利用CRISPR串联体在小鼠小肠类器官中进行多基因敲除的实验方案

本实验方案的总体目标是将多个引导RNA克隆至一个CRISPR串联载体中，并在小鼠肠道类器官中实现高效电穿孔，从而同时敲除多个基因。该方法可通过克服潜在的平行代偿效应，显著提高功能缺失研究的效率。我们所采用的CRISPR串联策略的主要优势在于仅需一步克隆操作，简便快捷，并可实现最多四个不同基因的同时敲除。

该实验操作将由本实验室的博士生Alessandra Merenda进行演示。将引导RNA（gRNA）克隆至CRISPR串联体载体的过程，首先需进行一个反应，使每条gRNA寡核苷酸的上链与下链退火，并对其末端进行磷酸化。在冰上配制反应体系：针对三个串联体，加入3微升gRNA上链、3微升gRNA下链、2微升T4 DNA连接酶缓冲液、1微升T4多核苷酸激酶，并加水至总体积为20微升。

通过移液充分混匀，并使用以下程序运行热循环仪：37 摄氏度反应 30 分钟，95 摄氏度反应 5 分钟，以每分钟 0.3 摄氏度的速率降温至 25 摄氏度，然后在 4 摄氏度下保存。下一步为 Bbs1 混合反应，将预先退火的 gRNA 寡核苷酸插入至串联体载体的相应位置。用无 DNA、无 RNA 的水将反应混合物按 1:100 比例稀释，以构建含三个和四个 gRNA 的串联体载体。

在冰上配制 Bbs1 搅拌反应体系。每反应使用 100 纳克 CRISPR-concatemer 载体、10 微升寡核苷酸混合物、1 微升限制性内切酶缓冲液、1 微升 DTT、1 微升 ATP、1 微升 Bbs1 酶、1 微升 T7 连接酶，并加水至总体积为 20 微升。用移液器充分混匀，同时设置包含载体的阴性对照。

使用以下程序在热循环仪中进行反应：用于克隆三个和四个 gRNA 串联体时，进行 50 个循环，每个循环为 37 摄氏度 5 分钟和 21 摄氏度 5 分钟，随后在 37 摄氏度保持 15 分钟，然后在 4 摄氏度长期保存。对于两个 gRNA 串联体，采用相同的设置，但第一步循环数为 25 个循环。Bbs1 洗牌反应完成后，取每个连接混合物 11 µL，加入 1.5 µL 外切酶缓冲液、1.5 µL ATP、1 µL DNA 外切酶以及水，使总体积达到 15 µL。

在37摄氏度孵育30分钟，随后在70摄氏度孵育30分钟。接着，按照标准方案，将反应混合物用于转化化学感受态的大肠杆菌（E. coli）。为确认CRISPR串联体载体中存在gRNA插入片段，使用接种环挑取细菌菌落，并将每个菌落接种于4毫升LB培养基中。

在37摄氏度的摇床中过夜培养克隆。次日，按照生产商说明书，使用质粒小提试剂盒提取DNA。将每种DNA样本约200纳克与10单位EcoR1及5单位BglII混合，总体积为10微升的反应体系。

设置一个单独的反应体系，其中包含相应的原始载体，作为大小比较的阳性对照。将反应体系在37摄氏度下孵育3小时。在1%琼脂糖凝胶中以90伏电压电泳约20分钟，以分析酶切反应产物。

使用紫外透射仪观察凝胶，以鉴定含有正确插入片段大小的克隆。为确认gRNA已克隆至正确位置，从而导致所有BbsI识别位点均丢失，用5单位BbsI酶切所选克隆。同时设置单独的反应体系，以相应的原始载体作为对照。

在37摄氏度孵育三小时，将消化反应产物在1%琼脂糖凝胶中以90伏电泳约20分钟。使用紫外透射仪观察凝胶，鉴定未被Bbs1切割的载体。进行类器官传代用于电穿孔时，每次转染至少接种48孔板中的六个孔。

将类器官接种于20 μL基底膜基质液滴中，每孔加入250 μL含烟酰胺的WENR培养基，在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养。第2天，弃去含烟酰胺的WENR培养基，更换为250 μL不含抗生素的EGF、noggin、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂培养基。第3天，将类器官培养基更换为含EGF、noggin、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂和1.25%二甲基亚砜（DMSO）的不含抗生素培养基。

第4天，使用1毫升移液器枪头破坏基底膜基质小滴，将类器官转移至1.5毫升离心管中。将48孔板中四个孔的培养物收集至同一根离心管中。使用P200移液器反复吹打约200次，将类器官机械性地剪切为小片段。

在室温下以600 × g离心五分钟。离心后，弃去所有试管中的上清液，并将沉淀物重悬于一毫升细胞培养级重组蛋白酶中。在37 °C孵育，时间不超过五分钟。

必须仔细监测蛋白酶处理过程，因为电穿孔的成功与否取决于能否获得含有细胞簇而非单个细胞的细胞悬液。取50微升样品滴，在倒置光学显微镜下使用4倍物镜进行观察。理想的细胞簇包含10至15个细胞，这有助于提高电穿孔后的细胞存活率。

将细胞悬液转移至低吸附的15毫升离心管中，并通过加入9毫升不含抗生素的基础培养基终止消化。在室温下以600 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升低血清培养基中。

使用血细胞计数板对细胞进行计数，每次电穿孔反应至少需要1 × 10⁵个细胞。首先，在含有细胞悬液的15 mL离心管中加入9 mL低血清培养基，于室温下以400 × g离心3分钟。吸除所有上清液，将沉淀重悬于电穿孔溶液中。

向两个新离心管中各加入总量为10微克的DNA。然后加入电穿孔溶液，使终体积达到100微升，并将细胞-DNA混合物置于冰上保存。将细胞-DNA混合物转移至电穿孔比色皿中，再将比色皿放入电穿孔仪的电转槽内。

按下电穿孔仪上的相应按钮测量阻抗，并确保其值在0.030至0.055欧姆之间。根据文本方案中指定的设置进行电穿孔操作。向电穿孔杯中加入400 µL电穿孔缓冲液和rock抑制剂，然后将其中所有内容转移至一个1.5 mL离心管中。

室温孵育30分钟，使细胞恢复。30分钟后，室温下以400 × g离心3分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于每孔20微升基底膜基质中。

在48孔板中每孔接种约1×10⁴至1×10⁵个细胞，并加入含EGF、noggin、GSK3抑制剂、rock抑制剂和1.25%二甲基亚砜的培养基。在37°C下培养。次日，更换为含EGF、noggin、GSK3抑制剂和rock抑制剂的培养基，并通过观察GFP表达情况检测转染效率。

将类器官置于37°C条件下培养。两天后，更换为新鲜培养基。电穿孔四天后，将培养基更换为含烟酰胺和ROCK抑制剂的WENR培养基，并继续在37°C条件下孵育细胞。

通过用EcoR1和BglII进行双酶切，确认串联体载体中插入了正确数量的gRNA。预期较小条带的大小约为：四gRNA串联体载体为1.6千碱基，三gRNA串联体载体为1.2千碱基。此外，用Bbs1酶切可证实gRNA已克隆至正确位置，因此所有Bbs1识别位点均消失。

通过电穿孔将验证后的构建体递送至小鼠肠道类器官，可实现高达70%的转染效率，GFP表达结果已证实该效率。观看本视频后，您应能够充分了解如何构建gRNA串联载体，以及如何利用电穿孔技术高效地将这些载体递送至三维类器官培养体系，从而实现多个基因的同步敲除。