弹性PGS的动脉组织工程支架
2011年4月8日
弹性的PGS在脉动流生物反应器培养的血管平滑肌细胞的生物支架，可能会导致在一个相对较短的文化时期的本地流脑生产的直径有前途的小动脉结构。
本视频展示了如何制造多孔管状支架，并对其进行动脉组织工程的动态机械调节。这是通过首先使用可生物降解的弹性体和突击熔融方法制造支架来实现的。然后准备用于细胞接种的支架，并组装到生物反应器系统中。
在生物反应器中，血管平滑肌细胞接种支架并进行培养。几周后，收获组织并使用扫描电子显微镜、h 和 e 染色以及弹性蛋白自发荧光进行分析。由此产生的平滑肌既是多层的，又是垂直的。
这种技术存在的主要优点就像颗粒漂白一样，是用玻璃模具制造它多孔管状支架和透明质酸。当模具删除时，脚手架模具由一根玻璃管制备。将管子放入支架中，将前一天准备好的透明质酸溶液倒入管中。
透明质酸沿着内壁缓慢向动。当它到达模具底部时，将模具翻转过来。重复此步骤，直到模具的内壁被溶液均匀涂覆。
涂布后，将所有准备好的玻璃模具放入 37 摄氏度的真空烘箱中干燥 24 小时。通常，在玻璃模具干燥时同时准备四个模具。将盐颗粒倒入、研磨并制备 SVE 盐颗粒至 25 至 32 微米。
第二天，组装准备好的玻璃模芯轴、PTFE 管、热缩套管和 PTFE 环。首先，将心轴装入 65 毫米长的 PTFE 管中，并在 120 摄氏度下烘烤 5 分钟。为了在战前等待时收缩 PTFE，请在 37 摄氏度的杂交培养箱中至少放置 30 分钟。
一旦管子包裹了心轴，将热缩套管推到心轴上，使其自由移动。然后将心轴放入玻璃模具内，并将 A-P-T-F-E 环连接到心轴底部。检查 PTFE 环是否紧贴玻璃模具的底部。
接下来，使用抹刀和硅橡胶漏斗，将盐粒粥加入玻璃模具中。然后用抹刀轻轻敲击模具，使颗粒分布均匀，并刮掉多余的盐。现在关闭加热的培养箱并快速加载它 用盐填充的模具，盐将在接下来的 30 分钟内熔化，然后将模具在 37 摄氏度的真空烘箱中干燥 24 小时。
冷却后的第二天，将不锈钢心轴推出，同时固定 PTFE 环，将其从模具中取出。如果需要，使用尖嘴钳。然后从模具底部取下 PTFE 环。
接下来，烘烤模具以收缩套筒并从模具中取出收缩的套筒。让模具冷却直到使用，然后将它们存放在通风橱的干燥液中。使用 apo 滴管将玻璃模具倾斜 45 度，并将 PGS 溶液滴入其内腔，同时缓慢旋转模具。
检查 PGS 溶液是否沿模具壁向动。如果有干燥点，添加更多 PGS 现在让 THF 在通风橱中蒸发至少 30 分钟。THF 消失后，在真空烘箱中固化模具。
固化一天后，将模具冷却至室温，然后缓慢地将其垂直浸入 24 摄氏度的去离子水中。过快地倾斜它们会产生气泡，从而撕裂脚手架。小心地将模具转移到水浴中。
使用硅胶管将它们以一定角度放置，并让透明质酸溶解一个多小时。如果一个小时后透明质酸仍未从模具中释放出来，那么在模具仍然浸没的情况下，用抹刀慢慢将透明质酸从两端推开，然后慢慢摇动模具。现在，检查脚手架是否没有在玻璃模具内移动，如果是，请用镊子慢慢拉动脚手架，将其从模具中释放出来。
接下来，小心地将精致的支架转移到去离子水浴中，轻轻搅拌，以浸出盐颗粒。这至少需要三天时间，并且需要每天换水 盐全部浸出后，将每个支架转移到装满去离子水的 15 毫升离心管中，并在干冰盒中冷冻一小时。将冷冻的离心管放入冻干机中，打开盖子放置 3 天。
冷冻干燥后，将支架存放在干燥物中，直到使用完为止。首先将支架切割成 25 到 30 毫米长。接下来，将 PTFE 管穿过每个塞子的中间孔，准备两个硅橡胶塞子。
然后剪下一毫米半长的 hs 环，并将一段滑到脚手架的一端。将一根连接到塞子的 PTFE 管推入脚手架的同一端，重叠量刚好在 HS 环下方，以将脚手架牢固地连接到管道上，在烘箱中收缩 HS 环，让组件冷却至室温。现在，一根 50 毫米的聚碳酸酯管（用作生物反应器室）滑过支架并固定在硅橡胶塞的内表面。
和以前一样，另一个 PTFE 管和塞子用 hs 环固定在脚手架的另一端，以完成腔室。第二个塞子连接到聚碳酸酯管的另一端。接下来，将塞子的外表面连接到两块铝合金板上。
将两根螺纹杆送入每块板的侧孔中，并用翼形螺钉固定板。将支架连接到生物反应器上。现在测量每个脚手架的可见长度，即两个 hs 环之间的距离，并计算它们的内表面积。
用于细胞接种。在高压灭菌器中，对每个腔室以及生物反应器单元的每个部分单独用箔纸包裹的腔室进行灭菌。灭菌后，将生物反应器组装在细胞培养罩内。
在流动回路中使用蠕动泵以每分钟 1 毫米的速度，通过一系列灌注对支架进行预处理和冲洗。首先用 70% 乙醇、50% 乙醇和 25% 乙醇冲洗一小时。在三次乙醇冲洗之后，进行 2 小时的 PBS 冲洗。
最后，用 SMC 培养基灌注生物反应器 24 小时，然后即可进行细胞接种和实验。现在按照随附手稿中的说明，以每平方厘米 200 万个细胞的密度接种生物反应器，并在接下来的 21 天内更换管道介质并调整泵速。逐渐地，构建体中的压力将从培养第一天的约 4 毫米汞柱增加到培养两周后的 100 毫米汞柱以上，培养三周后，收获细胞并按照随附手稿的规定准备用于分析。
这些管状 PGS 支架是通过盐熔融法制备的。扫描电子显微照片表明，所有支架均具有均匀的壁厚，横截面无局部缺陷。在所有支架的管腔表面观察到随机分布的宏观和微孔。
细胞培养后，多层 SMC 以垂直于流向的方向生长。此外，细胞和 DCM 蛋白完全覆盖了所有 PGS 构建体的内腔。弹性蛋白自发荧光还在结构的管腔表面显示圆周组织的弹性纤维。
看完这个视频，你应该已经了解了如何制作多孔管状支架，看到细胞和培养支架使用预先设计的生物反应器。
概述
本研究展示了使用生物可降解弹性体制造动脉组织工程的多孔管状支架。支架与血管平滑肌细胞在脉动流生物反应器中培养，在短期培养期内产生天然细胞外基质。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 生物材料
- 血管生物学
背景
- 弹性体支架对于创建小直径动脉结构至关重要。
- 动态机械调节增强组织发展。
- 血管平滑肌细胞在支架整合中起着关键作用。
- 天然ECM的产生对于功能性组织工程至关重要。
研究目的
- 制造和调节用于动脉应用的多孔管状支架。
- 评估工程结构中血管平滑肌细胞的活力和功能。
- 评估生物反应器环境中天然ECM的产生。
使用的方法
- 使用生物可降解弹性体和盐粒子浸出法制造支架。
- 在脉动流生物反应器中进行动态机械调节。
- 使用血管平滑肌细胞进行细胞播种。
- 使用扫描电子显微镜和组织学染色分析收获的组织。
主要结果
- 成功制造了多层和定向平滑肌组织。
- 展示了细胞在支架内的有效整合。
- 生产了具有显著天然ECM特征的支架。
- 建立了一种可靠的方法来创建小直径动脉结构。
结论
- 该研究为动脉组织工程提供了一种有前景的方法。
- 动态调节显著增强了组织发展。
- 未来的应用可能包括血管移植物的临床转化。
常见问题
Executive Industry Relevance
Elastomeric scaffold technologies address critical limitations in small-diameter arterial graft development by improving compliance and reducing thrombotic risk. This approach supports predictive confidence in preclinical vascular models through enhanced extracellular matrix deposition and cellular alignment under physiological mechanical conditioning. The method enables mechanistic de-risking of arterial tissue constructs prior to lead identification stages in cardiovascular therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular smooth muscle cell responses to elastomeric substrates and dynamic mechanical cues.
- Operational Value: Provides reproducible porous tubular scaffolds with consistent wall thickness for standardized preclinical testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable extracellular matrix outputs including elastin autofluorescence and collagen deposition for assay readiness.
- Operational Value: Supports scalable scaffold fabrication via salt fusion method for multi-well or bioreactor-integrated screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates perfusion-conditioned smooth muscle alignment and multilayered tissue formation relevant to native artery morphology.
- Operational Value: Establishes a bioreactor-compatible workflow for longitudinal assessment of graft maturation and mechanical stability.
Pipeline & Workflow Integration
The scaffold fabrication and conditioning process integrates into early discovery workflows by providing compliant, thromboresistant vascular models for target validation and lead optimization in arterial disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of elastomeric biomaterials on vascular cell phenotype and extracellular matrix production.
- Screening: Enables standardized assessment of scaffold-cell interactions under pulsatile flow conditions for assay reproducibility.
- Analytics: Delivers quantitative readouts including elastin deposition, cell orientation, and scaffold porosity for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-stage scaffold maturation to preclinical continuity through native-like tissue development under mechanical conditioning.
- Enterprise Reuse: Positions the salt fusion and bioreactor conditioning method as a reusable platform for multiple vascular tissue engineering initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in graft performance through compliance-matched elastomeric scaffolds and physiological conditioning.
- Operational Value: Standardized, reproducible scaffold fabrication with tunable porosity and thickness for cross-team consistency.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk via early identification of non-thrombogenic, elastogenic vascular constructs.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of arterial graft candidates based on preclinical extracellular matrix maturation and cellular alignment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial synthesis, scaffold fabrication, and bioreactor operation.
- Depends on vacuum ovens, perfusion systems, and histological analysis infrastructure.
- Necessitates standardization of salt particle size, PGS solution concentration, and conditioning duration across laboratories.
- Involves adaptation considerations for different cell types or vessel diameters beyond baboon smooth muscle cells.
- Practical limitations include multi-day salt leaching and lyophilization steps affecting throughput.
