通过全内反射荧光（TIRF）显微镜 在体外 可视化肌动蛋白和微管耦合动力学

尽管有许多协调的例子，但大多数研究都单独检查肌动蛋白或微管蛋白。该方法允许在单个反应中可视化两种动态聚合物。该技术允许用户评估各种调节蛋白的紧急特性，这些特性只能通过动态版本的肌动蛋白和微管看到。

该技术可以扩展到包括脂质或提取物，以更接近于构建合成细胞。首先解冻PEG-硅烷和生物素-PEG-硅烷粉末的等分试样，然后将PEG粉末溶解在80%乙醇中，以产生每毫升mPEG-硅烷10毫克和每毫升2至4毫克生物素-PEG-硅烷的涂层储备溶液。使用镊子从乙醇储存中取出干净的盖玻片。

用氮气干燥并储存在干净的培养皿中。用100微升涂层溶液涂覆盖玻片，并在70摄氏度下孵育至少18小时或直到使用。将 12 条双背双面胶带切割成 24 毫米的长度。

取下胶带背衬的一侧，并将胶带片固定在干净的成像室上存在的六个凹槽附近。取下第二块胶带背衬，沿每个腔室凹槽露出胶带的粘性一面，并将腔室胶带面朝上放在干净的表面上。在小型称重管中一对一地混合环氧树脂和固化剂溶液，并使用P1000尖端在每个成像室凹槽末端的胶带条之间放置一滴混合环氧树脂。

然后，将腔室、胶带或环氧树脂面朝上放在干净的表面上。从70摄氏度的培养箱中取出涂层的盖玻片，并用双蒸馏水冲洗盖玻片的涂层和未涂层表面六次。用过滤后的氮气干燥，然后贴在成像室上，盖玻片涂层朝向胶带。

使用P200或P1000移液器吸头对胶带玻璃界面施加压力，以确保胶带和盖玻片之间具有良好的密封性。在室温下孵育组装的腔室至少5至10分钟，以使环氧树脂在使用前完全密封腔室孔。灌注室在组装后 12 至 18 小时内过期。

使用灌注泵，通过流动 50 微升 1% BSA 在灌注室中按顺序交换调理溶液，以启动成像室。从诱饵锁接头储液器中取出多余的缓冲液。然后，流动50微升0.005毫克/毫升链霉亲和素，并在室温下孵育一至两分钟。

从储液槽中取出多余的缓冲液。流动50微升1%BSA以阻断非特异性结合并孵育10至30秒。从储液槽中取出多余的缓冲液。

接下来，流动50微升温热的1x TIRF缓冲液，然后在1x TIRF缓冲液中稀释的50微升稳定和50%生物素化微管种子。设置载物台或物镜加热器装置，在对第一次生化反应进行成像之前，将35至37摄氏度的温度保持在30分钟。然后，将采集间隔设置为每 5 秒一次，持续 15 到 20 分钟。

接下来，通过首先调节聚合反应以启动肌动蛋白丝组装，将488和647激光曝光设置为50至100毫秒，以5%至10%的功率。获取647纳米的图像并进行适当的调整。然后，在第二条件灌注孔中调节聚合反应以启动微管组装。

在488纳米处进行可视化并进行适当的调整。使用前不超过15分钟，将三微升10微摩尔488微管蛋白与7.2微升等分试样的100微摩尔荧光未标记微管蛋白混合。然后，将三微升稀释的生物素相关肌动蛋白与适当体积的荧光未标记和标记的肌动蛋白组合，使得最终的混合物将是12.5微摩尔总肌动蛋白与10%至30%荧光标记。

通过在成像前不超过15分钟将两微升的12.5微摩尔肌动蛋白混合物与微管蛋白储备液混合液混合来制备细胞骨架混合物。储存在冰上直至使用。通过组合所有其他实验组分和蛋白质来制备蛋白质反应混合物，包括2x TIRF缓冲液，抗漂白剂，核苷酸，缓冲液和辅助蛋白。

将细胞骨架混合物和蛋白质反应混合物分别在37摄氏度下孵育30至60秒。为了启动反应，将蛋白质反应混合物的内容物加入细胞骨架混合物中并混合。将含有1x TIRF缓冲液、补充有15微摩尔游离微管蛋白、1毫摩尔GTP、0.5微摩尔肌动蛋白单体和适当体积缓冲液的50微升反应混合物流向灌注室。

使用显微镜软件录制一张延时短片，每5秒采集一次，持续15至20分钟。调理新的灌注孔，并用目标调节蛋白和缓冲液对照替换缓冲液体积。获取以评估新兴肌动蛋白微管功能的调节蛋白。

这些图像显示了微管和肌动蛋白丝动力学的示例测量。微管蛋白通道的平均时间投影有效地可视化了用于生成Kymograph图的线扫描的总微管长度。黑色虚线对应于动态微管的两个示例Kymographs。

每个Kymograph上显示了微管的生长和拆卸阶段。这里显示了两个描述单肌动蛋白丝主动聚合的延时图像蒙太奇示例。伸长率计算为每微摩尔肌动蛋白肌动蛋白长度随时间变化的曲线的斜率。

因此，必须对0.5微摩尔肌动蛋白反应施加2的校正因子，以比较通常在一微摩尔肌动蛋白浓度下确定的速率。此处显示了五根灯丝中的示例。这里显示了在不存在或存在250纳摩尔Tau的情况下聚合的肌动蛋白细丝中动态微管的全内反射荧光或TIRF图像。

蓝色虚线和箭头标记磨损一条线被绘制为对应于每个条件的线扫描图。肌动蛋白区域中微管之间的重叠可以在每个区域的设定时间点进行评分。细胞骨架蛋白，特别是肌动蛋白，微管及其调节剂对冻融循环非常敏感。

为了保持一致性和成功，请使用高纯度和适当储存的蛋白质。