可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

尽管存在许多协同作用的例子，但大多数研究仍单独考察肌动蛋白或微管蛋白。该方法能够在同一反应中实现对这两种动态多聚体的可视化观察。此技术使研究者能够评估多种调控蛋白所表现出的涌现特性，而这些特性只有在肌动蛋白和微管蛋白处于动态状态时才能被观察到。

该技术可进一步扩展，以包含脂质或提取物，从而更接近构建合成细胞的目标。首先将 PEG-硅烷和生物素-PEG-硅烷粉末的等分试样解冻，并将 PEG 粉末溶于 80% 乙醇中，配制涂层储备液，其中 mPEG-Silane 浓度为 10 毫克/毫升，Biotin-PEG-Silane 浓度为 2 至 4 毫克/毫升。用镊子从乙醇储存液中取出洁净的盖玻片。

用氮气吹干，并在洁净的培养皿中储存。用100微升包被液对盖玻片进行包被，于70摄氏度孵育至少18小时，或孵育至使用前。将12条双面背胶胶带裁剪至24毫米长度。

取下胶带背衬的一侧，将胶带固定在洁净成像腔室的六条凹槽旁边。取下第二层胶带背衬，暴露每条腔室凹槽处胶带的粘性面，并将腔室粘性面向上放置于洁净的表面上。按1:1比例在小型称量皿中混合环氧树脂与固化剂溶液，使用P1000枪头在每条成像腔室凹槽末端的胶带条之间滴加一滴混合好的环氧树脂。

然后，将腔室（带胶带或环氧树脂的一面朝上）放置在干净的表面上。从70摄氏度的培养箱中取出一块包被的盖玻片，用双蒸水冲洗盖玻片的包被面和未包被面各六次。用过滤的氮气吹干，然后将盖玻片有包被的一面朝向胶带，固定到成像腔室上。

使用 P200 或 P1000 移液器吸头对用胶带固定的玻璃界面施加压力，以确保胶带与盖玻片之间形成良好的密封。将组装好的灌流腔室在室温下孵育至少 5 至 10 分钟，使环氧树脂充分固化，完全密封腔室孔后方可使用。灌流腔室在组装后 12 至 18 小时内失效。

使用灌流泵，通过在灌流腔室中依次交换预处理溶液，先灌注50微升1% BSA以预处理成像腔室。移除 lure lock 接头储液池中的过量缓冲液。随后，灌注50微升0.005毫克/毫升的链霉亲和素，并在室温下孵育1至2分钟。

从储液池中移除多余的缓冲液。加入50微升1% BSA以阻断非特异性结合，并孵育10至30秒。从储液池中移除多余的缓冲液。

接下来，加入50微升预热的1x TIRF缓冲液，随后加入50微升用1x TIRF缓冲液稀释的稳定化且50%生物素化的微管种子。在成像第一个生化反应前，将载物台或物镜加热装置设定为35至37摄氏度，并维持30分钟。然后，将图像采集间隔设置为每5秒一次，持续15至20分钟。

接下来，首先调节聚合反应以启动肌动蛋白丝的组装，然后将488和647激光的曝光时间设置为50至100毫秒，功率设置为5%至10%。在647纳米波长下采集图像，并进行适当调整。随后，在第二个预处理的灌注孔中调节聚合反应，以启动微管的组装。

在488纳米波长下观察，并进行适当调整。使用前不超过15分钟，将3微升10微摩尔的488标记微管蛋白与7.2微升100微摩尔的荧光未标记微管蛋白等分试样混合。然后，将3微升稀释的生物素化相关肌动蛋白与适当体积的荧光未标记和荧光标记肌动蛋白混合，使最终混合物中总肌动蛋白浓度为12.5微摩尔，荧光标记比例为10%至30%。

在成像前不超过15分钟，将2微升12.5微摩尔的肌动蛋白混合储备液与微管蛋白储备混合液混合，制备细胞骨架反应混合液。置于冰上保存，直至使用。通过组合所有其他实验组分和蛋白质（包括2倍TIRF缓冲液、抗淬灭剂、核苷酸、缓冲液以及辅助蛋白）来制备蛋白反应混合液。

将细胞骨架混合液和蛋白质反应混合液分别在37摄氏度孵育30至60秒。通过将蛋白质反应混合液加入细胞骨架混合液中并混匀来启动反应。向灌流室中加入50微升反应混合液，其中含有1x TIRF缓冲液，并补充15微摩尔游离微管蛋白、1毫摩尔GTP、0.5微摩尔肌动蛋白单体以及适量的缓冲液对照。

使用显微镜软件记录延时电影，每5秒采集一次，持续15至20分钟。对新的灌注孔进行预处理，并用目标调控蛋白及缓冲液对照替换缓冲液体积。进行图像采集，以评估调控蛋白在新生肌动蛋白微管功能中的作用。

这些图像展示了微管和肌动蛋白丝动态的示例测量结果。微管蛋白通道的平均时间投影可有效显示用于生成线扫描图（Kymograph）的总微管长度。黑色虚线对应于动态微管的两个示例线扫描图。

每张Kymograph图展示了微管的生长和解聚阶段。此处显示了两个时间推移图像拼接示例，描绘了单个肌动蛋白丝正在进行活跃聚合的情况。肌动蛋白丝的伸长速率通过单位微摩尔肌动蛋白下其长度随时间变化曲线的斜率来计算。

因此，在比较通常于1微摩尔肌动蛋白浓度下测定的反应速率时，必须对0.5微摩尔肌动蛋白反应应用两倍的校正因子。此处展示了来自五根纤维的示例。图中显示了在无或有250纳摩尔Tau存在条件下聚合的肌动蛋白纤维中动态微管的全内反射荧光（TIRF）图像。

蓝色虚线和箭头标示了每种条件下用于生成线扫描图的划线位置。可在每个区域设定的时间点对肌动蛋白区域中微管的重叠情况进行评分。细胞骨架蛋白，特别是肌动蛋白、微管及其调控因子，对冻融循环非常敏感。

为了确保一致性和成功，应使用高纯度且妥善保存的蛋白质。