Name: 工程双层凝胶控制升序分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学习利用胶原蛋白、纤维蛋白和壳聚糖构建双层复合基质，同时引导脂肪来源干细胞向不同表型分化，促进皮肤伤口愈合与血管再生。该方法为组织工程研究提供了多功能平台。

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S.N. 获得匹兹堡组织工程倡议博士后奖学金资助。D.O.Z. 获得日内瓦基金会资助项目的资助。

1. 分离脂肪来源的干细胞（ASCs）1, 5
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
 <li>分离大鼠的肾周脂肪和附睾脂肪，并用含1%胎牛血清（FBS）的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤，方法如前所述5。本研究的实施符合《动物福利法》、《动物福利条例》以及《实验动物护理与使用指南》中的原则。</li>
 <li>将组织切碎，取1-2 g转移至含有25 mL含1% FBS的HBSS的50 mL离心管中，室温下以500 g离心8分钟。</li>
 <li>收集漂浮的脂肪组织层，转移至125 mL锥形瓶中，加入25 mL含II型胶原酶（200 U/mL）的HBSS，在37 °C、125 rpm的摇床上消化45分钟。</li>
 <li>小心吸取下层液体部分（位于油层和脂肪组织层下方），依次通过100 μm和70 μm的尼龙筛网过滤。滤液在室温下以500 g离心10分钟，吸除上清液，并用25 mL HBSS重悬沉淀物洗涤两次。</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于50 mL生长培养基（MesenPRO RS基础培养基）中，该培养基添加有MesenPRO RS生长添加剂、抗生素-抗真菌剂（青霉素G 100 U/mL、硫酸链霉素100 μg/mL和两性霉素B 0.25 μg/mL）以及2 mM L-谷氨酰胺，用移液器将细胞悬液分装至两个T75培养瓶中（每瓶25 mL）。</li>
 <li>将脂肪源性基质细胞（ASC）在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养（所有实验均使用第2至第4代ASC）。</li>
</ol>
2. 壳聚糖微球（CSMs）的制备
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
 <li>采用水包油乳化法结合离子凝聚技术，按照我们先前的方案5制备CSM。将6 mL含3%（w/v）壳聚糖的水溶液（溶于0.5 M乙酸中）加入100 mL油相混合物中进行乳化，油相由大豆油与正辛醇（体积比1:2）以及5%的失水山梨醇单油酸酯（Span 80）乳化剂组成；使用顶置搅拌器（1700 rpm）和磁力搅拌器（1000 rpm）同时反向搅拌。这种双重搅拌方式可确保在交联发生前形成的胶束保持悬浮状态，不会沉降至容器底部。此外，磁力搅拌子有助于在胶束形成和硬化过程中防止壳聚糖聚集。</li>
 <li>持续搅拌混合物约1小时，直至形成稳定的水包油乳液。随后开始离子交联：每隔15分钟加入1.5 mL溶于正辛醇中的1%（w/v）氢氧化钾溶液，共持续4小时（总计24 mL）。</li>
 <li>交联反应完成后，缓慢倾去含有CSM的油相，并立即加入100 mL丙酮，溶液因残留油分而变浑浊。5分钟后倾去丙酮，再加入额外的100 mL丙酮，在室温下孵育过夜。次日，用丙酮再次洗涤微球5分钟。经过上述连续洗涤后，溶液应变为澄清；若仍未澄清，需继续洗涤直至完全去除油分，丙酮溶液清澈透明。</li>
 <li>将回收的微球置于真空干燥器中干燥，无需进一步处理即可进行分析。可使用粒径分析仪测定CSM的平均粒径、每毫克比表面积及单位立方体积。</li>
 <li>用于后续实验时，需用无菌水洗涤CSM三次，以去除残留盐分，并用5 mL无水乙醇洗涤过夜以实现灭菌。</li>
</ol>
3. 测定 CSM 中游离氨基的数量
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
 <li>采用 Bubnis 和 Ofner6 的三硝基苯磺酸（TNBS）法测定离子交联后 CSMs 中游离氨基的数量。将 5 mg 微球与 1 mL 0.5% TNBS 溶液加入 50-mL 玻璃试管中，于 40 °C 孵育 4 h，随后加入 3 mL 6N HCl，在 60 °C 下水解 2 h。</li>
 <li>将样品冷却至室温，加入 5 mL 去离子水和 10 mL 乙醚，萃取游离的 TNBS。</li>
 <li>取 5 mL 水相样品置于水浴中，加热至 40 °C 保持 15 min，以蒸发残留的乙醚，随后冷却至室温，并用 15 mL 水稀释。</li>
 <li>使用分光光度计在 345 nm 处测定吸光度，以不含壳聚糖的 TNBS 溶液作为空白对照，并以用于制备 CSM 的壳聚糖为基准，测定氨基总数，进而估算 CSM 相对于壳聚糖的游离氨基数量。</li>
</ol>
4. 在 CSM 中加载 ASC
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
 <li>将第2.5节中5 mg无菌CSM在无菌HBSS中平衡过夜，然后加入8-μm孔径的膜培养板小室（24孔板）中。</li>
 <li>待CSM沉降到膜上后，小心吸除HBSS，向小室内加入300 μL生长培养基，向小室外侧加入700 μL生长培养基。</li>
 <li>将ASC以适当浓度（1 × 104 至 4 × 104）重悬于200 μL生长培养基中，接种至培养板小室内的CSM上。接种后，培养小室内的终体积为500 μL。</li>
 <li>将接种了ASC的CSM置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养24 h。</li>
</ol>
5. 测定 CSM 中 ASC 的加载率和细胞活力
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
 <li>孵育后，用移液器将载有ASC的CSM转移至无菌的1.5 mL微量离心管中，注意不要扰动已迁移至小室膜内的细胞。</li>
 <li>去除残留培养基，并向管中加入250 μL新鲜生长培养基。</li>
 <li>向每管中加入25 μL MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐] 溶液（5 mg/mL），在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育4小时。</li>
 <li>孵育结束后，吸除培养基，加入250 μL二甲基亚砜，涡旋振荡2–5分钟，以充分溶解甲臜复合物。</li>
 <li>将CSM在2700 g离心5分钟，吸弃上清液，按照MTT试剂生产商的说明，使用标准酶标仪测定其在570 nm和630 nm波长处的吸光度。</li>
 <li>根据已知ASC数量培养所得的标准曲线，确定与CSM相关的细胞数量。</li>
</ol>
6. PEG-纤维蛋白凝胶中嵌入的ASC-CSM的制备与表征
注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。
<ol>
 <li>根据 Suggs et al.7 的方法制备聚乙二醇（PEG）纤维蛋白（PEG-fibrin）水凝胶：将琥珀酰亚胺基戊二酸酯修饰的聚乙二醇（PEG；3400 Da）溶于 4 mL 三羟甲基氨基甲烷缓冲生理盐水（TBS，pH 7.8）中，并在实验开始前用 0.22-μm 滤器过滤除菌。溶解后的 PEG 在本应用中仅在最初 3–4 小时内有效。</li>
 <li>取 500 μl 纤维蛋白原储备液（40 mg/mL，溶于 TBS，pH 7.8）与 250 μl PEG 储备液混合，加入 6 孔板的一个培养孔中，在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育 20 分钟。该混合物的摩尔浓度比为 1:10（SG-PEG-SG : 纤维蛋白原）。</li>
 <li>取 250 μl ASC-CSM 悬液（浓度为 5 mg CSM，约含 2 × 104 个细胞），与 PEG 修饰的纤维蛋白原溶液混合。</li>
 <li>立即加入 1 ml 凝血酶储备液（25 U/mL），用移液器快速吹打混匀 1–2 次。在将凝血酶与 PEG-纤维蛋白原混合后，立即将细胞-凝胶混合物转移至 12 孔板中，并在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育 10 分钟，以完成凝胶化。由于凝胶化速度较快，切勿在移液器吸头中持留凝胶溶液超过 5 秒钟。凝血酶可裂解 PEG 修饰的纤维蛋白原，形成 PEG 修饰的纤维蛋白水凝胶，因此最终的凝胶产物称为 PEG-fibrin。</li>
 <li>用 HBSS 清洗 PEG-fibrin 凝胶两次，随后在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中，用添加 10% 胎牛血清（FBS）的 α 最低必需培养基（α-MEM）孵育。</li>
 <li>采用标准光学显微镜技术，观察 CSM 中细胞在 11 天内向凝胶中的迁移情况。</li>
</ol>
7. 胶原凝胶中嵌入的ASC-CSM的制备与表征
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
 <li> 按照 Bornstein8 的方法，将 ASC-CSM（5 mg，含有约 2 × 104 个细胞）与从大鼠尾腱提取的 I 型胶原蛋白（7.5 mg/mL）混合，并用 2N NaOH 调节 pH 至 6.8 后诱导纤维化。</li>
 <li> 将纤维化的胶原蛋白-ASC-CSM 混合物加入 12 孔板中，在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中孵育 30 分钟。</li>
 <li> 完全纤维化后，在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中继续孵育胶原蛋白-ASC-CSM 凝胶，最长至 11 天。</li>
 <li> 在 11 天内，使用标准显微镜技术观察细胞从 CSM 向凝胶内的迁移情况。</li>
</ol>
8. 双层 PEG-纤维蛋白-(ASC-CSM)-胶原凝胶构建体的制备
注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。
<ol>
 <li>为构建双层结构，按照上述方法制备胶原蛋白凝胶和PEG-纤维蛋白凝胶，但需进行轻微调整。简言之，为利用两种生物支架研究单一来源干细胞的迁移性及共诱导特性，采用四步法将ASC-CSM“夹在”胶原蛋白支架与PEG-纤维蛋白支架之间：1）将ASC接种至CSM上，2）浇铸纤维化胶原凝胶，并将ASC-CSM微球铺于胶原凝胶之上，3）在ASC-CSM-胶原凝胶上浇铸PEG-纤维蛋白凝胶，并使其凝固，4）向孔中加入培养基，以培养细胞 体外 或从插入件中取出 体内 应用（参见 图1). </li>
 <li>按照7.1节所述方法制备1 mL I型胶原蛋白（7.5 mg/mL）混合液，但不向混合液中添加ASC-CSM。将该混合液置于6孔细胞培养插入式培养皿（8-μm 孔径）并在5% CO₂中孵育30分钟2 湿润培养箱中 37 °C.</li>
 <li>完全纤维化后，在胶原表面覆盖5 mg ASC-CSM（10,000 个细胞/mg），该材料悬浮于培养基中200 μl）当微球在凝胶上沉降后，按照第6.0节所述方法制备PEG-纤维蛋白凝胶，但在混合物中不加入ASC-CSM，并将PEG化的纤维蛋白原/凝血酶溶液覆于ASC-CSM-胶原层之上。制备PEG-纤维蛋白凝胶时，使用 250 μl 用细胞培养基替代 250 μl 含细胞的培养基。 </li>
 <li>完成后，将构建物在5% CO₂中孵育30分钟2 将构建物置于湿润培养箱中，待其完全凝胶化后，再加入培养基进行培养。</li>
 <li>完全凝胶化后，在上室中加入1 mL培养基覆盖构建物，在下室中加入3 mL培养基。 </li>
</ol>
9. 配制储备液
注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。
<ul>
 <li>氯化钙储备液（40 mM）：仅使用 CaCl2·2H2O。将 588.4 mg 的 CaCl2·2H2O 溶于 100 ml 去离子水中。使用 0.22-μm 滤器除菌过滤。</li>
 <li>聚乙二醇（PEG）：PEG 对氧气高度敏感，在暴露于空气时易发生氧化。因此，PEG 应在氮气（N2）氛围下保存。准确称取 32 mg 置于 2 ml 离心管中（使用前务必用 N2 吹洗管子），并于 -80 °C 保存直至使用。使用前将 32 mg PEG 溶于 4 mL TBS 溶液中。
 
以下溶液必须在每次实验前新鲜配制。 
 </li>
 <li>TBS 溶液：（25 °C 时 pH 为 7.75–7.77；25 °C 时的 pH 值极为关键）。配制 15 ml TBS 溶液时，将一片缓冲液片剂小心溶解于经滤膜除菌的去离子水中，并调节至所需 pH。切勿储存储备液——每次均需新鲜配制。</li>
 <li>纤维蛋白原溶液：（40 mg/ml）。将纤维蛋白原粉末溶于 TBS 中，使纤维蛋白原浓度达到 40 mg/ml。在 4 °C 下使用磁力搅拌器过夜溶解。将整份 1 g 的粉末与所需体积的 TBS 一同溶解更为方便。次日，将纤维蛋白原从 4 °C 取出（通常呈浑浊状），置于水浴中升温，直至形成均一溶液。最后，使用 0.45-μm 滤器对纤维蛋白原溶液进行除菌过滤。</li>
 <li>凝血酶溶液（25 单位/ml）：配制凝血酶溶液时，称取所需量并用已配制的 40 mM CaCl2·2H2O 溶解。通常建议使用整瓶凝血酶来配制储备液。示例：将一瓶 5 kU 的凝血酶溶于 200 mM 的 CaCl2·2H2O 溶液中，分装后于 -20 °C 保存。</li>
</ul>
10. 代表性结果
本技术的总体目标是展示利用复合干细胞基质（CSM）作为递送载体，实现ASC向多种表型同步基质驱动分化的潜力。我们展示了这一 体外 将源自CSMs的干细胞递送至双层胶原-PEG-纤维蛋白支架的策略。对嵌入该支架中的ASC进行表征发现，负载ASC的CSMs可被“夹”于胶原层与PEG-纤维蛋白层之间，同时分别响应两种不同的细胞外环境信号，从而在新环境中良好增殖。我们首先评估了该模型系统维持细胞活力与迁移能力的效果。胶原基质支持ASC维持其“干性”，这一点通过其Stro-1的表达及成纤维细胞样形态得以证实图2D和2F）。相比之下，PEG-纤维蛋白诱导ASCs向血管表型分化，表现为形成管状结构形态以及特异性表达内皮细胞标志物血管性血友病因子（von Willebrand factor,图2E和2G），以及NG2和血小板源性生长因子受体β（PDGFRβ）在周细胞中的特异性表达（数据未显示）。此外，这些观察到的表型在培养早期即出现，并可持续维持超过11天，如图所示 图3.
表格与图示
双层结构的优点：
<ul>
 <li>仅使用不含细胞的支架即可作为生物活性支架发挥作用。</li>
 <li>PEG-纤维蛋白可在无需添加生长因子的情况下诱导干细胞分化。</li>
 <li>胶原蛋白有助于维持脂肪源性干细胞（ASCs）的干细胞表型。</li>
 <li>双层结构可作为其他细胞类型迁移和增殖的活性基质（例如内皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、平滑肌细胞、周细胞）。</li>
 <li>可与羟基磷灰石或脱矿骨等硬组织工程支架联合使用，以再生硬组织和软组织。</li>
 <li>可用于构建多层、多类型的组织工程结构（如真皮-血管、血管-表皮、真皮-血管-皮下组织等）。</li>
 <li>利用单一细胞来源可同时构建多种细胞区室。</li>
 <li>由于其天然来源，具有与宿主组织整合的潜力。</li>
 <li>凝胶结构内的CSM为细胞迁移提供了起始平台。</li>
 <li>用于制备CSM的壳聚糖是一种广为人知的活性趋化吸引物。</li>
 <li>本方案中应用的“基质驱动干细胞分化”总体理念可推广至其他类型的干细胞，但尚需进一步研究以验证基质驱动分化的可行性。双层凝胶支架可作为细胞递送的储库，实现持续且可控的释放。</li>
 <li>重建后，凝胶仍可被分离为各个独立组分。</li>
</ul>
<img src="/files/ftp_upload/3953/3953fig1.jpg" alt="细胞包封示意图，展示胶原蛋白、PEG化纤维蛋白原步骤及倒置结构组装。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 技术整体目标与流程的示意图。1) 将脂肪来源的干细胞（ASCs）接种至壳聚糖微球上。2) 将胶原蛋白倒入6孔插入式培养皿中，调节pH值使其形成纤维，然后将插入式培养皿置于6孔板腔室中。接着将负载ASC的CSM微球铺在胶原蛋白上。3) 再将PEG化纤维蛋白原溶液倒入胶原蛋白（ASC-CSM）表面，并通过加入凝血酶使其凝胶化。4) 最终形成的双层结构可从培养插入物中取出，用于体外（in vitro）或体内（in vivo）分析。
<img src="/files/ftp_upload/3953/3953fig2.jpg" alt="在显微镜下观察到的细胞分化和形态，突出显示不同细胞阶段。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 在胶原蛋白和 PEG-纤维蛋白 3D 基质中培养的 ASC 的表征。A) 采用常规二维细胞培养技术传代并维持的分离 ASC 的相差显微照片。照片 B、D 和 F 显示在三维胶原凝胶中培养的 ASC-CSM；而 C、E 和 G 显示在三维 PEG-纤维蛋白凝胶中培养的 ASC-CSM，均为第 12 天的结果。在 B 和 C) 中，可见 ASC 从 CSM 球体向外迁移。在胶原蛋白中，ASC 呈扁平、纺锤形形态（B），同时保持干细胞标志物 Stro-1 的表达（D；箭头）。当在 PEG-纤维蛋白中培养时，ASC 表现出更多管状结构，并被诱导表达血管细胞标志物，如冯·维勒布兰德因子（E）。透射电子显微镜显示了 ASC 在每种支架中表现出的典型形态。在胶原凝胶中的 ASC 显示从细胞体延伸出较短的 filopodia（fl）（F），而 ASC 通常形成管腔结构（标记为 L）（G；箭头）。
<img src="/files/ftp_upload/3953/3953fig3.jpg" alt="胶原蛋白与PEG-纤维蛋白凝胶中细胞培养生长比较，第5、7、11天；显微镜图像。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 脂肪源性干细胞细胞球体（ASC-CSMs）在胶原蛋白与PEG-纤维蛋白凝胶双层结构间的形态学分析。将ASC-CSMs“夹在”胶原蛋白与PEG-纤维蛋白凝胶之间，并在体外培养11天。左列显示脂肪源性干细胞在胶原基质内迁移与增殖，呈现纺锤样形态。右列显示脂肪源性干细胞从细胞球体向外迁移，并在PEG-纤维蛋白凝胶中形成管状结构。

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</ol>

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本文所包含的观点或主张均为作者的个人见解，不应被视为官方立场，也不代表美国国防部或美国政府的观点。作者为美国政府雇员，本工作系其履行公务期间完成。所有研究工作均由美国陆军医学研究与物资司令部资助。本研究根据经美国陆军医学研究与物资司令部机构审查委员会审查并批准的方案进行，并严格遵循已批准的方案执行。

ASC 因其易于分离以及向多种细胞类型分化的能力而广为人知。通过本文所述技术，我们能够通过将这些细胞同时暴露于多种生物基质中，以充分利用 ASC 的可塑性。当细胞从其 CSM 基底迁移并进入周围的细胞外环境时，会受到支架材料的信号引导，从而维持“干细胞特性”（胶原）或被诱导分化为血管及支持血管形成的细胞类型（纤维蛋白）。由于本实验室专注于皮肤和软组织创伤修复，我们策略性地采用了胶原与纤维蛋白的双层结构，因为胶原可支持宿主的真皮和表皮再生，而纤维蛋白则天然促进血管网络的形成9。此外，目前人们已认识到增殖中的皮肤角质形成细胞、成纤维细胞与下方血管网络之间存在相互作用，这一复杂机制对实现正常的伤口愈合至关重要10。若缺乏下方的血管网络，组织工程化皮肤移植物将难以与宿主组织建立有效吻合。因此，我们的总体假设是：当胶原与纤维蛋白以双层结构联合 ASC 使用时，可通过改善血管生成、真皮再生及再上皮化过程中的一个或多个阶段，从而缩短伤口愈合时间。
纤维蛋白是一种多功能生物聚合物，由单体纤维蛋白原经凝血酶介导切割释放纤维蛋白肽A后形成。临床上，纤维蛋白已...

<table><tbody><tr><td>汉克斯平衡盐溶液（HBSS）</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14175</td><td>耗材</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>耗材</td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6685</td><td>耗材</td></tr><tr><td>70-&amp;mu;m 尼龙网滤器</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td>耗材</td></tr><tr><td>100-&amp;mu;m 尼龙网滤器</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td>耗材</td></tr><tr><td>MesenPRO 生长培养基系统</td><td>Invitrogen</td><td>12746-012</td><td>耗材</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td>耗材</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>耗材</td></tr><tr><td>T75 组织培养瓶</td><td>BD Biosciences</td><td>137787</td><td>耗材</td></tr><tr><td>壳聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448869</td><td>耗材</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>耗材</td></tr><tr><td>正辛醇</td><td>Acros Organics</td><td>150630025</td><td>耗材</td></tr><tr><td>司盘-80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6760</td><td>耗材</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>耗材</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>L-4859</td><td>耗材</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741</td><td>耗材</td></tr><tr><td>三硝基苯磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2297</td><td>耗材</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>耗材</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472-484</td><td>耗材</td></tr><tr><td>8-&amp;mu;m 组织培养板插件</td><td>BD Biosciences</td><td>353097</td><td>耗材</td></tr><tr><td>1.5-ml 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>耗材</td></tr><tr><td>MTT试剂</td><td>Invitrogen</td><td>M6494</td><td>耗材</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td>耗材</td></tr><tr><td>Qtracker 细胞标记试剂盒（Q Tracker 655）</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>Q2502PMP</td><td>耗材</td></tr><tr><td>I型胶原蛋白</td><td>Travigen</td><td>3447-020-01</td><td>耗材</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>耗材</td></tr><tr><td>12孔组织培养板</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td>耗材</td></tr><tr><td>纤维蛋白原</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3879</td><td>耗材</td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6884</td><td>耗材</td></tr><tr><td>聚乙烯苯并三唑衍生物</td><td>Sunbio</td><td>DE-034GS</td><td>耗材</td></tr><tr><td>Tris缓冲片（pH 7.6）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030</td><td>耗材</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>设备</td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C24</td><td>设备</td></tr><tr><td>带5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;的恒温培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Model 370</td><td>设备</td></tr><tr><td>顶置式搅拌器</td><td>IKA</td><td>Visc6000</td><td>设备</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Corning</td><td>PC-210</td><td>设备</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>-</td><td>-</td><td>设备</td></tr><tr><td>粒径分析仪</td><td>Malvern Instruments</td><td>STP2000 Spraytec</td><td>设备</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp210</td><td>设备</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Beckman Coulter DU 800UV/Visible 分光光度计</td><td>设备</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Diagger</td><td>3030a</td><td>设备</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M2</td><td>设备</td></tr><tr><td>光学/荧光显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX71</td><td>设备</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>FV-500 激光扫描共聚焦显微镜</td><td>设备</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Leo 435 VP</td><td>设备</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEOL 1230</td><td>设备</td></tr></tbody></table>

构建双层水凝胶以调控asc分化

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

多年来，天然聚合物因其良好的宿主生物相容性以及与细胞相互作用的能力而日益受到重视 体外 和 体内 再生医学领域中一个颇具前景的研究方向是新型生物材料与干细胞的联合应用。组织工程领域的一项基本策略是利用三维支架（例如脱细胞细胞外基质、水凝胶、微/纳米颗粒）来引导细胞功能。该技术的发展源于以下发现：细胞需要一种可附着的基质，以实现增殖，并表达其分化的细胞表型与功能。 2-3最近还发现，细胞不仅利用这些底物进行黏附，还会与基质底物（例如细胞外基质，ECM）相互作用并从中获取信号4因此，细胞与支架之间存在一种相互作用的关系，这种关系有助于调控组织的发育、结构构建及最终功能。脂肪来源的干细胞（ASCs）是存在于脂肪组织中的间充质非造血干细胞，具有多向分化潜能，可作为易于获取的细胞来源（例如前血管内皮细胞和周细胞）。我们的假设是，通过将脂肪来源的干细胞简单地在双层基质中进行共培养，即可同时诱导其向不同表型分化。1我们的实验室专注于皮肤伤口愈合研究。为此，我们利用天然生物材料纤维蛋白、胶原蛋白和壳聚糖构建了一种单一复合基质，可模拟皮肤特异性伤口愈合过程中细胞外基质（ECM）环境的特性与功能。

本实验方案重点利用干细胞固有的能力，即响应其周围细胞外基质的信号，进而被诱导分化为多种表型。本方法学论文扩展了我们对一种双层水凝胶模型的描述与表征，该模型由聚乙二醇-纤维蛋白（PEG-fibrin）和胶原蛋白组成，可同时共诱导脂肪来源的干细胞分化1。

构建双层水凝胶以调控ASC分化

多年来，天然聚合物因其良好的宿主生物相容性以及在体外和体内与细胞相互作用的能力而日益受到重视。

本实验的总体目标是构建一种由天然生物材料制成的复合基质，用于递送并诱导干细胞分化，以促进伤口愈合。该目标首先通过从实验动物中分离脂肪来源的干细胞（a SC）来实现，随后将 a SC 接种至预先制备的壳聚糖微球上。然后浇铸纤维化胶原凝胶，并将A-S-C-C-S-M微球铺在胶原凝胶上。最后，在A-S-C-C-S-M胶原凝胶上浇铸PEG纤维蛋白凝胶，并加入培养基。最终可获得结果，显示A SC从CSM微球同时向胶原和PEG纤维蛋白基质中进行双向迁移。通过该操作，单一生源干细胞可接收来自胶原和聚乙二醇纤维蛋白微环境的不同信号，并受到差异性刺激，从而分泌多种效应因子并形成前血管结构网络。该技术相较于现有方法（如单一材料复合物或脱细胞皮肤替代物）的主要优势在于，其他产品无法主动促进宿主对移植物的再血管化。我们最初产生该方法的设想，源于观察到分离的RAD A SE在猪源纤维蛋白基质中培养时，倾向于向血管表型分化。这一观察结果引发了这样的设想：可同时利用单一干细胞来源，在由不同生物材料组成的系统中进行应用。在分离并培养脂肪来源的干细胞（ASCs）、制备壳聚糖微球（CSMs）并将ASCs载入CSMs后，通过将琥珀酰亚胺基谷氨酸酯修饰的聚乙二醇溶解于4毫升三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（Tris缓冲盐水）中，制备聚乙二醇-纤维蛋白水凝胶。在实验开始前，使用0.22微米滤器对溶液进行除菌处理。在六孔板的一个孔中，加入500微升纤维蛋白原储备液和250微升PEG储备液，于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育20分钟。接着，将250微升预先制备的A-S-C-C-S-M与pegylated纤维蛋白原溶液混合，立即加入1毫升凝血酶储备液，使用移液器迅速吹打混匀一至两次，立即将细胞凝胶混合物转移至12孔板中，并于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育10分钟。随后，用HBSS洗涤所得的peg纤维蛋白两次，并加入含10%FBS的α最低必需培养基，在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育，于11天内采用标准光学显微镜技术进行观察。观察细胞从 CSM 迁移至凝胶混合物 A-S-C-C-S-M 的过程，其中 I 型胶原蛋白通过两种正常的氢氧化钠从大鼠尾腱中提取。将 pH 值调节至 6.8 并诱导纤维化。将纤维化的胶原蛋白 A-S-C-C-S-M 混合物加入 12 孔板中，并在 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中孵育 30 分钟。在确认纤维化完成后，将胶原蛋白 A-S-C-C-S-M 凝胶置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育长达11天。利用标准显微镜技术，在11天内观察细胞从CSM向凝胶内的迁移情况，以构建双层结构，研究单一生源干细胞的迁移性及共诱导特性。使用两种生物支架。制备胶原蛋白和PEG纤维蛋白凝胶时进行如下微小修改：制备1毫升浓度为7.5毫克/毫升的胶原蛋白溶液，然后将混合物转移至6孔组织培养插入式培养板中，在37°C下孵育30分钟。完全纤维化后，在胶原蛋白表面覆盖200微升含5毫克A-S-C-C-S-M的培养基。微球在凝胶上沉降后，使用 250 微升细胞培养基制备 PEG 纤维蛋白凝胶。然后将聚乙二醇化纤维蛋白原-凝血酶溶液覆于 A-S-C-C-S-M 胶原层之上。操作完成后，将构建物置于含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中孵育 30 分钟，以实现完全凝固。最后，在上室的构建物上方加入1毫升培养基，下室加入3毫升培养基。对该支架内嵌入的干细胞（SC）进行表征发现，负载干细胞的CSMs可同时被夹在胶原层与PEG纤维蛋白层之间，并能够差异性地接收来自两种不同细胞外环境的信号，从而在其新条件下良好生长。如图所示，胶原支持ASCs保持干细胞特性，这一点通过其绿色显示的Stro-1表达以及成纤维细胞样的形态得以证实。相比之下，PEG纤维蛋白可诱导ASCs向无血管表型分化，如本图所示，细胞呈现管状形态并具有管腔，同时特异性表达内皮细胞标志物冯·维勒布兰德因子（von Willebrand factor），此处以红色显示。此外，如本图所示，这些表型在培养早期即已出现，并可持续维持达11天。观看本视频后，您应能够充分理解如何分离大鼠脂肪来源的干细胞，将其接种至壳聚糖微球上，并利用经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的生物材料将其整合至双层水凝胶中。请注意，本方案中使用的生物材料和细胞来源于动物和人类，如果被宿主的病原体污染，可能具有极高的危险性。因此，在进行这些操作时，必须始终采取适当的预防措施，例如使用个人防护装备和无菌细胞培养技术。

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生物工程

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