使用CRISPR并发剂的小鼠小肠组织中多基因敲除的方案
July 12th, 2017
该协议描述了将多个单个引导RNA克隆到一个引导RNA并行载体中的步骤，其特别用于使用CRISPR / Cas9技术创建多基因敲除。肠组织中双重敲除的产生显示为该方法的可能应用。
该方案的总体目标是将多个引导 RNA 克隆到一个 CRISPR 连接体载体中，并在小鼠肠道类器官中实现高效的电穿孔，以便同时敲除多个基因。这种方法可以克服并行补偿的潜在影响，从而大大提高功能损失研究的效率。我们的 CRISPR 连接异构体策略的主要优点是单个克隆步骤的便利性，并且可以同时敲除多达四个不同的基因。
演示该程序将由我实验室的博士生 Alessandra Merenda 完成。将向导 RNA 或 gRNA 克隆到 CRISPR 连接异构体载体中，首先进行一次反应，对每个 gRNA 寡核苷酸的顶部和底部链进行退火，并磷酸化它们的末端。在冰上制备反应混合物，对于三种连接体，使用 3 微升上链 gRNA、3 微升下链 gRNA、2 微升 T4 DNA 连接酶缓冲液、1 微升 T4 多核苷酸激酶和水，总体积不超过 20 微升。
使用以下设置移液并运行热循环仪，37 摄氏度 30 分钟，95 摄氏度 5 分钟，以每分钟 0.3 摄氏度的速度降至 25 摄氏度，并保持在 4 摄氏度。下一步是 Bbs1 改组反应，其中将预退火的 gRNA 寡核苷酸掺入连接体载体的适当位置。在不含 DNA 和 RNA 的水中稀释反应混合物 1 至 100，以生成 3 个和 4 个 gRNA 连接体载体。
在冰上组装 Bbs1 改组反应。使用 100 ng CRISPR 连接体载体、10 μL 寡核苷酸混合物、1 μL 限制性内切酶缓冲液、1 μL DTT、1 μL ATP、1 μL Bbs1 酶、1 μliter T7 连接酶和水，总体积不超过 20 μL。通过移液充分混合，包括包含载体的阴性对照。
在热循环仪中运行反应，使用以下设置，用于克隆 3 个和 4 个 gRNA 连接异体，在 37 摄氏度下运行 50 个循环 5 分钟，在 21 摄氏度下运行 5 分钟，在 37 摄氏度下保持 15 分钟，然后在 4 摄氏度下无限期地保持。对于两个 gRNA 连接体，在步骤 1 的 25 个循环中运行相同的设置。当 Bbs1 改组反应完成后，从每种连接混合物中取 11 微升，加入 1.5 微升核酸外切酶缓冲液、1.5 微升 ATP、1 微升 DNA 核酸外切酶和水，使总体积为 15 微升。
在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，然后在 70 摄氏度下孵育 30 分钟。随后，按照标准方案，使用反应混合物转化化学感受态大肠杆菌。为了确认 CRISPR 连接体载体中存在 gRNA 插入片段，用接种环挑选细菌菌落，并将每个菌落接种在 4 mL LB 培养基中。
将克隆体在 37 摄氏度下在轨道摇床中培养过夜。第二天，根据制造商的说明，使用质粒小量制备试剂盒提取 DNA。在 10 μL 反应中，将每个 DNA 样品中大约 200 ng 与 10 个单位的 EcoR1 和 5 个单位的 BglII 混合。
包括单独的反应混合物和相应的原始载体作为阳性对照，以进行大小比较。将反应在 37 摄氏度下孵育 3 小时。在 90 伏电压下在 1% 琼脂糖凝胶上运行消化反应约 20 分钟。
使用 UV 透射仪观察凝胶，以识别具有正确插入片段大小的克隆。为了确认 gRNA 已被克隆到正确的位置，因此所有 Bbs1 识别位点都已丢失，请用 5 个单位的 Bbs1 消化选定的克隆。包括单独的反应混合物，以相应的原始载体作为对照。
在 37 摄氏度下孵育 3 小时，在 1% 琼脂糖凝胶上以 90 伏电压运行消化反应约 20 分钟。使用 UV 透射仪观察凝胶，以识别未被 Bbs1 切割的载体。当分裂类器官进行电穿孔时，每次横剖至少接种 48 孔板的 6 个孔。
将类器官接种在 20 微升基底基质滴中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中每孔 250 微升 WENR 加烟酰胺培养基中培养它们。第二天，用 250 微升 EGF 加 noggin、GSK3 抑制剂和不含抗生素的 rock 抑制剂培养基替换 WENR 加烟酰胺培养基。第三天，将类器官培养基更换为 EGF 加 noggin、GSK3 抑制剂、岩石抑制剂和 1.25% 二甲基亚砜，不含抗生素。
第四天，使用 1 毫升移液器吸头破坏基底基质圆顶，并将类器官转移到 1.5 毫升试管中。将 48 孔板的四个孔的内容物拉入一个试管中。通过用 P200 移液器上下移液约 200 次，将类器官机械地分解成小片段。
在室温下以 600 倍 G 离心 5 分钟。离心后，从所有试管中取出培养基，并将调色板重新悬浮在 1 mL 细胞培养级重组蛋白酶中。在 37 摄氏度下孵育最多五分钟。
仔细监测蛋白酶处理很重要，因为电穿孔的成功取决于获得包含细胞簇而不是单个细胞的细胞悬液。在具有四倍物镜的倒置光学显微镜下检查 50 微升样品滴。需要 10 到 15 个细胞的簇，因为这可以提高电穿孔后的细胞存活率。
将细胞悬液转移到低结合力的 15 mL 试管中，并通过添加 9 mL 不含抗生素的基础培养基来提取解离。在室温下以 600 倍 G 离心 5 分钟。弃去上清液，将调色板重新悬浮在一毫升还原血清培养基中。
用 Burkes 室计数细胞数，每个电穿孔反应至少需要 1 乘以 10 到第 5 个细胞。首先，将 9 mL 还原血清培养基加入含有细胞悬液的 15 mL 试管中，并在室温下以 400 倍 G 离心 3 分钟。去除所有上清液，并将调色板重新悬浮在电穿孔溶液中。
向两个新试管中加入总量为 10 μg 的 DNA。然后，加入电穿孔溶液至最终体积为 100 μL，并将细胞 DNA 混合物保存在冰上。将细胞 DNA 混合物转移到电穿孔比色皿中，将比色皿放入电穿孔仪室中。
按下电穿孔仪上的相应按钮测量阻抗，并确保阻抗为 0.030 至 0.055 欧姆。根据文本协议中指示的设置进行电穿孔。向比色皿中加入 400 μL 电穿孔缓冲液和岩石抑制剂，然后将其所有内容物转移到 1.5 mL试管中。
在室温下孵育 30 分钟，让细胞恢复。30 分钟后，在室温下以 400 倍 G 离心 3 分钟。去除上清液，将调色板重新悬浮于每孔 20 μL 的基底基质中。
在 48 孔板中接种每孔大约 1 次 10 至 1 次 10 至 10 次至第 5 个细胞，并加入 EGF 加 noggin、GSK3 抑制剂、岩石抑制剂和 1.25% 二甲基亚砜培养基。在 37 摄氏度下孵育。第二天，将培养基更换为 EGF 加 noggin、GSK3 抑制剂和岩石抑制剂，并通过观察 GFP 表达检查横流效率。
将类器官保持在 37 摄氏度。两天后，用新鲜培养基替换培养基。电穿孔后 4 天，将培养基更换为 WENR 加烟酰胺和岩石抑制剂培养基，并继续在 37 摄氏度下孵育细胞。
通过使用 EcoR1 和 BglII 的双重限制性消化来确认连接体载体中存在正确数量的 gRNA 插入片段。对于 4 个 gRNA 连接体载体，下带的预期大小约为 1.6 kb，对于 3 个 gRNA 连接体载体，下带大小约为 1.2 kb。此外，用 Bbs1 消化证实 gRNA 已被克隆到正确的位置，因此，所有 Bbs1 识别位点都丢失了。
通过电穿孔将确认的构建体递送至小鼠肠道类器官，以实现高达 70% 的横流效率，如 GFP 表达所示。观看本视频后，您应该对如何生成 gRNA 连接体载体以及如何使用电穿孔将其高效递送至 3D 类器官培养物，以便同时实现多个基因的敲除有很好的了解。
概述
本协议概述了将多个导向RNA克隆到单个CRISPR-串联体载体中的过程，便于使用CRISPR/Cas9技术创建多基因敲除。该方法通过生成肠道类器官中的双重敲除来进行说明。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 分子生物学
背景
- CRISPR/Cas9技术允许靶向基因编辑。
- 多基因敲除可以提供对基因功能和相互作用的洞察。
- 高效的克隆方法对于成功的基因编辑至关重要。
- 肠道类器官作为在相关生物学背景下研究基因功能的模型。
研究目的
- 开发一个将多个gRNA克隆到单个载体的协议。
- 提高基因敲除研究的效率。
- 展示该方法在肠道类器官中的应用。
使用的方法
- 退火和磷酸化gRNA寡核苷酸。
- 进行Bbs1洗牌反应以将gRNAs整合到载体中。
- 转化大肠杆菌以繁殖载体。
- 通过限制性内切酶消化和凝胶电泳验证gRNA插入。
主要结果
- 成功将多个gRNA克隆到单个串联体载体中。
- 在肠道类器官中生成双重敲除的效率得到证明。
- 通过凝胶分析确认了gRNA插入的完整性。
- 建立了一种可靠的同时敲除多个基因的方法。
结论
- CRISPR-串联体策略简化了克隆过程。
- 这种方法可以显著提高功能丧失研究的效率。
- 它为研究复杂生物系统中的基因功能的研究人员提供了一个宝贵的工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables efficient multi-gene knockout in a physiologically relevant model, addressing a key limitation in loss-of-function studies where genetic redundancy masks phenotypes. By allowing simultaneous targeting of up to four genes in mouse intestinal organoids, it improves predictive confidence in target validation and supports mechanistic de-risking in early discovery. The approach streamlines workflow from cloning to functional readout, reducing timelines for pathway interrogation and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by overcoming paralog compensation through simultaneous multi-gene knockout.
- Operational Value: Reduces cloning steps via single Golden Gate reaction, increasing throughput for target validation campaigns.
- Strategic Value: Supports predictive confidence in target selection by revealing phenotypes masked by genetic redundancy.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates genetically defined organoid models suitable for phenotypic screening and compound sensitivity assays.
- Operational Value: Produces standardized clonal lines with verified multi-gene edits, improving assay reproducibility.
- Strategic Value: Enables scalable preparation of disease-relevant systems for target and biomarker validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance by modeling Wnt pathway dysregulation, a key driver in gastrointestinal cancers and regenerative medicine.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation using a consistent organoid platform.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by enabling mechanistic de-risking of combination targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows, supporting target validation through mechanistic interrogation and enabling lead identification via phenotypic screening in genetically defined models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous knockout of gene families or paralogs.
- Screening: Delivers assay-ready organoid models with standardized genetic backgrounds for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative phenotypic readouts (e.g., growth factor independence) to compare genetic conditions and assess target dependency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of mouse intestinal organoids, a translational model for human gastrointestinal biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cloning and delivery platform applicable across multiple target families and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives from genetic compensation.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through a single-cloning, high-efficiency electroporation workflow.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling earlier detection of multi-target dependencies and reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on combinatorial knockout phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise for gRNA design, annealing, and Golden Gate assembly.
- Depends on access to electroporation equipment optimized for 3D organoid cultures.
- Necessitates standardization of organoid culture and dissociation protocols across teams for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different gRNA numbers and target genes within the concatemer vector.
- Limited by the need to validate editing efficiency and clonal diversity post-electroporation for downstream applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Cloning of gRNAs into the CRISPER-concatemer Vector
3:40
Assessing Success of Cloning by Restriction Digest
5:28
Preparing Intestinal Organoids for Electroporation
8:08
Electroporation
10:36
Results: Successful Generation of CRISPER-concatemers and Electroporation of Intestinal Organoids
11:24
Conlcusion
