一种可筛选的 在体 内 使用转基因生物发光技术检测线粒体调节剂的实验方法 秀丽隐杆线虫

以下实验的总体目标是利用模式生物秀丽隐杆线虫（C. elegans）鉴定药物的线粒体毒性或有益作用。该目标通过体内定量转基因线虫品系中的ATP水平来实现，这些品系表达萤光素酶与绿色荧光蛋白融合的报告基因。

该融合基因赋予线虫两种不同的特性。第一，当提供底物荧光素（Lucifer）时，线虫会根据其细胞内ATP储备量成比例地发出可见光。第二，当用适当波长的光照射时，它们会表现出强烈的绿色荧光。

荧光强度与线虫的三磷酸腺苷（ATP）水平无关，而与其生物量或数量成正比。因此，荧光可用于标准化生物发光的测量结果。在典型的检测过程中，一群发育同步化的线虫被培养至L4幼虫阶段。

随后，在测量荧光和生物发光之前，将线虫用待测药物化合物处理一段时间。结果可显示潜在的药物毒性。当生物发光减弱时，信号增强则表明该化合物可能对线粒体功能具有有益作用，值得进一步测试。

与现有的药物筛选方法（如在培养细胞上进行的药物筛选）相比，该技术的主要优势在于，筛选是在一种接近人类50%遗传眼科学相似性的完整活体多细胞生物的生理环境中进行的。与人类相似，秀丽隐杆线虫实际上需要线粒体氧化磷酸化才能发育至成年阶段，其线粒体在结构、功能和生物能量学方面也与哺乳动物线粒体具有许多共同特征。实验方案中的关键参数包括：开始暴露时线虫的发育阶段、暴露于目标药物的时间长度、线虫在各孔中接种数量的一致性，以及避免污染。在第一天，在无菌条件下，将线虫从一个六厘米的线虫生长培养基平板中转移至含有两毫升S完全培养基的锥形瓶中，并加入浓度为每升30克的大肠杆菌（E. coli）。

在S完全培养基中将OP 50培养至对数生长期，然后在第四天将培养瓶置于摇床中振荡培养，用次氯酸钠处理GR线虫培养物以收集卵并同步线虫群体。随后将卵在含有15毫升S完全培养基的玻璃烧瓶中过夜孵育，并于次日（第五天）继续振荡培养，此时线虫将处于相同的生长阶段。为确定孵化的线虫数量，每次使用新的无菌枪头，分别取三份100微升线虫样品，转移至含有900微升培养基的独立微量离心管中，培养基中添加0.01%吐温-20，上下吹打数次以释放可能黏附在枪头上的线虫。

然后从三个重复的稀释管中，分别取四个 10 微升液滴，统计每个液滴中的线虫数量，并计算为建立两个含 10 条线虫/10 微升的 20 毫升培养液所需的线虫悬液体积，将大致体积倾入两个预先称重的 15 毫升锥形管中。称量管重以确定实际分配的体积。随后轻轻涡旋混匀以调整至目标体积，并去除多余液体。

现在，每管用总共 14 毫升新鲜的 S 完全培养基洗涤线虫，并将沉淀重悬于 5 毫升含 30 克/升 OP50 大肠杆菌的 S 完全培养基中。将线虫转移至含有 15 毫升 S 完全培养基（含 30 克/升 OP50 大肠杆菌）的锥形玻璃烧瓶中。

将OP 50补至每个培养瓶总体积为20毫升，并记录喂养时间。取九个10微升液滴中的线虫数量取平均值，以确认培养物已稀释至每10微升含10条线虫。将培养物置于培养箱中孵育42至44小时。

在第七天，将线虫培养物转移至一个烧瓶中，并持续轻轻摇晃使其混合。然后取三至四份每份4毫升的线虫悬液，转移至一个60毫升的无菌槽中。使用八通道移液器将每孔25微升的悬浮线虫加入96孔板中。

使用底部平坦透明的黑色微孔板。然后将盖子重新盖回板上，并将板放置一旁。每次接种两块板后，向槽中转移另外两份2.5毫升的线虫等分试样，以补充损失的体积。

接种线虫至13到14块培养板后，向每个孔中加入74微升S完全培养基，并将培养板转移至潮湿 chamber 和摇床培养箱中，在药物处理前持续摇动培养。解冻2块用于检测的96孔药物板。然后使用多通道移液器，并每次更换吸头。

从第一块药物板的第一列转移一微升至线虫板的第1至第5列。从药物板的第二列转移另一微升至线虫板的第8至第12列。然后向线虫板的第6列和第7列各加入一微升溶剂。

使用药物板中的剩余列以相同方式处理其余线虫板，并确保同时设置两个仅含载体的对照板。随后将所有板放回摇床培养箱中的湿室，于第8天继续孵育20至22小时。为准备荧光读数用的背景对照板，合并一个仅含载体处理的线虫板中的各孔内容物，静置2至3分钟使线虫沉降。

然后收集含有snat的细菌，并将100微升样品加入到黑色透明底微孔板的每个孔中。在显微镜下观察该微孔板，记录可见线虫的孔，以便从荧光背景估计中排除这些孔。最后读取荧光值，以测定每块微孔板的生物发光。

随后，向每个孔中加入 50 µL 新鲜配制的发光缓冲液，将培养板置于摇床上，摇动 3 分钟后启动计时器。每次测量读取发光信号的时间为 1 秒。在此项首次代表性实验中，已知的线粒体复合体 I 抑制剂在一系列浓度下，经过相对较短和较长的暴露时间后，均降低了线虫的发光输出。

在本实验中，除草剂百草枯显著降低了C株PE 2 54的生物发光、GFP荧光以及归一化生物发光。此外，生物发光的下降程度大于荧光的下降，这与该药物已知的抑制线粒体功能和减少ATP生成的作用一致。该图展示了一种能够增强线虫生物发光的化合物示例，即柠檬酸循环中间产物草酰乙酸，在8毫摩尔单一浓度下的效果。

需要注意的是，这些重复实验之间观察到的实验变异性在基于荧光素酶的实验中并不罕见。在此，萤火虫荧光素酶抑制化合物在体外对荧光素酶活性的影响在25微摩尔和100微摩尔浓度下可见，其中DDD化合物几乎完全抑制了酶活性。1, 4 3 4，尽管无法直接比较，但在体内给予荧光素酶抑制化合物处理后，也观察到生物发光显著下降。

表明生物发光的变化可能源于荧光素酶抑制剂的作用，而非体内ATP水平的变化。在进行该实验操作时，需要注意某些化合物可能会直接作用于萤火虫荧光素酶的活性，而非影响线虫的能量状态。因此，可通过多种评估线粒体功能的技术来验证这些结果，例如耗氧量测定、线粒体膜电位检测、活性氧物种的测定，或在线虫秀丽隐杆线虫品系中对线粒体进行可视化观察。

带有GFP标签的线粒体。