小分子杀线虫剂筛选试验:一种针对 Ditylenchus dipsaci 筛选潜在杀线虫剂的中等通量方法

植物寄生线虫，如 Ditylenchus dipsaci 是微小的蠕虫。活虫通过肌肉收缩表现出正弦运动，它们的运动性是它们在培养条件下健康的重要决定因素。

杀线虫剂（化学毒物）会干扰关键的生物过程，影响这些培养线虫的活动能力，导致它们死亡。

要筛选小分子杀线虫剂，请使用蒸馏的含水多孔板。使用干净的固定工具，将潜在的小分子杀线虫剂从化学储备板转移到测定板，以确保将一致数量的分子转移到每个孔中。

相同数量的线虫分配到板的每个孔中。密封板，同时保持潮湿条件，以支持线虫的生存和活动。轻轻搅拌孵育板，以防止蠕虫沉降。

孵化过程中，各种有毒小分子作用于蠕虫并杀死它们，而无毒的小分子则没有影响。在解剖显微镜下观察板，以识别具有非运动蠕虫种群的孔。

用氢氧化钠溶液 - 终点化学兴奋剂补充测定板。这会触发任何静止蠕虫的运动，并将它们与死去的蠕虫区分开来。

在一些井中氢氧化钠处理后存在非运动蠕虫，证实了相应小分子作为杀线虫剂的功效。

要制备测定板，将高压灭菌的蒸馏水倒入无菌槽中，并使用多通道移液器将40微升蒸馏水从槽中分配到平底96孔板的每个孔中。将 96 孔化学储备板中的化学品添加到测定板中，方法是将化学板固定三次。然后，将引脚转移到测定板中 10 次。在清洁液前面的纸上吸干。

要计算收集中的线虫数量，首先，重悬收集，然后使用低保留吸头将 5 微升溶液移液到载玻片上。使用解剖显微镜计算 5 微升中的线虫数量。然后，使用无菌蒸馏水将浓度调整为每微升两条蠕虫。

接下来，使用多通道移液器和槽将 10 微升样品添加到 96 孔板的每个孔中。用湿纸巾包好盘子，然后将它们放入盒子中。然后，添加额外的湿纸巾以稳定并确保板的最小移动，并在设置为 200 rpm 的 20 摄氏度摇动培养箱中贴在粘性垫上。

显微镜下观察第 5 天的板。计算DMSO溶剂对照和药物处理孔中移动和总D. dipsaci的数量。

如果蠕虫不动，则向孔中加入 2 微升 1 摩尔氢氧化钠，终浓度为 40 毫摩尔，以刺激运动。计算移动蠕虫的比例。在 D. dipsaci 筛选中，可重复产生 0% 移动蠕虫的孔被归类为强命中。