基因工程小鼠模型中的前列腺癌建模:小鼠前前列腺叶细胞中的 CRISPR/Cas9 介导的局部基因编辑技术

从麻醉和制备的 CRISPR/Cas9 敲入小鼠模型开始，该模型具有由强上游启动子设计为表达 Cas9 核酸内切酶和绿色荧光蛋白 （GFP） 的基因组。在正常条件下，立即插入启动子下游的 floxed-STOP 盒或 LSL 可阻断 Cas9 和 GFP 转录。

切开小鼠的腹壁，露出附着在精囊上的前列腺前叶。将所需的腺病毒悬浮液注射到前叶中，以促进靶向病毒基因组递送到细胞中。将前列腺叶放回腹腔并缝合切口。

病毒感染的细胞内，病毒基因组表达靶向要突变基因的 Cre 重组酶和引导 RNA。Cre 酶识别 LSL 盒并切除 floxed 转录阻滞剂。此步骤允许启动子驱动Cas9核酸内切酶和GFP的表达。

，Cas9核酸内切酶与病毒编码的引导RNA形成复合物，将这些复合物引导至要突变的基因内的靶序列。这种定位使 Cas9 核酸内切酶能够切割靶基因内的基因组 DNA，从而导致遗传改变。

致癌改变导致突变细胞癌变。突变细胞内 GFP 报告蛋白的共表达有助于识别和跟踪癌症进展。

为了将病毒输送到前列腺，在根据文本方案麻醉 8 周龄的雄性小鼠后，通过评估肌肉松弛、踏板退缩和眼睑反射来检查麻醉深度。当观察到反射丧失时，剃掉动物的下腹部毛。使用无菌棉签，用兽医眼药膏小心地覆盖动物的眼睛，以防止干眼症引起的失明。然后，用70%乙醇和10%聚维酮碘擦拭剃光的腹部，对手术区域进行消毒。

接下来，使用无菌手术剪刀，在腹部中线下做一个大约 1 厘米的垂直皮肤切口。然后，用细尖镊子抬起腹膜，防止损坏下面的器官，并使用手术剪刀小心地在腹膜上做一个 8 毫米或更短的切口。轻轻地将脂肪组织移到一边，露出精囊。然后，使用环形镊子小心地提起精囊，直到可以识别出前前列腺。

现在，用一个 0.5 毫升的胰岛素注射器和一根 30G x 8 毫米的针头，将总体积为 30 微升的病毒溶液注射到前列腺前上皮细胞中。尽量减少泄漏并确保液体在组织内被吸收，形成小气泡。然后，将精囊放回腹腔内。

为确保液体以小气泡的形式在组织内吸收且不渗漏，请确保平行于精囊并遵循前列腺前叶的形状进行注射。

使用锥点针和 13 毫米 3/8 圆，用 6-0 可吸收缝合线的两到三针简单的间歇缝合腹膜。然后，用镊子提起皮肤以避免损坏腹膜，用三个无菌 4.8 x 6.5 毫米夹子钉住皮肤。

为了在手术后更好地恢复，请使用无菌 1 毫升注射器和 27G x 1/2 英寸针头通过腹膜内注射以每克体重 0.1 毫升的剂量施用麻醉解毒剂。然后，小心地将动物放回笼子里。

• CRISPR/Cas9 knock-in mouse model - Genetically engineered rodent model used for research purposes involving the CRISPR/Cas9 genome editing system.
• Lsl cassette - A genetic construct used to block transcription under certain conditions.
• Cas9 endonucleases - Enzymes expressed by the Cas9 gene, used in CRISPR for cutting DNA at desired locations.
• Green Fluorescent Proteins (GFPs) - Proteins that glow green under specific light; used as a marker in biological research.
• Prostate Cancer Model - A mouse model designed for prostate cancer studies.

• Introduce CRISPR/Cas9 knock-in mouse model – Define and contextualize the genetically engineered rodent model utilized for genome editing research (e.g., mouse models of prostate cancer).
• Key Concepts – Summarize principles of genetic editing using concepts like lsl-cassette, Cas9 endonucleases, and GFPs (e.g., targeted viral genome delivery).
• Underlying Mechanisms – Briefly describe the process of creating a genetic mutation (e.g., Cre recombinase enzymes and guide-RNA).
• Connect to Experiment – Discuss the importance of these processes in creating prostate cancer mouse models, demonstrating genetic alteration and cancer progression.

• What is the CRISPR/Cas9 knock-in mouse model and how does it assist in genetic research?
• How does the incorporation of GFPs help in tracing cancer progression?
• What is the role of Cas9 endonucleases in the genetic mutation process?

• Practical Applications – Discuss real-world use cases of these techniques in genetic research and cancer study (e.g., prostate cancer research).
• Industry Impact – Identify research sectors benefiting from mouse models, including genome science, biotechnology, and healthcare (e.g., CRISPR technology).
• Societal Importance – Emphasize the wider benefits of this technology, in aiding our understanding of diseases and therapies (e.g., cancer research).
• Link to Scientific Advancements – Discuss the significant breakthroughs these models have led to in scientific research.