可筛选的在体内测定线粒体调节剂使用转基因生物发光秀丽隐杆线虫

以下实验的总体目标是确定使用模式生物的药物的线粒体毒性或有益作用。C 优雅。这是通过体内定量转基因 sea elgan 菌株中的 TP 水平来实现的，这些菌株表达与绿色荧光蛋白融合的萤火虫十字花科酶。

融合基因赋予线虫两个不同的特性。首先是当给予底物 Lucifer 时，线虫在可见光范围内发射的光与其细胞 A TP 储备成正比。第二个是，当用适当的波长照射时，它们会表现出强烈的绿色荧光。

荧光与 TP 水平的线虫无关，并且与它们的质量或数量成正比。因此，它可用于标准化生物发光测量。在典型的测定过程中，发育同步的蠕虫种群生长到 L 4 幼虫阶段。

然后用测试药物化合物处理线虫一段时间，然后测量荧光和生物发光。结果显示潜在的药物毒性。当生物发光降低时，增强的信号表明进一步测试对线粒体功能的有益影响。

与现有方法（如对培养细胞进行药物筛选）相比，该技术的主要优点是筛选是在整个活的多细胞生物体的生理环境中进行的，其中接近 50% 的人类遗传眼科。和人类一样，优雅实际上需要线粒体氧化磷酸化才能发展到成年期，它的线粒体在结构、功能、生物能量学方面也与哺乳动物线粒体有许多共同特征协议中的关键参数包括暴露开始暴露于线虫的发育阶段， 到感兴趣的药物和在每个孔中接种相似数量的线虫，当然，避免污染 在第一天。在无菌条件下，将线虫从一个 6 厘米长的线虫生长培养基板转移到 2 毫升 S 完全培养基中，放入每升 30 克大肠杆菌的培养瓶中。

在 S 完全培养基中加入 OP 50，然后在第 4 天振荡孵育培养瓶，漂白 GR 线虫培养物以收获虫卵并同步蠕虫种群。然后将卵在含有 15 毫升 S 完全培养基的玻璃瓶中孵育过夜，第二天，即第 5 天，线虫将处于相同的生长阶段。为了每次使用干净的吸头确定孵化蠕虫的数量，将三个 100 微升等分的线虫转移到含有 900 微升培养基的单独微管中，并辅以 0.01% 吐温 20 上下移液几次，以释放任何粘附在吸头上的蠕虫。

然后对来自每个一式三份稀释管的四个单独的 10 微升液滴中的线虫进行计数，并计算建立两个 20 毫升培养物所需的线虫悬浮液的体积，每 10 微升有 10 个线虫，倒出近似体积倒入两个预先称重的 15 毫升锥形管中。称量试管以确定分配的实际体积。然后，为了调整目标体积，轻轻涡旋并去除多余的体积。

现在，每管用总共 14 毫升新鲜 S 完全培养基洗涤线虫，然后将颗粒悬浮在 5 毫升 S 完全培养基中，每升 30 克等量。OP 50.将线虫转移到装有 15 毫升 S 的锥形玻璃瓶中，每升含有 30 克 equali。

OP 50 至每个培养瓶的总体积为 20 毫升，并记录进料时间。对 9 个 10 微升液滴中的线虫数量进行平均，以确认培养物稀释至每 10 微升 10 个线虫。将培养物放入培养箱中 42 至 44 小时。

第 7 天，将线虫培养物拉入单个培养瓶中，连续轻轻旋转。然后将 3、4 毫升等分的线虫转移到一个 60 毫升无菌槽中。使用 8 通道移液器对 Eloqua 进行 25 微升悬浮线虫，每孔注入 96 个。

孔黑色微量滴定板，底部平坦透明。然后将盖子放回盘子上，将盘子放在一边。每次接种两个板后，将另外两个 2.5 毫升等分试样的线虫转移到槽中以补充损失的体积。

用线虫接种 13 至 14 个板后，向每个孔中加入 74 微升 S 完全培养基，并将板转移到潮湿的腔室和摇动培养箱中，直到给药，同时板正在摇动。解冻 2 96 焊接药板进行测试。然后使用多通道移液器并每次更换吸头。

将 1 微升从第一个药物板的第一列转移到线虫板的第 1 至 5 列。将另一微升从药物板的第二列转移到线虫板的第 8 至 12 列。然后将 1 微升载体添加到线虫板的第 6 列和第 7 列中。

使用药物板中的其余色谱柱以相同的方式处理其余的线虫板，确保还包括两个全载体处理的板。然后在第 8 天将所有板放回振荡培养箱中的潮湿室中再放置 20 至 22 小时。为了制备用于荧光读数的背景对照板，将来自全载体处理的线虫板的孔内容物混合，让线虫沉降 2 到 3 分钟。

然后收集含有 snat 的细菌，并将 100 微升样品加载到底部透明的黑色微孔板的每个孔中。在显微镜下观察板，注意可以看到线虫的孔，以便从荧光背景估计中排除这些孔。然后最后读取荧光以测量每个板的生物发光。

反过来，向每个样品中分配 50 微升新鲜制备的发光缓冲液，将板放在摇动平台上，并在三分钟后启动计时器。每次测量以 1 秒读取发光。在第一个代表性实验中，已知的腐烂线粒体复合物 1 抑制剂在相对较短和较长时间的浓度暴露后降低了线虫的光输出。

在该实验中，除草剂百草枯被证明可以显著降低 C 菌株 PE 2 54 的生物发光 GFP 荧光和标准化生物发光。此外，生物发光下降大于荧光，这与线粒体功能降低和药物诱导的 TP 产生减少的已知作用一致。该图说明了增强线虫生物发光的化合物的示例，即单浓度为 8 毫摩尔的柠檬酸循环中间体草酰乙酸。

请注意，这些重复运行之间看到的实验变异性对于基于 Lucifer 的实验来说并不罕见。在这里，观察到萤火虫荧光素酶抑制化合物影响 25 微摩尔和 100 微摩尔的体外荧光素活性，而 DDD 化合物的活性几乎完全减弱。1， 4 3 4，虽然没有直接可比性，但在体内路西法抑制化合物处理后也观察到生物发光的显着下降。

证明生物发光的变化可能是由荧光素酶抑制剂的作用引起的，而不是由体内 A TP 水平的变化引起的。在执行此程序时，重要的是要考虑到化合物可以直接影响萤火虫荧光素酶的活性，而不是影响蠕虫的能量状态。因此，可以使用许多评估线粒体功能的技术来验证亚热量，例如，耗氧量的测定、活性氧的线粒体膜电位测定或海洋优雅菌株中线粒体的可视化。

带有 GFP 标签，线粒体。