Name: 使用CRISPR并发剂的小鼠小肠组织中多基因敲除的方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学习使用CRISPR并发剂在小鼠肠道类器官中实现多基因敲除的高效方案。该方法通过单次克隆步骤同时敲除多达四个基因，显著提高功能缺失研究的效率，为基因功能研究提供可靠工具。

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感谢 Christopher Hindley 对手稿的审阅。A.M. 由 Wntsapp（玛丽·居里创新培训网络）资助，A.A-R. 由英国医学研究理事会（MRC）资助，B-K.K. 和 R.M. 由惠康信托基金与皇家学会联合设立的亨利·戴尔爵士研究员项目 [101241/Z/13/Z] 资助，并获得惠康信托基金与医学研究理事会共同资助的剑桥干细胞研究所核心经费的支持。

1. CRISPR-concatemer 载体的 gRNA 设计
注意：本节旨在说明如何选择最佳的靶向策略，以及如何设计含有特定突出端的gRNA，用于CRISPR串联载体。
<ol>
	<li>使用选定的 CRISPR gRNA 设计工具针对目标基因设计 gRNA。参见材料表中的示例。 
	注意：当靶向一对旁系同源基因时，尽管可以为每个基因设计一个 gRNA，但建议为每个基因设计两个 gRNA，以提高实现双基因敲除的可能性（图 1）。</li>
	<li>使用限制性酶切图谱分析工具确认 gRNA 序列中不含 BbsI 识别位点（参见材料表中的示例）。</li>
	<li>按照表 1所示，为每条寡核苷酸添加特定的 CRISPR-串联体载体突出末端。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>引物 1</td>
			<td>引物 2</td>
			<td>引物 3</td>
			<td>引物 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>序列 (5′-3′)</td>
			<td>CACCGG[gRNA1]GT</td>
			<td>ACCGG[gRNA2]G</td>
			<td>CCGG[gRNA3]</td>
			<td>ACACCGG[gRNA4]GTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>序列 (5′-3′)</td>
			<td>TAAAAC[RC-gRNA1]CC</td>
			<td>AAAAC[RC-gRNA2]C</td>
			<td>AAAC[RC-gRNA3]</td>
			<td>CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：CRISPR-concatemer载体各盒式元件的突出端序列。
2. 将gRNA克隆至CRISPR串联载体
<ol>
	<li>寡核苷酸的磷酸化与退火 
	注意：此步骤说明了如何对每个gRNA寡核苷酸的正链和反链进行退火，以及如何在单个反应中对其末端进行磷酸化。
	<ol>
		<li>在冰上按照以下说明配制用于寡核苷酸磷酸化及上下链退火的反应混合液。 
		注意：所有寡核苷酸可混合至同一反应体系中；例如，对于含有4个gRNA串联的载体，可将8条寡核苷酸混合。</li>
		<li>对于3个串联体，使用3.0 µL gRNA上链（每种gRNA各1.0 µL；10 µM，每种gRNA 1 µL）、3.0 µL gRNA下链（每种gRNA各1.0 µL；10 µM，每种gRNA 1 µL）、2.0 µL T4 DNA连接酶缓冲液（10×）、1.0 µL T4 PNK，并加入H₂O2加水至终体积为 20.0 µL。</li>
		<li>用移液器充分混匀，然后在PCR仪中按照以下程序运行：37 °C 30分钟，95 °C 5分钟，以0.3 °C/分钟的速率降温至25 °C，4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BbsI 型混排反应 
	注意：在本步骤中，通过交替进行消化与连接循环，将预先退火的gRNA寡核苷酸一步插入至串联体载体的相应位置。
	<ol>
		<li>将反应混合物用无 DNase/RNase 水按 1:100 稀释，以制备 3 和 4 号 gRNA-串联载体。 
		注意：当克隆2个gRNA串联体时，此步骤为 不 需要。</li>
		<li>组装 Bbs将反应物在冰上混匀，具体操作见下文说明。设置一个仅含载体的阴性对照。</li>
		<li>使用100 ng CRISPR-concatemer载体、10.0 µL寡核苷酸混合物、1.0 µL含BSA的限制性内切酶缓冲液（10x）、1.0 µL DTT（10 mM）、1.0 µL ATP（10 mM）、1.0 µL BbsI，1.0 µL T7连接酶，和H2加水至终体积为 20.0 µL。</li>
		<li>用移液器充分混匀，并在PCR仪中按照以下程序运行：运行 50 个循环 用于克隆3和4个gRNA串联体 25 个循环 对于2个gRNA串联体，均在37 °C孵育5分钟，21 °C孵育5分钟， 保持在 37 °C 反应 15 分钟，然后 4 °C 保存</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外切酶处理 
	注意：强烈建议执行此步骤，以去除线性化 DNA 的残留，从而提高克隆效率。
	<ol>
		<li>处理 BbsI 在含有DNA外切酶的反应中进行混匀（参见 材料表如下所示。</li>
		<li>从上一步（2.2.3）中取 11.0 µL 连接混合物，加入 1.5 µL 外切核酸酶缓冲液（10x）、1.5 µL ATP（10 mM）、1.0 µL DNA 外切核酸酶，并用 ddH₂O 补充至总体积为 15.0 µL。在 37 °C 下孵育 30 分钟，随后在 70 °C 下孵育 30 分钟。 
		注意：此步骤可去除混合物中残留的线性化DNA，从而提高克隆效率。</li>
		<li>使用 2 µL 反应混合物进行化学感受态细胞的转化 E. coli 热激转化细菌12. 
		注意：或者，反应物可在 -20 °C 下保存长达一周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>限制性酶切 
	注意：此步骤的目的是通过限制性酶切来评估克隆实验的成功与否。
	<ol>
		<li>为了确认CRISPR-concatemer载体中gRNA插入片段的存在，用接种环挑选4–8个细菌菌落，将每个克隆在37 °C恒温摇床中于4 mL LB培养基中过夜培养。按照制造商说明书，使用质粒小提试剂盒提取DNA（参见 材料表).</li>
		<li>用10 U酶消化约200 ng DNA EcoRI + 5 U Bgl在细菌培养箱中于37 °C孵育3小时，在10 μL反应体系中进行II。另设一个独立的反应体系，包含相应的原始载体作为阳性对照，用于大小比较。 
		注意：由于这两种限制性内切酶可切割出完整的串联体，因此该步骤将确认所有串联体是否均存在。各串联体的预期大小如下：2个gRNA串联体（800 bp）、3个gRNA串联体（1.2 kbp）和4个gRNA串联体（1.6 kbp）。</li>
		<li>在1%琼脂糖凝胶中以90 V电压运行消化反应约20分钟。</li>
		<li>使用紫外透射仪观察凝胶。通过比较克隆的条带模式与原始载体一致，并结合DNA分子量标记判断各片段是否具有预期大小，从而鉴定出插入片段大小正确的克隆。</li>
		<li>用 5 U 的限制性内切酶消化所选克隆 Bbs在37 °C细菌培养箱中孵育3小时。设置一个单独的反应体系，以相应的原始载体作为对照。 
		注意：此额外消化步骤旨在确认gRNA已克隆至正确位置，从而确保所有 BbsI 型识别位点已丢失。</li>
		<li>在1%琼脂糖凝胶上以90 V电压电泳约20分钟。仅将未被酶切的载体视为正确 Bbs因为它们仅含有 gRNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>载体测序 
	注意：此步骤的目的是通过限制性消化分析确认正确载体中gRNA序列的存在。
	<ol>
		<li>通过Sanger测序验证阳性串联体载体13 使用以下引物： 
		正向：TCAAGCCCTTTGTACACCCTAAG（用于检测第一个gRNA表达盒） 
		连接子1_正向：GACTACAAGGACGATGATGACAA（用于检测第二个gRNA表达盒） 
		Linker2_反向：GGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGT（用于检测第二个gRNA表达盒） 
		Linker2_正向：ACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCC（用于检测第三个gRNA表达盒） 
		Linker3_反向：TCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCAT（用于检测第三个gRNA表达盒） 
		反向：AGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAG（用于检测最后一个gRNA表达盒）</li>
		<li>通过在测序读段中搜索gRNA序列来确认所有gRNA的存在。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过电穿孔法转染肠道类器官
注意：本实验步骤基于Fujii et al. 于2015年发表的实验方案，并针对小鼠小肠类器官培养进行了适当优化14。
<ol>
	<li>电穿孔前处理 
	注意：本节描述了如何在电穿孔前通过去除培养基中的所有抗生素和条件培养基来准备小鼠肠道类器官，以防止电穿孔过程中可能产生的毒性作用。
	<ol>
		<li>转染程序的第0天，以1:2的比例传代类器官。 
		注意：可通过按照先前建立的方案进行隐窝分离获得肠道类器官培养物15。所有培养基成分请参见表2。
		<ol>
			<li>用于电穿孔的类器官传代时，每项转染至少接种6个48孔板的孔。</li>
			<li>将类器官接种于20 μL基底膜基质液滴中，并在WENR + Nic培养基（Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + 烟酰胺）中于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中培养（如先前所述15）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第2天，将培养基更换为250 µL不含抗生素的EN（EGF + Noggin）+ CHIR99021（糖原合成酶激酶-3抑制剂）+ Y-27632（ROCK抑制剂）（见表2）。 
		注意：在所有步骤中，向48孔板每个孔添加的培养基体积均为250 µL。</li>
		<li>第3天，将类器官培养基更换为不含抗生素的EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v二甲基亚砜（DMSO）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞准备 
	注意：此处描述了如何通过机械和化学解离将类器官分解为小的细胞簇。这些步骤对实验成功至关重要。
	<ol>
		<li>第4天，使用1 mL移液枪头破坏基底膜基质圆顶结构，并将类器官转移至1.5 mL离心管中。将48孔板中四个孔的内容物汇集至同一管中。</li>
		<li>使用P200移液器反复吹打约200次，将类器官机械性打碎成小片段。室温下以600 × g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL细胞培养级重组蛋白酶溶液中（见材料表）。37 °C孵育最多5分钟，随后取50 µL样品滴于倒置光学显微镜下，使用4倍物镜观察。 
		注意：理想的细胞簇大小为10–15个细胞，这有助于提高电穿孔后的细胞存活率。</li>
		<li>将细胞悬液转移至低吸附性15 mL离心管中，并加入9 mL不含抗生素的基础培养基终止解离反应（见表2）。室温下以600 × g离心5分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL低血清培养基中（见材料表）。</li>
		<li>使用Bürker计数板对细胞进行计数，每项电穿孔反应至少使用1 × 105个细胞。向15 mL管中加入9 mL低血清培养基，室温下以400 × g离心3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔 
	注意：以下部分提供了电穿孔操作及后续类器官恢复的步骤说明。
	<ol>
		<li>完全弃去上清液，将沉淀重悬于电穿孔溶液中（见材料表）。向细胞悬液中加入总量为10 µg的DNA，并加入电穿孔溶液至终体积为100 µL，将细胞-DNA混合物置于冰上保存。CRISPR串联载体应与Cas9表达质粒（例如 Addgene #41815）按1:1比例联合使用。 
		注意：所加DNA总体积应不超过总反应体积的10%。</li>
		<li>另设一组单独的转染混合物，包含GFP质粒以评估转染效率（例如 pCMV-GFP，Addgene #11153，或其他通用GFP表达质粒）。</li>
		<li>将细胞-DNA混合物加入电穿孔比色皿中，并将其放入电穿孔仪腔室。按下电穿孔仪上的相应按钮测量阻抗，确保其值在0.030–0.055 kΩ范围内。根据表3所示参数进行电穿孔。 
		注意：若阻抗值超出允许范围，需调整比色皿中溶液的体积。</li>
		<li>向比色皿中加入400 µL电穿孔缓冲液 + Y-27632，然后全部转移至1.5 mL离心管中。室温孵育30分钟以使细胞恢复，随后室温下以400 × g离心3分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于20 μL/孔的基底膜基质中。将约1 × 104至1 × 105个细胞接种至48孔板的每个孔中，并加入EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1.25% v/v DMSO培养基。37 °C孵育。</li>
		<li>第5天，更换为EN + CHIR99021 + Y-27632培养基，并通过观察GFP表达情况评估转染效率（图2）。将类器官保持在37 °C，并在2天后更换新鲜的EN + CHIR99021 + Y-27632培养基。</li>
		<li>第9天，更换为WENR + Nic + Y-27632培养基，并在37 °C孵育。 
		注意：Y-27632可在7–10天后（第16–19天）去除。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>电穿孔脉冲</td>
			<td>转移脉冲</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>电压</td>
			<td>175V</td>
			<td>20V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脉冲时长</td>
			<td>5 msec</td>
			<td>50msec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脉冲间隔</td>
			<td>50msec</td>
			<td>50msec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脉冲次数</td>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>衰减率</td>
			<td>10%</td>
			<td>40%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>极性</td>
			<td>+</td>
			<td>+/-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：电穿孔设置。
4. 生长因子撤除
注意：此处以在肠道类器官中敲除Wnt信号通路的负调控因子时进行生长因子撤除实验为例进行说明。
<ol>
	<li>电穿孔后10-14天，按照上述步骤（3.2.1 - 3.2.2），以1:3的比例将类器官分种至48孔板中。</li>
	<li>将类器官沉淀重悬于20 µL基底膜基质中，在37 °C下孵育10分钟使其凝固。随后加入250 µL无生长因子培养基（例如 EN），以检测目标基因是否成功敲除5。</li>
	<li>在无生长因子条件下对类器官进行至少2-3次传代，以观察野生型（WT）对照类器官与突变型类器官在存活能力上的差异5,15。 
	注：野生型类器官在连续两次传代过程中应无法在无生长因子培养基中存活，而突变型细胞系则应能够生长。</li>
</ol>

<ol><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Guided+Human+Genome+Engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. -P., Velasco-Herrera, M. D. C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nat Biotech. 32 (3), 267-273 (2014).</li>
<li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+CRISPR+Library+for+High-Throughput+Genetic+Screening+in+Drosophila+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide CRISPR Library for High-Throughput Genetic Screening in Drosophila Cells.</a> J Genet Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li>
<li>Diss, G., Ascencio, D., DeLuna, A., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+paralogous+compensation+and+the+robustness+of+cellular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+B+Mol+Dev+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of paralogous compensation and the robustness of cellular networks.</a> J Exp Zool B Mol Dev Evol. 322 (7), 488-499 (2014).</li>
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<li>Zimmermann, J., Voss, H., Schwager, C., Stegemann, J., Ansorge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Sanger+dideoxy+sequencing+reaction+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Automated Sanger dideoxy sequencing reaction protocol.</a> FEBS Letters. 233 (2), 432-436 (1988).</li>
<li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nat. Protoc. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。作者声明无利益冲突。

在本实验方案中，我们详细阐述了生成CRISPR串联体（CRISPR-concatemers）并将其应用于小鼠肠道类器官以同时敲除多个基因的全部步骤。如前所述，该策略具有多项优势，例如操作快速、效率高且成本效益好。
为了成功完成整个实验流程，需要考虑几个关键因素。首先，所有 gRNA 寡核苷酸必须正确退火并磷酸化，因为它们是 BbsI 克隆反应的起始材料，而该克隆反应本身效率很高。其次，在对类器官进行电穿孔时，每个条件所使用的细胞数量越多，可能达到的最大转染效率就越高。此外，在细胞解离后，应以小细胞团簇为主，而非单个细胞。
然而，在首次尝试克隆或转染时，可能会遇到技术问题；如果在gRNA克隆过程中出现问题，建议重新核对gRNA寡核苷酸序列，若序列正确，则应选择更多的细菌菌落进行限制性酶切筛选。如果电穿孔后转染效率低且细胞存活率差，则建议重复实验，增加每种条件下使用的细胞数量，并将细胞解离时间缩短至3分钟。
尽管CRISPR串联体的构建相对廉价且简便，但在类器官中进行大规模遗传筛选却并非如此，因为其规模受限于类器官培养的成本及其劳动密集型特性。在此需要指出的是，CRISPR串联体方法也可用于细胞系，例如HEK293细胞和小鼠胚胎干细胞。
无论采用何种细胞体系，当旨在同时敲除三个或四个不同基因时，该策略的另一个潜在缺点可能会显现。例如，每条gRNA的靶向效率各不相同，同时成功靶向所有基因的概率可能相对较低；因此，建议采用串联体系统，以引导多条gRNA针对同一基因。
近年来，已提出多种基于Golden Gate片段重排的替代策略，用于构建多重gRNA载体7,8。然而，在我们的方法中，可在一轮克隆过程中将多个gRNA直接组装到单个逆转录病毒载体中，因此适用于构建靶向同源基因的gRNA文库。
我们的CRISPR串联体构建在MSCV逆转录病毒载体骨架中。因此，含有gRNA串联体的逆转录病毒可用于建立稳定过表达gRNA的细胞系。当与可诱导的Cas9系统联合使用时，可利用该系统实现可诱导的同源基因敲除。
总之，本文介绍了如何在一步反应中将多达四种不同的gRNA克隆至同一载体中，并阐述了如何将该策略应用于类器官培养，实现高效转染。此外，我们还提供了若干实用建议，以最大限度地提高整个实验流程的成功几率。

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55916/a-protocol-for-multiple-gene-knockout-mouse-small-intestinal">A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer</a>. There was a typo in step 3.3 of the Protocol.

Erratum: A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

反向遗传学方法是一种广泛用于研究基因功能的技术。特别是功能缺失研究，即基因的破坏导致表型改变，在增进我们对生物过程理解方面发挥着关键作用。CRISPR/Cas9 技术代表了基因组编辑领域的最新进展，彻底改变了细胞和生物体遗传学研究的现状。Cas9 是一种由 RNA 引导的内切核酸酶，可结合与向导 RNA（gRNA）互补的特定 DNA 序列，并产生双链断裂（DSB）。这种双链断裂会招募 DNA 修复机制，在缺乏同源重组所需的 DNA 模板时，细胞将通过易错的非同源末端连接方式重新连接断裂的 DNA 链，从而可能导致核苷酸的插入或缺失，引发移码突变1。
CRISPR/Cas9 技术具有操作简便和用途广泛的优势，使其成为用于揭示未知基因功能的全基因组规模敲除筛选的极具吸引力的工具2,3。然而，当存在具有冗余功能的多个旁系同源基因时，单个基因敲除方法的应用将受到限制。因此，由于旁系同源基因可能产生功能补偿，导致表型无明显变化或变化甚微，仅敲除单个基因可能不足以确定该基因的功能4。因此，为克服遗传补偿的影响，有必要通过递送靶向不同旁系同源基因的多种 gRNA 载体，同时敲除多个旁系同源基因。
为了将CRISPR/Cas9技术的应用扩展到同源基因的敲除，我们近期开发了一种快速、一步式克隆方法，可将多达四个预先退火的gRNA克隆至单一逆转录病毒载体中5。该载体骨架称为CRISPR串联体（CRISPR-concatemer），基于一种MSCV逆转录病毒质粒，包含多个重复的gRNA表达盒。每个表达盒含有两个方向相反的II型限制性内切酶BbsI的识别位点，可通过单管内的Golden Gate置换反应，用具有匹配黏性末端的退火gRNA寡核苷酸片段不可逆地替换这些位点6。该克隆方法包含反复的酶切与连接循环，利用BbsI产生的不同黏性末端序列，实现多个DNA片段的同时组装。该酶的独特之处在于能够在其识别序列之外进行不对称切割；因此，每个表达盒可在BbsI核心位点两侧设计不同的序列和定制的黏性末端，从而使得每个gRNA能够以特定的位置和方向插入串联体载体中。
作为概念验证，我们通过一轮电穿孔同时破坏Wnt信号通路中两对旁系同源的负调控因子，证明了该策略在小鼠肠道类器官中的应用5。
近年来，许多其他研究团队开发了类似的策略，通过使用Golden Gate连接技术构建含多个gRNA的表达载体7，在多种模式系统中实现多基因敲除，例如人类细胞系8,9、斑马鱼10和Escherichia coli11。在这些方案中，gRNA首先被克隆至各自的中间载体，再共同组装到一个最终载体中。相比之下，我们提出的CRISPR串联体（CRISPR-concatemer）策略的主要优势在于仅需一次BbsI连接和克隆操作，步骤简便。与其他gRNA串联方法类似，本方法既可实现最多四个不同基因的同步敲除，也可通过多个gRNA靶向一个或两个基因，从而提高CRISPR基因敲除效率（图1）。
在本实验方案中，我们详细描述了CRISPR串联载体构建的每一步操作，从gRNA设计、Golden Gate连接反应，到成功克隆的验证。同时，我们还提供了一种高效的方法，通过电穿孔将CRISPR串联体转染至小鼠小肠类器官，并进行后续的生长因子撤除实验。

<table><tbody><tr><td>优化的CRISPR设计工具</td><td>Feng Zhang团队</td><td></td><td>CRISPR gRNA设计工具；http://crispr.mit.edu/</td></tr><tr><td>Webcutter 2.0</td><td></td><td></td><td>限制性酶切图谱分析工具；http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/</td></tr><tr><td>T4 PNK（多核苷酸激酶）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶缓冲液</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T7 DNA连接酶</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0318L</td><td></td></tr><tr><td>DTT（二硫苏糖醇）</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>ATP（三磷酸腺苷）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest BbsI (BpiI)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FD1014</td><td></td></tr><tr><td>Tango缓冲液（含BSA的限制性内切酶缓冲液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BY5</td><td></td></tr><tr><td>BglII</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0144</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>质粒安全外切酶</td><td>Cambio</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>应用生物系统</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>10G感受态大肠杆菌</td><td>剑桥生物科技</td><td>60108-1</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>UY-02580-01</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>Microspec</td><td>PLS5</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养箱</td><td>三洋</td><td>MIR-262</td><td></td></tr><tr><td>LB液体培养基（Luria-Bertani肉汤）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3522</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4718</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶电泳装置</td><td>Bioneer</td><td>A-7020</td><td></td></tr><tr><td>高级DMEM/F12（细胞培养基）</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax（L-谷氨酰胺）100倍</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M（缓冲剂）</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100倍</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27添加剂（神经元细胞无血清添加剂）50倍</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2添加剂（神经元细胞无血清添加剂）100倍</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>小鼠EGF 500 &amp;micro;g/mL</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>小鼠Noggin 100 &amp;micro;g/mL</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin条件培养基</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>由HEK293细胞自行制备，详情参见Sato和Clevers 2013</td></tr><tr><td>Wnt条件培养基</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>由HEK293细胞自行制备，详情参见Sato和Clevers 2013</td></tr><tr><td>Y-27632 10 &amp;micro;M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>标准BD Matrigel基质</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>48孔板</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Cell Guidance Systems</td><td>SM39-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE（重组蛋白酶）</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM（低血清培养基）</td><td>Life technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔比色皿（2 mm间隙）</td><td>NepaGene</td><td>EC-002S</td><td></td></tr><tr><td>低吸附15 mL离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker&amp;rsquo;s计数室</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR719520-1EA</td><td></td></tr><tr><td>NEPA21超级电穿孔仪</td><td>NepaGene</td><td>联系供应商</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind低吸附管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10708704</td><td></td></tr><tr><td>BTXpress电穿孔缓冲液</td><td>哈佛仪器</td><td>45-0805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr></tbody></table>

利用crispr串联体在小鼠小肠类器官中进行多基因敲除的实验方案

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 技术极大地提高了功能缺失研究的可行性和速度，而这类研究对于理解基因功能至关重要。在高等真核生物中，旁系同源基因可通过补偿某个基因的缺失而掩盖潜在的表型，从而限制了依赖单基因敲除的遗传学研究所能获得的信息。我们开发了一种新型的快速克隆方法，用于将向导 RNA（gRNA）串联体克隆至载体中，从而在小鼠小肠类器官中通过单次转染实现多基因敲除。该策略通过一次 Golden Gate 连接反应，将退火形成的 gRNA 寡核苷酸与预先设计好的逆转录病毒载体组合，即可将最多四个独立的 gRNA 串联插入单一载体中。该方法既可实现最多四个不同基因的同时敲除，也可通过多个 gRNA 靶向同一基因来提高敲除效率。在本实验方案中，我们详细展示了如何高效地将多个 gRNA 克隆至逆转录病毒 CRISPR 串联载体中，并如何在肠道类器官中实现高效的电穿孔转染。作为示例，我们证明了同时敲除两对编码 Wnt 信号通路负调控因子的基因（Axin1/2 和 Rnf43/Znrf3）可使肠道类器官对关键生长因子的撤除产生抗性。

为了确认串联体载体中插入了正确数量的 gRNA 片段，需使用限制性内切酶（EcoRI + BglII）进行酶切反应，这些酶位于所有 gRNA 表达盒的侧翼（每个表达盒大小约为 400 bp，图 1）。例如，在构建含 4 个 gRNA 的串联体载体时，琼脂糖凝胶电泳中预期的下端条带大小约为 1.6 Kbp；若出现比该条带更小的条带，则表明并非全部 4 个 gRNA 表达盒均已插入载体中（图 2A）。此外，始终建议验证所有 BbsI 识别位点是否均已丢失，即该酶不能切割载体（图 2B）。
在确认构建体正确无误后，可通过电穿孔法将其递送至小鼠肠道类器官，以实现最佳转染效率（最高可达70%），GFP对照结果如图3所示。
最后，为了功能验证该策略的效率，将转染了 Cas9 和针对 Axin1/2 以及 Rnf43/Znrf3 的串联载体的肠类器官，在 EN 培养基（撤除 R-spondin）以及 EN + IWP2 培养基（同时撤除 R-spondin 和 Wnt，IWP2：Porcupine 抑制剂，2.5 μM）中培养至少 3 代（图 4）。未转染的野生型类器官在两种条件下均死亡，而 Axin1/2 敲除的类器官由于 Wnt 通路的下游激活，在两种条件下均能存活；此外，Rnf43/Znrf3 突变类器官在无 R-spondin 时可存活，但在 IWP2 存在下无法存活，因为 IWP2 会导致激活该通路的 Wnt 耗竭。综上所述，这些结果表明，通过产生预期的类器官表型，可实现对这些同源基因对的敲除。这些结果的详细信息已发表于 Developmental Biology5。
<img alt="CRISPR 基因编辑示意图、gRNA 表达盒、测序流程、基因工程分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：含 4 个表达盒的 CRISPR-串联体示意图。 该 4 个 gRNA-串联体载体的示意图，每个 400 bp 的表达盒依次包含一个 U6 启动子、两个反向重复的 BbsI 位点（也标记为 BB）以及 gRNA 骨架结构。在混样反应过程中，BbsI 位点会被具有匹配突出末端的 gRNA 片段所替换，因而随之丢失。用于检测 gRNA 寡核苷酸正确插入情况的测序引物结合位点以蓝色箭头表示。Fwd = 正向引物，Rev = 反向引物，Link 1/2/3 = 连接区 1/2/3。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果；DNA片段；EcoRI、BglII、BbsI酶；示意图；分子量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：串联体载体的代表性酶切图谱。（A）3个和4个gRNA串联体载体经EcoRI与BglII双酶切的结果。正确的酶切图谱以绿色对勾标记，仅含有1个或2个gRNA插入片段的载体则以红色叉号标记。第1泳道显示用作阳性对照的4个gRNA串联体亲本载体的酶切结果（以“+”标记）；同样，第5泳道显示用作阳性对照的3个gRNA串联体亲本载体的酶切结果（以“+”标记）。（B）使用BbsI酶切，显示未酶切串联体载体的正确大小（由绿色对勾指示）。含有gRNA的串联体载体若丢失了BbsI酶切位点，则作为阳性对照，以“+”标记。<a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="GFP表达的荧光显微镜图像；与明场图像的比较；细胞分布情况" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：成功电穿孔肠类器官的代表性图像。转染GFP质粒有助于评估转染效率。电穿孔后约24小时，已可见含有少量细胞的类器官，若电穿孔操作成功，其中多达70%的类器官会显示绿色荧光。BF = 明场，GFP = 绿色荧光蛋白。比例尺 = 2,000 µm。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="类器官培养中的细胞反应；显微镜图像；基因敲除与野生型比较；分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：突变型肠类器官的代表性图像。 敲除Wnt信号通路的负调控因子Axin1和Rnf43及其同源基因后，肠类器官对生长因子剥夺具有抗性。具体而言，Axin1/2基因敲除类器官（Axin1/2 KO）在缺乏R-spondin（EN：EGF + Noggin）和Wnt（EN + IWP2：EN + Porcupine抑制剂）的条件下仍能生长，而Rnf43/Znrf3突变类器官（R&amp;Z KO）仅能在缺乏R-spondin（EN）的条件下存活。相比之下，野生型（WT）类器官仅能在对照培养条件（WENR + Nic：Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nicotinamide）下存活。比例尺 = 1,000 µm。 <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>基础培养基</td>
			<td></td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 °C 保存 4 周</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞培养基</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>参见材料表</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺 100x</td>
			<td>5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>缓冲剂 1 M</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>参见材料表</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素 100x</td>
			<td>5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WENR + Nic（Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + 尼克酰胺）</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 °C 保存 2 周</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基础培养基</td>
			<td>至多 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经细胞无血清添加剂（50x）</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>参见材料表</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经细胞无血清添加剂（100x）</td>
			<td>500 μL</td>
			<td>参见材料表</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-乙酰半胱氨酸（500 mM）</td>
			<td>125 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>小鼠 EGF（100 μg/mL）</td>
			<td>25 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>小鼠 Noggin（100 μg/mL）</td>
			<td>50 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin 条件培养基</td>
			<td>5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt3a 条件培养基</td>
			<td>25 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>尼克酰胺（1 M）</td>
			<td>250 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EN + CHIR + Y-27632（EGF + Noggin + CHIR + Y-27632）</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 °C 保存 2 周</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>不含青霉素-链霉素的基础培养基</td>
			<td>至多 20 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经细胞无血清添加剂（50x）</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>参见材料表</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经细胞无血清添加剂（100x）</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>参见材料表</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-乙酰半胱氨酸（500 mM）</td>
			<td>50 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>小鼠 EGF（100 μg/mL）</td>
			<td>10 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>小鼠 Noggin（100 μg/mL）</td>
			<td>20 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632（10 μM）</td>
			<td>20 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021（8 μM）</td>
			<td>10 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EN（EGF + Noggin）</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 °C 保存 4 周</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>基础培养基</td>
			<td>至多 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经细胞无血清添加剂（50x）</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>参见材料表</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经细胞无血清添加剂（100x）</td>
			<td>500 μL</td>
			<td>参见材料表</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-乙酰半胱氨酸（500 mM）</td>
			<td>125 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>小鼠 EGF（100 μg/mL）</td>
			<td>25 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>小鼠 Noggin（100 μg/mL）</td>
			<td>50 μL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：类器官培养基成分。

本方案描述了将多个单导向RNA克隆到一个导向RNA串联载体中的步骤，该方法特别适用于利用CRISPR/Cas9技术创建多基因敲除。文中以肠道类器官中双基因敲除的构建为例，展示了该方法的一种可能应用。

利用CRISPR串联体在小鼠小肠类器官中进行多基因敲除的实验方案

CRISPR/Cas9 技术极大地提高了功能缺失研究的可行性和速度，而这类研究对于理解基因功能至关重要。在……

本实验方案的总体目标是将多个引导RNA克隆至一个CRISPR串联载体中，并在小鼠肠道类器官中实现高效电穿孔，从而同时敲除多个基因。该方法可通过克服潜在的平行代偿效应，显著提高功能缺失研究的效率。我们所采用的CRISPR串联策略的主要优势在于仅需一步克隆操作，简便快捷，并可实现最多四个不同基因的同时敲除。该实验操作将由本实验室的博士生Alessandra Merenda进行演示。将引导RNA（gRNA）克隆至CRISPR串联体载体的过程，首先需进行一个反应，使每条gRNA寡核苷酸的上链与下链退火，并对其末端进行磷酸化。在冰上配制反应体系：针对三个串联体，加入3微升gRNA上链、3微升gRNA下链、2微升T4 DNA连接酶缓冲液、1微升T4多核苷酸激酶，并加水至总体积为20微升。通过移液充分混匀，并使用以下程序运行热循环仪：37 摄氏度反应 30 分钟，95 摄氏度反应 5 分钟，以每分钟 0.3 摄氏度的速率降温至 25 摄氏度，然后在 4 摄氏度下保存。下一步为 Bbs1 混合反应，将预先退火的 gRNA 寡核苷酸插入至串联体载体的相应位置。用无 DNA、无 RNA 的水将反应混合物按 1:100 比例稀释，以构建含三个和四个 gRNA 的串联体载体。在冰上配制 Bbs1 搅拌反应体系。每反应使用 100 纳克 CRISPR-concatemer 载体、10 微升寡核苷酸混合物、1 微升限制性内切酶缓冲液、1 微升 DTT、1 微升 ATP、1 微升 Bbs1 酶、1 微升 T7 连接酶，并加水至总体积为 20 微升。用移液器充分混匀，同时设置包含载体的阴性对照。使用以下程序在热循环仪中进行反应：用于克隆三个和四个 gRNA 串联体时，进行 50 个循环，每个循环为 37 摄氏度 5 分钟和 21 摄氏度 5 分钟，随后在 37 摄氏度保持 15 分钟，然后在 4 摄氏度长期保存。对于两个 gRNA 串联体，采用相同的设置，但第一步循环数为 25 个循环。Bbs1 洗牌反应完成后，取每个连接混合物 11 µL，加入 1.5 µL 外切酶缓冲液、1.5 µL ATP、1 µL DNA 外切酶以及水，使总体积达到 15 µL。在37摄氏度孵育30分钟，随后在70摄氏度孵育30分钟。接着，按照标准方案，将反应混合物用于转化化学感受态的大肠杆菌（E. coli）。为确认CRISPR串联体载体中存在gRNA插入片段，使用接种环挑取细菌菌落，并将每个菌落接种于4毫升LB培养基中。在37摄氏度的摇床中过夜培养克隆。次日，按照生产商说明书，使用质粒小提试剂盒提取DNA。将每种DNA样本约200纳克与10单位EcoR1及5单位BglII混合，总体积为10微升的反应体系。设置一个单独的反应体系，其中包含相应的原始载体，作为大小比较的阳性对照。将反应体系在37摄氏度下孵育3小时。在1%琼脂糖凝胶中以90伏电压电泳约20分钟，以分析酶切反应产物。使用紫外透射仪观察凝胶，以鉴定含有正确插入片段大小的克隆。为确认gRNA已克隆至正确位置，从而导致所有BbsI识别位点均丢失，用5单位BbsI酶切所选克隆。同时设置单独的反应体系，以相应的原始载体作为对照。在37摄氏度孵育三小时，将消化反应产物在1%琼脂糖凝胶中以90伏电泳约20分钟。使用紫外透射仪观察凝胶，鉴定未被Bbs1切割的载体。进行类器官传代用于电穿孔时，每次转染至少接种48孔板中的六个孔。将类器官接种于20 μL基底膜基质液滴中，每孔加入250 μL含烟酰胺的WENR培养基，在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养。第2天，弃去含烟酰胺的WENR培养基，更换为250 μL不含抗生素的EGF、noggin、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂培养基。第3天，将类器官培养基更换为含EGF、noggin、GSK3抑制剂、ROCK抑制剂和1.25%二甲基亚砜（DMSO）的不含抗生素培养基。第4天，使用1毫升移液器枪头破坏基底膜基质小滴，将类器官转移至1.5毫升离心管中。将48孔板中四个孔的培养物收集至同一根离心管中。使用P200移液器反复吹打约200次，将类器官机械性地剪切为小片段。在室温下以600 × g离心五分钟。离心后，弃去所有试管中的上清液，并将沉淀物重悬于一毫升细胞培养级重组蛋白酶中。在37 °C孵育，时间不超过五分钟。必须仔细监测蛋白酶处理过程，因为电穿孔的成功与否取决于能否获得含有细胞簇而非单个细胞的细胞悬液。取50微升样品滴，在倒置光学显微镜下使用4倍物镜进行观察。理想的细胞簇包含10至15个细胞，这有助于提高电穿孔后的细胞存活率。将细胞悬液转移至低吸附的15毫升离心管中，并通过加入9毫升不含抗生素的基础培养基终止消化。在室温下以600 × g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升低血清培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，每次电穿孔反应至少需要1 × 10⁵个细胞。首先，在含有细胞悬液的15 mL离心管中加入9 mL低血清培养基，于室温下以400 × g离心3分钟。吸除所有上清液，将沉淀重悬于电穿孔溶液中。向两个新离心管中各加入总量为10微克的DNA。然后加入电穿孔溶液，使终体积达到100微升，并将细胞-DNA混合物置于冰上保存。将细胞-DNA混合物转移至电穿孔比色皿中，再将比色皿放入电穿孔仪的电转槽内。按下电穿孔仪上的相应按钮测量阻抗，并确保其值在0.030至0.055欧姆之间。根据文本方案中指定的设置进行电穿孔操作。向电穿孔杯中加入400 µL电穿孔缓冲液和rock抑制剂，然后将其中所有内容转移至一个1.5 mL离心管中。室温孵育30分钟，使细胞恢复。30分钟后，室温下以400 × g离心3分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于每孔20微升基底膜基质中。在48孔板中每孔接种约1×10⁴至1×10⁵个细胞，并加入含EGF、noggin、GSK3抑制剂、rock抑制剂和1.25%二甲基亚砜的培养基。在37°C下培养。次日，更换为含EGF、noggin、GSK3抑制剂和rock抑制剂的培养基，并通过观察GFP表达情况检测转染效率。将类器官置于37°C条件下培养。两天后，更换为新鲜培养基。电穿孔四天后，将培养基更换为含烟酰胺和ROCK抑制剂的WENR培养基，并继续在37°C条件下孵育细胞。通过用EcoR1和BglII进行双酶切，确认串联体载体中插入了正确数量的gRNA。预期较小条带的大小约为：四gRNA串联体载体为1.6千碱基，三gRNA串联体载体为1.2千碱基。此外，用Bbs1酶切可证实gRNA已克隆至正确位置，因此所有Bbs1识别位点均消失。通过电穿孔将验证后的构建体递送至小鼠肠道类器官，可实现高达70%的转染效率，GFP表达结果已证实该效率。观看本视频后，您应能够充分了解如何构建gRNA串联载体，以及如何利用电穿孔技术高效地将这些载体递送至三维类器官培养体系，从而实现多个基因的同步敲除。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用CRISPR并发剂的小鼠小肠组织中多基因敲除的方案

来源：Van Lidth de Jeude, J. F., 等. 肠类器官的慢病毒转导及下游分析实验方案. J. Vis. Exp.

利用慢病毒载体将基因递送至小鼠肠道类器官

本视频介绍了一种利用CRISPR串联体（CRISPR-concatemer）在培养的小鼠肠道类器官细胞中同时敲除多个基因的基因敲除技术。该方法可用于敲除致病基因，并阐明目标基因及其旁系同源基因的功能。...

CRISPR串联体介导的多基因敲除：一种通过非同源末端连接途径在小鼠肠细胞中同时敲除多个基因的技术

在本视频方案中，我们将逐步讲解如何对原代肠上皮类器官进行慢病毒转导，并介绍这些培养物的后续处理及定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学分析方法。...

一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

我们详细描述了以下操作步骤：1）利用磁性纳米颗粒高效构建用于慢病毒或逆转录病毒转导的肠道类器官；2）对经基因工程改造的类器官制备冷冻切片。该方法为高效调控类器官中的基因表达以研究其下游效应提供了有力工具。...

利用磁性纳米颗粒转导病毒载体对原代小鼠肠道类器官进行遗传工程改造以用于冰冻切片

本方案描述了一种高效的电穿孔方法，可用于将较大质粒（最大达10 kB）转染至四种不同的胃肠道类器官实体。该方法可在一天内完成，无需 extensive...

通用且高效的胃肠道类器官基因工程电穿孔方案

本文介绍一种快速、直接的体内CRISPR/Cas9筛选方法，该方法通过超声引导下的子宫内胚胎慢病毒注射，同时评估多个基因在免疫功能健全小鼠皮肤和口腔中的功能。...

利用体内CRISPR/Cas9筛选技术同时评估小鼠皮肤和口腔中的基因功能

本实验方案描述了通过向受精卵显微注射CRISPR-Cas9系统和供体DNA，高效制备基因盒敲入和条件性敲除（floxed）小鼠的方法。...

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP...

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

本文概述了一种全面的实验方案，用于生成和利用实验室工程化胶质母细胞瘤类器官（LEGO），以研究基因型与表型之间的依赖关系，并筛选潜在的胶质母细胞瘤治疗药物。...

实验室构建的胶质母细胞瘤类器官培养与药物筛选

本文介绍了通过电穿孔技术对人脑皮层类器官切片进行急性基因操作的方法。这些皮层类器官模型特别适合显微注射，因为切片后可轻易识别出类似脑室的结构，从而能够对人类皮层发育、神经发育障碍以及皮层进化进行功能研究。...

电穿孔转染人脑皮层类器官切片用于基因功能研究

学习使用CRISPR并发剂在小鼠肠道类器官中实现多基因敲除的高效方案。该方法通过单次克隆步骤同时敲除多达四个基因，显著提高功能缺失研究的效率，为基因功能研究提供可靠工具。

利用CRISPR串联体在小鼠小肠类器官中进行多基因敲除的实验方案

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