工程双层凝胶控制升序分化

该程序的总体目标是创建由天然生物材料制成的复合基质，可用于递送和分化干细胞以帮助伤口愈合。这是通过首先从测试动物中分离脂肪来源的干细胞或 SC 来实现的。接下来，将 A SC 加载到预制的壳聚糖微球上。

然后灌输原纤化胶原凝胶，并将 A-S-C-C-S-M 珠子分层在胶原凝胶上。最后，将 PEG 纤维蛋白凝胶浇铸在 A-S-C-C-S-M 胶原凝胶上，并加入培养基。最终，可以获得显示 A SC 从 CSM 微珠到胶原蛋白和 PEG 纤维蛋白基质的双向同时迁移的结果。

通过该程序，单个干细胞来源可以从胶原蛋白和 PEG 纤维蛋白微环境中获取不同的线索，并受到差异刺激以产生多效性因子并形成血管前结构网络。与现有方法（如单一材料复合材料或脱细胞皮肤替代品）相比，该技术的主要优点是这些其他产品不会主动解决宿主对产品的血运重建。当我们注意到分离的 RAD A SE 在猪纤维蛋白基质中培养时具有向维管表型分化的倾向时，我们第一次想到了这种方法。

这一观察结果激发了这样一个概念，即单个干细胞来源可以在由不同生物材料组成的系统中同时利用。分离和培养脂肪来源的干细胞或 ASC 后，制备壳聚糖微球或 CSM 并将 ASC 加载到 CSM 中，通过将琥珀酰过剩降额改性 PEG 溶解在 4 毫升 tris 缓冲盐水中来制备聚乙二醇、纤维蛋白水凝胶。在实验之前，使用 0.22 微米过滤器对溶液进行消毒。

在六孔板混合物的培养孔中，将 500 μL 纤维蛋白原原液和 250 μL PEG 原液在 5% 二氧化碳加湿培养箱中于 37 °C 孵育 20 分钟。接下来，将 250 微升先前制备的 A-S-C-C-S-M 与聚乙二醇化纤维蛋白原溶液混合，立即加入 1 毫升凝血酶原液，并使用移液管快速三倍速一次或两次立即将细胞凝胶混合物放入 12 孔板中，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳加湿室中孵育 10 分钟。接下来，用 HBSS 洗涤所得的 peg 纤维蛋白两次，并在 37 摄氏度下使用标准光学显微镜技术在 5% 二氧化碳加湿培养箱中与补充有 10% FBS 的 α 最低必需培养基一起孵育 11 天。

观察细胞从 CSM 迁移到凝胶混合物中，A-S-C-C-S-M 与使用两种正常氢氧化钠从大鼠尾筋中提取的 1 型胶原蛋白。将 pH 值调节至 6.8 并产生原纤化。将原纤化胶原蛋白、A-S-C-C-S-M 混合物添加到 12 孔板中，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳加湿培养箱中孵育 30 分钟。

检查原颤完成后，将胶原蛋白 A-S-C-C-S-M 凝胶在 11 摄氏度的 5% 二氧化碳加湿培养箱中孵育长达 37 天。使用标准显微镜技术观察细胞在 11 天内从 CSM 迁移到凝胶中的情况，以开发双层构建体，以研究单一来源干细胞的迁移和共诱导特性。使用两个生物支架。

准备胶原蛋白和 PEG 纤维蛋白凝胶，并进行以下轻微修改，每毫升胶原蛋白制备一毫升 7.5 毫克。然后将混合物转移至六孔组织培养小室中，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。完全颤动后，在培养基中涂上 200 微升 5 毫克 A-S-C-C-S-M。

微球在凝胶上沉淀后，使用 250 μL 细胞培养基制备 PEG 纤维蛋白凝胶。然后将聚乙二醇化纤维蛋白原凝血酶溶液铺在 A-S-C-C-S-M 胶原蛋白层上。完成后，将构建体在 5% 二氧化碳加湿培养箱中孵育 30 分钟以达到完全。

最后，在构建体上方的上腔室中放置 1 毫升培养基，在下腔室中放置 3 毫升培养基。嵌入该支架中的 SC 的表征表明，加载 SC 的 CSM 可以同时夹在一层胶原蛋白和挂钩纤维蛋白之间，并且不同地从两种细胞外环境中获取线索，在新的条件下茁壮成长。如此处所示，胶原蛋白支持 ASC 保留干细胞的能力，它们以绿色表达 stro one 以及它们的成纤维细胞样形态证明了这一点。

相比之下，PEG 纤维蛋白诱导 ASC 分化为无血管表型，如此处所示的管状形态，包括管腔及其内皮细胞特异性表达 von Willow brandand 因子，此处以红色显示。此外，如此处所示，这些观察到的表型似乎发生在培养的早期，并维持了 11 天以上。观看此视频后，您应该对如何分离大鼠脂肪来源的干细胞，将它们加载到 chito 和微球上，并使用 FDA 批准的生物材料将它们掺入双层水凝胶中有一个很好的了解。

不要忘记，本协议中使用的生物材料和细胞来自动物和人类，如果它们被来自宿主的病原体污染，可能会非常危险。在执行这些程序时，应始终采取预防措施，例如个人防护设备和无菌细胞培养技术。