干涉反射显微镜用于微管动力学的无标记可视化

干涉反射显微镜能够对动态增长和收缩的微管进行成像。

石蜡条固定在一个盖玻片上，并在上面放一个稍小的盖玻片。加热使石蜡熔化，形成密封通道。通过通道移液含有抗体的溶液。抗体附着在盖玻片表面。添加封闭溶液，阻断抗体未结合区域并防止非特异性蛋白质结合。

将盖玻片放在显微镜载物台上。将样品加热器设置为有利于微管生长的温度。

液微管种子用不可水解的三磷酸鸟苷（GTP）类似物稳定。种子与抗体包被的盖玻片结合。加入含有未标记微管蛋白、GTP 和还原剂的缓冲液。

在最佳温度和缓冲条件下，种子充当成核位点，允许未标记的微管蛋白结合和微管生长。

开始成像。入射光通过孔径光阑聚焦到分束器上，分束器将光部分反射到物镜上，照亮样品。盖玻片的玻璃缓冲界面部分反射入射光。剩余的入射光穿过并在缓冲液-微管界面处反射。

根据微管-盖玻片距离，来自两个界面的反射光束发生干涉，产生相长干涉——光束组合产生明亮信号，或相消干涉——光束抵消产生暗信号。

微管可视化为高对比度图像。捕捉延时图像，检测微管的生长和收缩。

首先，使用适当的滤光片立方体将 50/50 反射镜插入荧光显微镜的滤光轮中。小心处理镜子，因为它们通常有防反射涂层。转向具有高数值孔径的高放大倍率物镜。这里显示的是一个 100 倍油物镜，数值孔径为 1.3。

接下来，使用剃须刀片和显微镜载玻片作为直尺切割 3 毫米宽的塑料石蜡薄膜条。将两条相距 3 毫米的塑料石蜡薄膜条放在干净的 22 x 22 毫米盖玻片上。然后，在条带顶部放置 18 x 18 毫米的盖玻片以形成通道。

盖玻片转移到 100 摄氏度的加热块中 10 至 30 秒，使石蜡膜形成密封通道。使用移液器，通过灌注流入每毫升 50 微克抗罗丹明抗体，并将载玻片孵育 10 分钟。

孵育后，使用过滤的BRB80洗涤通道五次。然后，在过滤的BRB80中流动1%泊洛沙姆407，以阻断表面防止非特异性结合，并将载玻片孵育10分钟。再次，使用过滤后的 BRB80 清洗通道五次。

为防止样品变干，在通道末端添加两个过滤后的BRB80液滴，并根据需要添加更多缓冲液。将样品放在显微镜载物台上并打开落射照明光源。聚焦在石蜡膜边缘以找到样品表面，然后移动视场以将视图设置为腔室中心。由于光路内光学器件的光的反向反射，当物镜上下移动时，您将观察到多个表面。

接下来，将视场光阑置于视野的中心 view通过将其关闭一半并使用调节螺钉 振膜正确对齐后，重新打开它。然后，滑入 Bertrand 镜头以查看后焦平面，也称为物镜的出瞳。

将光圈振膜关闭到出瞳边缘之外，并使用调节螺钉将孔径振膜相对于出瞳的居中。通过打开光圈光阑并将其边缘与出瞳的边缘相匹配来仔细检查。然后，将光圈光圈设置为物镜数值孔径的 2/3 左右。

要使用脑微管蛋白对微管动力学进行成像，首先将样品加热器温度设置为 37 摄氏度。使用移液器，流入 10 微升 GMPCPP 稳定的微管种子，并通过对表面进行实时成像来监测它们与表面的结合。一旦 10 到 20 个种子结合在视场内，使用两倍于预热和过滤的 BRB80 通道体积洗涤样品。

接下来，流入 10 微升聚合混合物。

要测量微管生长，请使用采集软件设置延时摄影，每 5 秒采集一次图像，持续 15 分钟。通过在每个时间点获取 10 的平均图像来增强对比度。获取背景图像，如上一节所示。通过转到"图像"，选择"堆栈"，然后选择"Z 项目"，然后选择"中位数"来计算中位数。通过转到 过程（Process），转到 图像计算器（Image Calculator），然后从下拉菜单中选择 减去（Subtract） 来减去相应的背景。确保选中 32 位浮点结果选项。

对于微管收缩，通过将时间延迟设置为零并将曝光时间保持在 10 毫秒，以每秒 100 帧的速度采集图像。