ce que le moyeu du cathéter atteigne les incisives. Retirez le fil de guidage et connectez le cathéter à la pompe en plastique.

Poussez ensuite l’air dans le cathéter. La poitrine de la souris se gonflera si l’intubation est correcte. Une fois que le placement correct du cathéter a été confirmé, pipetez 50 microlitres de solution bactérienne bioluminescente à la concentration souhaitée dans le cathéter, et fixez une seringue d’un millilitre avec 50 microlitres d’air pour pousser la solution dans les poumons de la souris.

Deux ou trois fois, retirez le cathéter et remettez la souris dans sa cage pour lui permettre de se remettre de l’anesthésie. Avant d’effectuer l’imagerie de bioluminescence, anesthésie les souris à l’aide d’isoflurane. Une fois les souris complètement anesthésiées, retirez-les de la chambre d’induction et appliquez doucement une pommade optique pour protéger les yeux de l’animal.

Pendant l’imagerie, placez les souris dans la chambre d’imagerie chacune et l’un des cônes nasaux sur le collecteur d’anesthésie. Utilisez un déflecteur de lumière entre les souris pour éviter la réflexion de la lumière entre les sujets animaux adjacents. Enfin, injectez à chaque souris intrapéritonéale 150 microgrammes par gramme de poids corporel de Lucifer.

Laissez le Lucifer se disperser dans le corps de l’animal pendant 10 minutes. Ensuite, commencez l’imagerie. Démarrez le logiciel d’imagerie vivante et initialisez le système d’imagerie IVIS.

Pour régler les paramètres d’abord, cliquez sur configuration de la séquence. Sélectionnez ensuite le mode d’imagerie de luminescence et de photographie. Sélectionnez des images photographiques luminescentes et lumineuses structurelles dans le cadre de la séquence d’images pour permettre la reconstruction 3D DLIT.

Ensuite, réglez le temps d’exposition sur une minute. Ajustez ensuite le binning sur moyen et le F-stop sur un. Réglez le filtre d’excitation sur bloquer et les filtres d’émission sur s’ouvrir pour la reconstruction 3D pour activer plusieurs filtres de différentes longueurs d’onde.

Pour permettre une localisation précise de la source du signal, sélectionnez le FOV correspondant au nombre de souris visualisées. Une fois tous les paramètres définis, cliquez sur Ajouter dans l’assistant d’image du panneau de configuration d’acquisition pour ajouter la configuration de la séquence et cliquez sur Acquérir pour commencer la séquence d’imagerie pendant l’acquisition. Enregistrez les détails et les conditions de l’expérience dans la fenêtre d’édition de l’image et enregistrez les images.

Enfin, retirez les souris de la chambre d’imagerie et remettez-les dans leurs cages. Surveillez constamment les animaux jusqu’à ce qu’ils se remettent de l’anesthésie. Pour l’imagerie tissulaire, euthanasiez les souris sans cruauté.

À ce stade, prélevez aseptiquement les poumons de chaque souris et transférez les organes dans une boîte de Pétri stérile. Placez la boîte de Pétri contenant les poumons infectés à l’intérieur de la chambre d’imagerie et acquérez des images de bioluminescence de la même manière que décrite précédemment dans cette vidéo. Une fois les images obtenues, retirez la boîte de Pétri de la chambre d’imagerie et, à l’aide d’une pince stérile, transférez les poumons dans un tube contenant un millilitre de PBS stérile à l’aide d’un homogénéisateur et homogénéisez les poumons pendant deux à cinq minutes.

Préparer la dilution en série des homogénats pulmonaires dans du PBS stérile. Plaquez ensuite 100 microlitres de chaque dilution sur des boîtes de Pétri contenant un milieu sélectif. Incuber les cultures à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les colonies bactériennes soient clairement visibles.

Comptez ensuite l’UFC pour évaluer le niveau d’infection. Démarrez le logiciel d’image animée et ouvrez les fichiers d’image souhaités à partir du navigateur de fichiers. Dans la palette d’outils.

Cliquez sur ajuster l’image pour modifier les paramètres de correction et de filtrage ainsi que les seuils de l’échelle de couleurs. Pour quantifier l’intensité de la luminescence, utilisez la région d’intérêt ou les outils de ROI dans la liste déroulante, sélectionnez le numéro de forme et la taille de la ROI. Cliquez ensuite sur Mesure du retour sur investissement et enregistrez les données quantitatives pour reconstruire des images 3D.

Tout d’abord, chargez la séquence d’images, y compris les images de lumière structurées. Cliquez sur Topographie de surface dans la palette d’outils. Ensuite, dans la liste déroulante, sélectionnez l’onglet reconstruire pour générer une topographie de surface.

Ensuite, sélectionnez Reconstruction 3D DILT dans la palette d’outils. Cliquez sur l’onglet Propriétés dans la liste déroulante et définissez les propriétés des tissus et le spectre source sur Muscle. Cliquez sur l’onglet Analyser et sélectionnez la longueur d’onde pour l’analyse.

Cliquez ensuite sur démarrer. Une fois tous les paramètres ajustés, cliquez sur reconstruire pour lancer l’analyse 3D. Une fois la reconstruction 3D terminée, sélectionnez la vue 3D pour afficher les résultats en cliquant sur l’onglet résultats, la densité de photons, les voxels de données et les paramètres de l’algorithme peuvent être visualisés, enregistrez les résultats et exportez les données et les images pour une analyse plus approfondie.

Comme le montre cette figure, les deux souris de droite qui ont été infectées par voie intratrachéale avec 10 à la sixième UFC de bactéries bioluminescentes produisent un signal fort de la région pulmonaire, alors que la souris non infectée de gauche ne le fait pas. Une analyse similaire utilisant uniquement des poumons disséqués de souris infectées confirme que la luminescence émane des poumons plutôt que d’un autre tissu étroitement juxtaposé. Le signal émanant de l’échantillon peut facilement être quantifié comme un flux total dans une région d’intérêt.

Une analyse tomodensitométrique confirme que la position de la luminescence affichée dans ces images sous forme de cases rouges se situe dans la zone contenant les poumons de la souris telle que déterminée par la reconstruction 3D. Enfin, la similitude entre la courbe de densité de photons mesurée à gauche et la courbe de densité de photons simulée à droite atteste de la bonne qualité de la reconstruction. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’imager les animaux infectés par des antécédents et d’analyser les images pour la localisation et la quantification de la réminiscence.