Name: 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜 在体外 可视化肌动蛋白和微管耦合动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 了解如何使用全内反射荧光显微镜在体外同时可视化肌动蛋白和微管的动态耦合过程。该方法可评估调控蛋白对细胞骨架动力学的影响，为合成细胞研究提供重要技术基础。

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感谢Marc Ridilla（Repair Biotechnologies）和Brian Haarer（SUNY Upstate）对本实验方案提出的有益建议。本研究工作由美国国立卫生研究院（GM133485）资助。

1. 清洗盖玻片
注意：按照 Smith 等人（2013）的方法28清洗（24 mm x 60 mm，#1.5）盖玻片。
<ol>
	<li>将盖玻片按顺序排列在塑料载片储存盒中。</li>
	<li>依次将盖玻片浸入以下溶液中，并超声处理 30–60 分钟，每次更换溶液之间用 ddH2O 漂洗 10 次：含一滴洗洁精的 ddH2O；0.1 M KOH。盖玻片可保存在 100% 乙醇中，最长可达 6 个月。 
	注意：切勿用手套以外的手指接触玻璃表面，应使用镊子操作。</li>
</ol>
2. 使用mPEG-和生物素-PEG-硅烷对已清洗的（24 mm × 60 mm，#1.5）盖玻片进行包被
注意：本方案专门使用生物素-链霉亲和素系统将肌动蛋白和微管定位在TIRF成像平面内。也可使用其他包被方法和系统（例如抗体、聚-L-赖氨酸，NEM肌球蛋白等。
<ol>
	<li>解冻 PEG-硅烷和生物素-PEG-硅烷粉末的分装样品。</li>
	<li>在使用前，将 PEG 粉末溶解于 80% 乙醇（pH 2.0）中，配制终浓度为 10 mg/mL 的 mPEG-硅烷和 2–4 mg/mL 的生物素-PEG-硅烷的包被储备液。 
	注意：PEG 粉末在宏观上可能看似已溶解，但在微观层面可能尚未完全溶解。充分重悬需持续吹打约 1–2 分钟。建议在粉末外观上溶解后，再额外吹打 10 次。 
	警告：配制 80% 乙醇（pH 2.0）时会使用浓盐酸，操作时请佩戴手套以保护皮肤。</li>
	<li>用镊子从乙醇中取出洁净的（24 mm × 60 mm，#1.5）盖玻片，用氮气吹干，并存放于洁净的培养皿中。</li>
	<li>用 100 µL 包被液对盖玻片进行包被：包被液为 80% 乙醇（pH 2.0）中含 2 mg/mL mPEG-硅烷（分子量 2,000）和 0.04 mg/mL 生物素-PEG-硅烷（分子量 3,400）的混合溶液。 
	注意：如需稀疏包被（推荐），使用 2 mg/mL mPEG-硅烷和 0.04 mg/mL 生物素-PEG-硅烷；如需密集包被，则使用 2 mg/mL mPEG-硅烷和 4 mg/mL 生物素-PEG-硅烷。</li>
	<li>将盖玻片在 70 °C 下孵育至少 18 小时，或孵育至使用前。 
	注意：若包被后的盖玻片在 70 °C 下储存超过 2 周，其性能会下降。</li>
</ol>
3. 成像流室的组装
<ol>
	<li>将12条双面背胶胶带裁剪为24 mm长。撕去胶带一侧的背衬，将胶带条紧邻固定在洁净成像室的六条凹槽旁。 
	注意：胶带必须平整，以确保正确组装，否则成像室会发生泄漏。小心撕去背衬，避免产生凸起。建议将贴有胶带的成像室在洁净表面上轻轻滑动，以使胶带与成像室接触面更平整。</li>
	<li>撕去胶带第二层背衬，暴露每条成像室凹槽处胶带的粘性面。将成像室胶带面朝上放置于洁净表面上。</li>
	<li>按1:1比例（或根据制造商说明）在小型称量舟中混合环氧树脂与固化剂溶液。</li>
	<li>使用P1000吸头在每条成像室凹槽末端的胶带条之间滴加一滴混合好的环氧树脂（红色箭头；图1A）。将成像室胶带/环氧树脂面朝上放置于洁净表面上。</li>
	<li>从70 °C培养箱中取出一张包被的盖玻片。用ddH2O反复冲洗盖玻片的包被面与非包被面六次，用过滤氮气吹干，然后将包被面朝向胶带方向固定于成像室上。</li>
	<li>使用P200或P1000移液器吸头对胶带-玻璃界面施加压力，以确保胶带与盖玻片之间形成良好密封。 
	注意：若密封良好，双面胶带将变为半透明。胶带与成像室接触不足的区域会导致泄漏。</li>
	<li>将组装好的成像室在室温下孵育至少5–10分钟，使环氧树脂充分固化，确保成像室小室密封完好后再使用。灌流成像室在组装后12–18小时内失效。 
	注意：根据胶带的放置位置及所用双面胶带的厚度，组装后的成像室最终体积为20–50 µL。</li>
</ol>
4. 灌注室的预处理
<ol>
	<li>使用灌流泵（流速设定为 500 µL/min）按以下顺序在灌流腔室中依次更换预处理溶液：
	<ol>
		<li>注入 50 µL 的 1% BSA 以润洗成像腔室。从鲁尔锁紧接头储液池中移除多余的缓冲液。</li>
		<li>注入 50 µL 的 0.005 mg/mL 链霉亲和素。室温孵育 1–2 分钟。从储液池中移除多余的缓冲液。</li>
		<li>注入 50 µL 的 1% BSA 以封闭非特异性结合位点。孵育 10–30 秒。从储液池中移除多余的缓冲液。</li>
		<li>注入 50 µL 温热（37 °C）的 1× TIRF 缓冲液（1× BRB80、50 mM KCl、10 mM DTT、40 mM 葡萄糖、0.25% (v/v) 甲基纤维素（4,000 cp））。 
		注意：不要从储液池中移除多余的缓冲液。此举可防止腔室干燥，从而避免系统中产生气泡。</li>
		<li>可选：注入 50 µL 用 1× TIRF 缓冲液稀释的稳定化29且 50% 生物素化的微管种子溶液。 
		注意：合适的稀释度需通过实验经验确定，并可能存在批次间的差异。建议以文献27,29中的方案作为起始参考。本实验体系下，每视野含 10–30 个微管种子的稀释度效果良好。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 显微镜准备
注意：使用配备120-150 mW固态激光器、温度校正的63倍油浸TIRF物镜和EMCCD相机的倒置全内反射荧光（TIRF）显微镜，对含有动态肌动蛋白丝和微管的生化反应进行可视化/实验观察。本示例中，蛋白质在以下波长下进行观察：488 nm（微管）和647 nm（肌动蛋白）。
<ol>
	<li>在成像第一个生化反应前至少 30 分钟，将载物台/样品加热装置设定为维持 35–37 °C。</li>
	<li>设定图像采集参数如下：
	<ol>
		<li>将采集间隔设为每 5 秒一次，持续 15–20 分钟。</li>
		<li>将 488 和 647 激光的曝光时间设为 50–100 毫秒，激光功率设为 5%–10%。为显微镜设置合适的全内反射角（TIRF 角）。 
		注意：无论显微镜配置如何，设置激光功率、曝光时间和 TIRF 角最简单的方法是基于单独一种聚合物的图像进行调整（见下文 5.2.2.1 和 5.2.2.2）。强烈建议使用者采用仍能实现检测的最低激光功率和曝光设置。
		<ol>
			<li>调节聚合反应（图 1C），以启动肌动蛋白丝的组装，并在 647 nm 下采集图像，进行相应调整。</li>
			<li>在第二个预处理的灌流孔中调节聚合反应，以启动微管组装（图 1C），并在 488 nm 下观察，进行相应调整。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 蛋白质反应混合液的制备
<ol>
	<li>制备荧光标记微管蛋白的储备液。
	<ol>
		<li>测定自制未标记微管蛋白的浓度 通过 分光光度法在吸收波长处测定280，如下所示：
		<ol>
			<li>使用不含GTP的1xBRB80缓冲液作为空白对照进行分光光度测定。</li>
			<li>使用已确定的消光系数 115,000 M⁻¹cm⁻¹ 计算微管蛋白的浓度-1 cm-1 以及以下公式： 
			<img alt="微管蛋白浓度计算公式；A280 除以消光系数；科学方程式" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"></li>
		</ol>
		</li>
		<li>将市售的冻干赖氨酸标记488-微管蛋白重悬至 10 µM (1 mg/mL；100% 标记) 与 20 µL 不含GTP的1x BRB80缓冲液</li>
		<li>解冻一个 7.2 µL 分装样品 100 µM 未标记的回收微管蛋白29 置于冰上。 
		注意：回收的微管蛋白对微管成功组装至关重要 体外 因为它可去除在冷冻蛋白储备液中形成的无法进行聚合的二聚体29,30.</li>
		<li>结合 3 µL 的 10 µM 488-微管蛋白与 7.2 µL 分装样品 100 µM 未标记的微管蛋白，使用前不超过15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备荧光标记肌动蛋白的储备液。
	<ol>
		<li>对于自制蛋白质，测定肌动蛋白的浓度和标记百分比 通过 分光光度法 吸光度290 和 Abs650，如下所示：
		<ol>
			<li>用G缓冲液调零分光光度计。</li>
			<li>使用测定的消光系数 25,974 M 计算未标记肌动蛋白的浓度-1 厘米-1 以及以下公式： 
			<img alt="肌动蛋白浓度计算公式，Abs290/消光系数，分子分析计算辅助" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"></li>
			<li>使用未标记肌动蛋白的消光系数、0.03 的荧光校正因子以及以下公式，计算赖氨酸标记 Alexa-647-肌动蛋白的浓度： 
			[Alexa-647 标记的肌动蛋白] µM =（吸光度）290 - <img alt="用于吸收校正的荧光测定方程；公式使用消光系数 Abs650。" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq03.jpg" style="opacity: 0.9; margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 3"></li>
			<li>使用已确定的 Alexa-647 摩尔消光系数（ε = 239,000 M⁻¹cm⁻¹）计算 Alexa-647-肌动蛋白的标记率百分比-1 cm-1，如下所示： 
			% Alexa-647-actin 的标记率 = (Abs290 - (<img alt="蛋白质浓度的吸光度计算公式；标记肌动蛋白的方程式；生物化学分析。" src="/files/ftp_upload/64074/64074eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 4"></li>
		</ol>
		</li>
		<li>解冻一支 2 µL 分装样 3 µM 100% 标记的生物素-肌动蛋白（标记在赖氨酸残基上）。通过加入进行10倍稀释 18 µL G缓冲液</li>
		<li>结合 3 µL 稀释的生物素化肌动蛋白，以及适量的未标记和标记肌动蛋白（上文所述），使得最终混合物为 12.5 µM 总肌动蛋白中带有10%–30%的荧光标记。 
		注意：荧光标记的肌动蛋白单体终浓度超过30%时，可能影响成像分辨率，导致难以从背景中分辨出细丝结构。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制反应混合液（图1C).
	<ol>
		<li>通过混合制备细胞骨架反应液（A管） 2 µL 的 12.5 µM 在成像前不超过15分钟，将肌动蛋白混合贮存液（6.2.3）与微管蛋白贮存混合液（6.1.4）混合。使用前保存在冰上。</li>
		<li>通过混合所有其他实验组分和蛋白质来制备蛋白质反应混合液（B管），包括：2× TIRF缓冲液、抗漂白剂、核苷酸、缓冲液以及辅助蛋白。示例如下所示 图1C. 
		注意：最终稀释得到的 1x TIRF 缓冲液含有 ATP、GTP，其离子强度处于估计的生理范围内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分别孵育 A 管和 B 管 37 °C 30-60 秒。为启动反应，混合并将管 B 中的内容物加入管 A（如下）。</li>
</ol>
7. 观察肌动蛋白和微管动态
<ol>
	<li>润洗灌流小室（图1B；见上文步骤4）。</li>
	<li>通过将试管B（反应混合液）中的内容物加入试管A（细胞骨架混合液），同时启动肌动蛋白和微管蛋白的组装（图1C）。</li>
	<li>灌注50 µL反应液，其中含有1x TIRF缓冲液，并添加15 µM游离微管蛋白、1 mM GTP、0.5 µM肌动蛋白单体以及适量的缓冲液对照。</li>
	<li>使用显微镜软件以每5秒一帧的频率连续采集15–20分钟的时间序列图像。 
	注意：肌动蛋白和微管动态的启动通常在2–5分钟内发生（图2）。若延迟时间更长，则提示温度控制存在问题，或反应混合液中蛋白浓度异常。</li>
	<li>润洗一个新的灌流小室（步骤4），并用目标调控蛋白（如Tau蛋白）及缓冲液对照替换原有缓冲液体积（图1C）。按照上述步骤7所述方法进行采集，以评估调控蛋白对肌动蛋白-微管协同功能的影响。</li>
</ol>
8. 使用 FIJI 软件处理和分析图像31
<ol>
	<li>打开保存的TIRF视频，以复合图像形式查看。</li>
	<li>分析微管动力学（图3A），步骤如下：
	<ol>
		<li>从图像堆栈菜单中生成基于时间的最大Z投影。</li>
		<li>通过 分析&gt; 工具&gt; 同步窗口 菜单，将Z投影窗口与原始TIRF视频同步。</li>
		<li>在时间投影图像上，使用直线工具沿感兴趣的微管绘制一条线。
		<ol>
			<li>从分析菜单中打开感兴趣区域（ROI）管理器（分析&gt; 工具&gt; ROI管理器）。</li>
			<li>按下“t”键保存单个微管的位置；对所有感兴趣的微管重复此操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用“/”键绘制所选线条的线扫图（kymograph），或运行多线扫宏（multi-kymo macro），该宏将为ROI管理器中的每条微管生成视频和线扫图31。
		<ol>
			<li>从 分析&gt; 工具&gt; 标尺 菜单中，为线扫图添加长度（µm）和时间（min）比例尺。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据线扫图的斜率测量微管生长速度（图3A，1-2；黑色线条的斜率）。</li>
		<li>从生成的线扫图或使用可用的分析宏5,8,18,25统计动态微管事件（去稳定化或重新生长）。图3A，1-2中的红色虚线代表去稳定化/快速解聚事件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析肌动蛋白动力学（图3B），步骤如下：
	<ol>
		<li>测量肌动蛋白成核，步骤如下：
		<ol>
			<li>在反应启动后100秒，统计视野中肌动蛋白纤维的数量，并按面积进行归一化表达（每平方微米纤维数，filaments per µm2）。</li>
			<li>在ROI管理器中记录并保存数据，方法同上文步骤8.2.3.1。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>测量肌动蛋白纤维的延伸速率（图3B），步骤如下：
		<ol>
			<li>使用折线工具沿感兴趣的肌动蛋白纤维绘制一条线。</li>
			<li>将该线添加至ROI管理器，方法同上文步骤8.2.3.1。</li>
			<li>沿该线追踪至少四个视频帧（将每次测量结果添加至ROI管理器）。 
			注：建议测量连续七到八个帧，但在某些条件下，肌动蛋白聚合速度较慢，低于物镜/显微镜系统的可分辨极限。此时可在非连续帧中以固定间隔进行测量（例如，每隔五帧测量一次）。</li>
			<li>将测得的长度值对经过时间作图，所得直线的斜率即为肌动蛋白延伸速率（单位：微米/秒，µm/s）。</li>
			<li>使用校正因子370（表示每微米肌动蛋白纤维所含的单体数量）32，将最终计算的速率转换为亚基每秒每微摩尔（subunits s-1 µM-1）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对肌动蛋白-微管平行关联区域进行相关性分析（图3C），步骤如下：
	<ol>
		<li>在特定时间点（例如，反应启动后300秒），使用直线工具沿感兴趣的微管绘制一条线。
		<ol>
			<li>将该线添加至ROI管理器，方法同上文步骤8.2.3.1。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在每个通道中绘制沿该线的荧光强度分布。
		<ol>
			<li>使用图像滑块选择每个通道，并通过“command k”键绘制沿线的强度分布。</li>
			<li>点击输出窗口中的“list”按钮，保存或导出数值。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将肌动蛋白-微管偶联事件表示为比例（肌动蛋白与微管重叠部分）或在固定时间点统计特定视野内的事件数量（图3C）。</li>
		<li>替代方法：使用软件计算两个通道之间的重叠百分比5,12。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

不存在需要披露的利益冲突。

利用全内反射荧光（TIRF）显微镜观察纯化的蛋白质，已成为解析细胞骨架调控独特机制的一种富有成效且极具说服力的方法5,23,24,25,26,27,35。与传统的生化实验相比，TIRF 反应所需体积极小（50–100 µL），且可从单个实验中获得关于细胞骨架动态的定量数据。目前大多数关于细胞骨架动态的研究集中于单一聚合物系统（即肌动蛋白丝或微管），因此，在细胞中常见的肌动蛋白丝与微管之间的相互作用或涌现行为，其详细测量在体外实验中仍难以实现且极具挑战性。为解决这一问题，本实验方案描述了一种单丝 TIRF 显微镜系统，可在同一生化反应中直接可视化动态的肌动蛋白和微管聚合物。因此，该方法超越了仅重现肌动蛋白丝或微管单独动态行为的传统实验。本研究还以 Tau 蛋白为例，展示了细胞骨架偶联因子存在时多种动态特性的变化。该实验方案也可用于其他已知或疑似协调肌动蛋白或微管动态的蛋白质，包括但不限于 MACF、GAS、formins 等。最后，所提供的示例分析可作为指南，用于量化本方案所获得的数据。
&#34;眼见为实&#34;是进行基于显微镜检测的一个有力理由。然而，在执行和解释全内反射荧光（TIRF）显微镜实验时需格外谨慎。细胞骨架共组装检测的主要挑战之一在于，许多常用的成像条件并不适用于每种聚合物。微管和肌动蛋白在聚合时通常对缓冲液、温度、盐浓度、核苷酸及浓度等条件有不同的要求。本方案中所使用的肌动蛋白、微管蛋白、目标调控蛋白以及缓冲液均对冻融循环敏感。因此，为成功实施本方案，必须谨慎处理蛋白质和缓冲液。为减轻上述诸多问题，强烈建议使用新鲜回收的微管蛋白（冷冻时间少于&#60;6周），并通过超速离心对冻存后重悬的肌动蛋白进行预清除。这些注意事项同样适用于本实验中需评估的多种调控蛋白，这些蛋白可能对冻融循环或缓冲液中盐浓度敏感5,11,36。
遗憾的是，目前并不存在一种适用于所有情况且无需进行实验权衡的通用缓冲液。为了在较低蛋白浓度下获得更适配的体积，可在2倍TIRF缓冲液中添加ATP和GTP（图1C）。然而，由于这些核苷酸对冻融循环极为敏感，因此不建议采用此方法。本实验中使用的氧清除化合物（即过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶）对于长时间（数分钟至数小时）观察蛋白质是必要的，但已知在高浓度下会抑制微管聚合5。与此类缓冲液选择相关的是，本实验方案的一个局限性在于，某些典型的微管相关调控蛋白可能需要更高或更低的盐浓度，才能重现其在细胞内或仅使用微管（不含肌动蛋白）的实验体系中的功能。改变盐的种类或浓度以满足这些需求，很可能会影响肌动蛋白丝的聚合速率和/或微管动态参数。为确认本方案的成功实施，或明确记录特定缓冲液或调控蛋白的影响，必须测量多个描述性参数（至少包括成核、延伸速率和稳定性）（图3）。例如，过度的肌动蛋白丝聚合可能在数秒内遮蔽肌动蛋白-微管偶联事件。因此，通过降低肌动蛋白总体浓度或添加其他抑制肌动蛋白成核的蛋白（如profilin）来精细调节实验条件，可延长清晰观察肌动蛋白与微管协同活动的时间窗口。针对上述前提条件设置对照实验，并进行技术重复（超出多个视野的重复观察），对于用户获得可靠且可重复的结果至关重要。
基于细胞的研究难以直接观察蛋白质-蛋白质相互作用或调控复合物的功能。相比之下，一些从此类研究中获得的机制 体外 检测结果并不总能反映蛋白质在细胞内的真实行为。这一经典生物化学难题可通过对此技术进行特定改进，在未来应用中加以解决。例如，加入功能性的荧光标记偶联蛋白，可将该方法从单一纤维研究扩展至单分子水平分子 研究。检测方法还可进一步修改，以使用可能添加的细胞提取物 &#34;缺失&#34; 重现类细胞现象所需的关键因素尚不明确。例如，利用酵母或非洲爪蟾提取物进行的基于全内反射荧光（TIRF）的实验已重建出收缩性肌动球蛋白环37有丝分裂纺锤体26,38肌动蛋白或微管组装的组分39,40以及中心体和动粒处的动态变化36,41,42,43此外，这类系统可能为含有脂质或信号因子的人工细胞系统铺平道路44,45,46.

传统上，肌动蛋白和微管被视为相互独立的实体，各自拥有一套调控蛋白、动态行为以及特定的细胞定位。如今大量证据表明，肌动蛋白与微管聚合物之间存在功能性的相互作用机制，这些机制对于多种细胞过程的执行至关重要，包括细胞迁移、有丝分裂纺锤体的定位、细胞内运输以及细胞形态的维持1,2,3,4。上述现象所依赖的多种协调行为，受制于一系列复杂的偶联因子、信号通路和物理特性的平衡。然而，这些机制背后的分子细节在很大程度上仍不清楚，因为大多数研究一次仅关注一种细胞骨架聚合物1,2,5。
肌动蛋白和微管不直接相互作用6,7,8。细胞中观察到的肌动蛋白与微管的协调动态由其他因子介导。许多被认为可调节肌动蛋白-微管串扰的蛋白质已被鉴定，并且这些蛋白质各自对单一细胞骨架聚合物的作用已得到充分表征1,2。越来越多的证据表明，仅关注单一聚合物的研究方法掩盖了一些能够介导肌动蛋白-微管偶联事件的蛋白质/复合物的双重功能7,8,9,10,11,12,13。同时包含两种聚合物的实验较为罕见，且通常仅以一种动态聚合物与另一种静态稳定形式来定义其作用机制6,8,9,10,11,14,15,16,17,18。因此，亟需建立能够在同时包含两种动态聚合物的实验体系中，研究肌动蛋白-微管协调蛋白所展现出的新兴特性的方法。
直接蛋白质标记方法、基因编码的亲和标签与全内反射荧光（TIRF）显微镜技术的结合，已在仿生重建系统中得到成功应用19,20,21,22,23许多自下而上的研究方案并未包含调控细胞内蛋白质的所有因子。然而 &#34;盖玻片上的生物化学反应&#34; 技术已在高空间和时间尺度上阐明了肌动蛋白和微管动态的多种机制，包括聚合或解聚所需的组分以及运动蛋白的移动。5,12,23,24,25,26,27一种用于研究肌动蛋白-微管偶联的最小组分单丝方法 体外 本文描述了一种可用于市售或高纯度纯化蛋白、荧光标记蛋白、灌流腔室的实验方案，并可扩展至包含细胞提取物或合成系统的更复杂体系。此处以市售Tau蛋白为例，演示在存在微丝-微管偶联蛋白的情况下细胞骨架动态的变化，但该蛋白可替换为其他潜在的微丝-微管协调因子。该系统相较于其他方法的主要优势在于能够在同一反应中同时监测多种细胞骨架多聚体的动态变化。本方案还为使用者提供了量化细胞骨架多聚体变化的示例和简易工具。因此，使用者可通过本方案获得可靠、定量、单纤维分辨率的数据，用于阐释多种调控蛋白协调微丝-微管动态的分子机制。

<table><tbody><tr><td>1% BSA（w/v）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td>出于此目的（封闭TIRF腔室），将BSA溶于 &lt;sub&gt;dd&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 并通过 0.22 &amp;micro;m 滤膜</td></tr><tr><td>1&amp;times; BRB80</td><td>自制</td><td></td><td>80 mM PIPES，1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1 mM EGTA，用KOH调至pH 6.8</td></tr><tr><td>10 mg/mL（1000 U）葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市</td><td>G2133-50KU</td><td>与过氧化氢酶联合分装，于 -80 保存 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C，直至使用</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;M 微管蛋白</td><td>Cytoskeleton公司，丹佛，科罗拉多州</td><td>T240</td><td>自制微管蛋白在使用前应进行循环处理，以去除无法聚合的微管蛋白（Hyman et al. (1992)）&lt;sup&gt;29&lt;/sup&gt;；Li 和 Moore（2020）&lt;sup&gt;30&lt;/sup&gt;）。市售微管蛋白通常浓度过低而无法回收利用，但若按照生产商说明重新悬浮，则可良好地发挥作用。&amp;rsquo;s 说明并经超速离心预清除（278,000） &amp;times; g) 使用前，放置60分钟。</td></tr><tr><td>100 mM ATP</td><td>Gold Biotechnology Inc，密苏里州奥利维特</td><td>A-081</td><td>重悬于 &lt;sub&gt;dd&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0（pH 7.5），过滤除菌。</td></tr><tr><td>100 mM GTP</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC226250010</td><td>重悬于 1&amp;times; BRB80（pH 6.8）并过滤除菌。</td></tr><tr><td>120-150 mW 固体激光器</td><td>徕卡显微系统</td><td>11889151; 11889148</td><td></td></tr><tr><td>2 mg/mL 过氧化氢酶</td><td>Sigma Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市</td><td>C40-100</td><td>与葡萄糖氧化酶联合使用，分装后于 -80 保存 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;直至使用前均置于 C 保存</td></tr><tr><td>2&amp;times; TIRF缓冲液</td><td>自制</td><td></td><td>2&amp;times; BRB80，100 mM KCl，20 mM DTT，80 mM 葡萄糖，0.5% (v/v) 甲基纤维素（4,000 cp）；注意：1 &amp;micro;0.1 M GTP 溶液 L 和 1 &amp;micro;分别向TIRF反应中加入0.1 M ATP溶液，以避免反复冻融循环。</td></tr><tr><td>24 &amp;times; 60 毫米，#1.5 盖玻片</td><td>Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>22-266882</td><td>盖玻片在使用前必须彻底清洗（Smith et al. (2014)&lt;sup&gt;22&lt;/sup&gt;)</td></tr><tr><td>37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 热块</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 水浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mg/mL 链霉亲和素（600倍浓缩液）</td><td>Avantor，宾夕法尼亚州费城</td><td>RLS000-01</td><td>重悬于 Tris-HCl（pH 8.8）中；将等分试样稀释至 1&amp;times; 在使用当天，置于HEK缓冲液中</td></tr><tr><td>5 分钟环氧树脂与固化剂</td><td>Loctite，美国康涅狄格州罗基希尔</td><td>1365736</td><td>混合树脂与固化剂可能需要长达30分钟才能固化。</td></tr><tr><td>50% 生物素化-GpCpp 微管种子</td><td>Cytoskeleton 公司；自制</td><td>T333P</td><td>（可选）GppCpp 或紫杉醇（Taxol）稳定的微管种子可更高效地介导微管聚合。紫杉醇与 GppCpp 以不同的方式稳定微管，这可能影响微管晶格结构以及某些调控蛋白与微管稳定区域结合的能力。Hyman 等（1992）概述了一种制备多种类型微管种子的方法。</td></tr><tr><td>70 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>肌动蛋白混合物储备液</td><td>自制；本实验方案</td><td></td><td>12.5 &amp;micro;M肌动蛋白混合物，包含标记（荧光和生物素化）与未标记的肌动蛋白，适用于最多六个反应。2 &amp;micro;L 储液用于最终的 TIRF 反应。每个反应中所用肌动蛋白的最终浓度为 0.5 &amp;micro;M（10% Alexa-647；0.09% 生物素标记）</td></tr><tr><td>适当的缓冲液对照</td><td>自制</td><td></td><td>所有待评估蛋白质缓冲液的混合</td></tr><tr><td>生物素-PEG-硅烷（分子量 3,400）</td><td>莱桑生物公司</td><td>生物素-PEG-SIL-3400</td><td>分装为2-5 mg等份，充氮气保护，用Parafilm封口，于-20℃保存 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;置于干燥剂中，4°C 保存备用</td></tr><tr><td>生物素标记的肌动蛋白</td><td>Cytoskeleton 公司；自制</td><td>AB07</td><td>生物素-肌动蛋白通过标记赖氨酸残基制备，因此假定其标记率至少为100%，但不同批次或制备之间可能存在差异。&amp;nbsp; 最佳的生物素标记肌动蛋白浓度需根据特定用途或实验设计通过实验经验确定。较高浓度可实现更高效的追踪，但可能抑制聚合或与调控蛋白的相互作用。本实验中，最终TIRF反应体系含有少量生物素标记肌动蛋白（0.09% 或 900 pM）。</td></tr><tr><td>洗洁精</td><td>Dawn，宝洁公司，俄亥俄州辛辛那提</td><td></td><td>出于未知原因，蓝色版本清洗盖玻片的效率高于其他可用颜色的版本。</td></tr><tr><td>干冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI 软件</td><td>www.https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td><td>施耐德等人（2012）&lt;sup&gt;31&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>荧光标记的肌动蛋白</td><td>Cytoskeleton公司；自制</td><td>AR05</td><td>自制的荧光标记肌动蛋白保存于添加了50%甘油的G缓冲液中，置于-20℃储存 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C（Spudich 等（1971））&lt;sup&gt;47&lt;/sup&gt;；刘等人（2022）&lt;sup&gt;48&lt;/sup&gt;）。荧光标记的肌动蛋白在G缓冲液中透析，并通过超速离心在278,000 × g下离心60分钟进行预清除 &amp;times; 使用前称量 g。</td></tr><tr><td>荧光标记的微管蛋白</td><td>Cytoskeleton公司</td><td>TL488M，TLA590M，TL670M</td><td>重悬于20 &amp;micro;L 1&amp;times; BRB80（10 &amp;micro;M 终浓度）并通过超速离心预清除（278,000 &amp;times; g) 使用前，放置 60 分钟。</td></tr><tr><td>G缓冲液</td><td>自制</td><td></td><td>3 mM Tris-HCl (pH 8.0)，0.2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，0.5 mM DTT，0.2 mM ATP</td></tr><tr><td>HEK缓冲液</td><td>自制的</td><td></td><td>20 mM HEPES（pH 7.5），1 mM EDTA（pH 8.0），50 mM KCl</td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰桶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>成像室</td><td>IBIDI，威斯康星州菲奇堡</td><td>80666</td><td>订购无底培养室以使用不同的盖玻片涂层</td></tr><tr><td>iXon Life 897 EMCCD 相机</td><td>Andor，北爱尔兰贝尔法斯特</td><td>8114137</td><td></td></tr><tr><td>LASX Premium 显微镜软件</td><td>Leica Microsystems</td><td>11640611</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素（4,000 cp）</td><td>Sigma Aldrich 公司</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>配备TIRF模块的显微镜基座</td><td>德国韦茨拉尔，徕卡显微系统公司</td><td>11889146</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-硅烷（分子量 2,000）</td><td>Laysan Bio 公司，阿拉巴马州阿拉伯市</td><td>mPEG-SIL-2000</td><td>分装为10–15 mg等份，充入氮气，用Parafilm封口膜密封，于-20 °C保存 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;置于干燥剂中，4°C 保存备用</td></tr><tr><td>物镜加热器与加热载物台插件</td><td>OKO labs，波佐利，意大利</td><td>8113569</td><td>将温度控制设置为35-37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C. 使用制造商建议进行准确校准。</td></tr><tr><td>灌注泵</td><td>哈佛仪器公司，霍利斯顿，马萨诸塞州</td><td>704504</td><td>可使用注射器和管路进行替代。</td></tr><tr><td>培养皿，100 × 15 mm</td><td>Genesee Scientific，加利福尼亚州圣地亚哥</td><td>32-107</td><td></td></tr><tr><td>塑料幻灯片邮寄容器</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm 厚</td><td>Grace Biolabs，俄勒冈州本德</td><td>620001</td><td>强烈建议使用精确制造尺寸的双面胶带。</td></tr><tr><td>小型泡沫塑料容器</td><td>Abcam，英国剑桥</td><td></td><td>重复使用发货材料</td></tr><tr><td>小型称量舟</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tau</td><td>Cytoskeleton 公司</td><td>TA01</td><td>商业可得的Tau蛋白制备物中含有三种Tau亚型。本方案中的浓度由分子量最高的条带（14.3）确定 &amp;micro;M，按照制造商说明重新悬浮后&amp;rsquo;50 的建议 &amp;micro;L of &lt;sub&gt;dd&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0).</td></tr><tr><td>温度校正 63&amp;times; Plan Apo 1.47 数值孔径油浸 TIRF 物镜</td><td>徕卡显微系统</td><td>11506319</td><td></td></tr><tr><td>微管蛋白储备液</td><td>自制；本方案</td><td></td><td>由7.2组成的微管蛋白储备液 &amp;micro;L 回收 100 &amp;micro;M 未标记的微管蛋白和 3 &amp;micro;10 升 &amp;micro;M 重悬市售荧光标记的微管蛋白。每个反应使用一份微管蛋白储存液，解冻后置于冰上保存。每个反应中游离微管蛋白的终浓度为 15 &amp;micro;M（4% 标记）。超过 15 &amp;micro;M微管蛋白将导致微管过度稳定（无动态性），而浓度低于7.5 &amp;micro;游离微管蛋白不易有效聚合，需精确测定蛋白浓度并谨慎操作。</td></tr><tr><td>未标记的肌动蛋白（深色）</td><td>Cytoskeleton 公司；自制</td><td>AKL99</td><td>肌动蛋白成核点几乎总是存在于市售（冻干）或冷冻保存的肌动蛋白中，这会导致定量测量结果的变异性（Spudich 等，1971）&lt;sup&gt;47&lt;/sup&gt;；刘等人（2022）&lt;sup&gt;48&lt;/sup&gt;）。兔肌动蛋白在G缓冲液中保存于-80 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C，并通过在278,000 × g下超速离心60分钟进行预清除 &amp;times; 使用前称量 g。&amp;nbsp;一天中需配制多份肌动蛋白储备液（每次配制不超过六个反应所需的量）&amp;nbsp;强烈建议）。</td></tr></tbody></table>

可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（tirf）显微镜技术

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

传统上，肌动蛋白和微管细胞骨架被作为独立的实体进行研究，局限于特定的细胞区域或过程，并由各自独特的结合蛋白群分别调控。如今许多研究表明，这两种细胞骨架聚合物的动力学行为相互交织，且这种交互作用是大多数细胞行为所必需的。目前已鉴定出多种参与肌动蛋白-微管相互作用的蛋白质（如 Tau、MACF、GAS、formins 等），并对它们在单独调控肌动蛋白或微管方面的功能有了较为深入的了解。然而，较少研究采用两种聚合物的动态形式来检测肌动蛋白与微管之间的协同作用。这可能掩盖了肌动蛋白与微管之间潜在的连接机制。本文基于全内反射荧光（TIRF）显微镜技术 体外 重构技术可实现从同一生化反应中同时观察肌动蛋白和微管的动力学行为。该技术能够分别或在另一种聚合物共存条件下，保持肌动蛋白丝或微管的聚合动力学特性。本方法使用 commercially available Tau 蛋白，以展示在经典细胞骨架交联蛋白存在下，肌动蛋白与微管相互作用行为的变化。该技术可在单根纤维或高阶复合物水平上，为调控蛋白如何协调肌动蛋白与微管动力学提供可靠的功能性与机制性见解。

在上述条件下（图1），在开始图像采集后的2分钟内应可观察到肌动蛋白和微管聚合物的形态（且具有动态性）（图2）。与所有基于生物化学的实验方案一样，针对不同的调控蛋白或不同批次的蛋白，可能需要进行优化。因此，应首先使用仅含单一聚合物的反应体系来设定全内反射荧光（TIRF）显微镜的入射角度和图像曝光参数。这一步骤可确认储存的蛋白仍具有功能活性，并确保有足够量的标记蛋白可供检测。尽管并非总是必要（本文中未进行），但可通过图像后期处理（如背景扣除、图像平均化或傅里叶变换）来增强图像对比度（尤其是微管的图像）5,25,33。本实验方法可直接可视化单根肌动蛋白丝和微管，从而支持对任一细胞骨架组分单独或共同的多种动态参数进行定量分析，包括聚合参数（如成核速率或延伸速率）、解聚参数（如缩短速率或灾变事件）以及聚合物之间的共定位/重叠情况（图3）。此外，这些测量结果还可作为解析调控性配体（如Tau蛋白）结合行为或功能影响的起点（图3）。一段TIRF显微电影可提供大量关于单根肌动蛋白丝或微管的测量数据。然而，由于盖玻片包被、移液操作及其他因素可能存在变异，可靠的测量结果还应包含多个技术重复的反应或电影记录。
通过示例走时图可以确定微管动态的多个方面，包括微管延伸速率以及 catastrophe 和 rescue 事件的频率（图3A）。在此系统中，使用走时图测量肌动蛋白动态则较为复杂，因为肌动蛋白丝比微管结构更不规则。因此，肌动蛋白丝动态参数需手动测量，这一过程耗时且劳动强度大。成核计数是指在所有实验条件下统一时间点存在的肌动蛋白丝数量。这些计数在不同TIRF成像视野间差异较大，但可通过大量重复实验或与其他聚合实验的观察结果相互补充来提高可靠性。若实验条件中缺乏稳定的微管种子，也可对微管进行成核计数。肌动蛋白丝的延伸速率通过至少四个电影帧中丝状结构长度随时间的变化来测定。速率值以每微摩尔肌动蛋白表示，并采用370个亚基的校正因子，以反映每微米肌动蛋白丝中所含的肌动蛋白单体数量（图3B）32。目前对于定义肌动蛋白与微管之间协调行为的测量方法尚不完善。然而，已有研究应用相关性分析方法来评估两种多聚体的共定位情况，包括线扫描分析（图3C）或重叠分析软件5,11,34。
数据可用性： 
本研究相关的所有数据集均已存入 Zenodo，可通过合理申请获取，访问地址为：10.5281/zenodo.6368327。
<img alt="TIRF 显微镜装置示意图：图 A 显示灌流室组装；图 B 概述照明过程；图 C 详述成像用溶液组分。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1．实验示意图：从流动室组装到图像采集。（A）成像室组装。自上而下：IBIDI 成像室沿灌流槽用胶带固定（箭头所示）；第二层（白色）胶带衬底（图中保留以帮助使用者更好定位）被移除，并在灌流室边缘（箭头处）涂抹环氧树脂。注意：为便于使用者明确环氧树脂涂抹位置，本图中保留了白色衬底。经清洗和表面包被的盖玻片被粘附至成像室，包被面朝向灌流槽内部。（B）流程图，展示用于生物素-链霉亲和素连接的成像室预处理步骤。（C）用于获取动态微管和肌动蛋白丝 TIRF 视频的反应示例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微管-肌动蛋白聚合显微镜图像，时间推移示意图，显示Tau蛋白的作用，25μm比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2。在无或有Tau蛋白存在下生长的肌动蛋白丝和微管的图像序列。 来自TIRF实验的时间推移图像拼接图，其中含有0.5 µM肌动蛋白（10% Alexa-647标记肌动蛋白和0.09%生物素标记肌动蛋白）和15 µM游离微管蛋白（4% HiLyte-488标记），在无（A）或有（B）250 nM Tau蛋白的情况下进行。图中显示从反应启动（混合A管与B管）后经过的时间。比例尺：25 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微管-肌动蛋白动态；荧光显微镜示意图；线扫图（kymographs）；肌动蛋白延伸分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64074/64074fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3．微管与肌动蛋白细丝动态的示例测量。（A）微管蛋白通道的平均时间投影可有效显示用于生成线扫图（kymograph）的扫描线所对应的总微管长度。黑色虚线对应于右侧所示的两个动态微管线扫图示例。每个线扫图中显示了微管的生长阶段（实心黑线）和解聚阶段（虚线粉线；两个以粉红色箭头标示）。时间比例尺：3 分钟；长度比例尺：10 µm。反应体系包含 0.5 µM 肌动蛋白（10% 647 标记）和 15 µM 游离微管蛋白（4% 488-HiLyte 标记）。仅显示微管蛋白通道。（B）两个示例性延时图像拼接图，展示单个肌动蛋白细丝的活跃聚合过程。延伸速率通过肌动蛋白细丝长度随时间变化曲线的斜率计算，单位为每微摩尔肌动蛋白的延伸速率。因此，在将 0.5 µM 肌动蛋白反应的速率与通常在 1 µM 肌动蛋白浓度下测定的速率进行比较时，必须应用两倍的校正因子。右侧展示了五个细丝的示例。比例尺：10 µm。反应体系包含 0.5 µM 肌动蛋白（10% 647 标记）和 15 µM 游离微管蛋白（4% 488-HiLyte 标记）。仅显示肌动蛋白通道。（C）全内反射荧光（TIRF）图像，显示在无（左）或有 250 nM Tau 蛋白（中）条件下动态微管（MT，绿色）和肌动蛋白细丝（紫色）的聚合情况。蓝色虚线和箭头标示了每张图像下方对应条件的线扫描绘图所依据的扫描线位置。可在特定时间点按区域评估微管与肌动蛋白区域的重叠情况（以黑色显示，右图）。比例尺：25 µm。反应体系包含 0.5 µM 肌动蛋白（10% 647 标记）和 15 µM 游离微管蛋白（4% 488-HiLyte 标记），部分反应添加 250 nM Tau 蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64074/64074fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案旨在通过可视化动态微丝和微管提供操作指南 体外 全内反射荧光（TIRF）显微镜检测

可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

传统上，肌动蛋白和微管细胞骨架被作为独立的实体进行研究，局限于特定的细胞区域或细胞过程，以及……

尽管存在许多协同作用的例子，但大多数研究仍单独考察肌动蛋白或微管蛋白。该方法能够在同一反应中实现对这两种动态多聚体的可视化观察。此技术使研究者能够评估多种调控蛋白所表现出的涌现特性，而这些特性只有在肌动蛋白和微管蛋白处于动态状态时才能被观察到。该技术可进一步扩展，以包含脂质或提取物，从而更接近构建合成细胞的目标。首先将 PEG-硅烷和生物素-PEG-硅烷粉末的等分试样解冻，并将 PEG 粉末溶于 80% 乙醇中，配制涂层储备液，其中 mPEG-Silane 浓度为 10 毫克/毫升，Biotin-PEG-Silane 浓度为 2 至 4 毫克/毫升。用镊子从乙醇储存液中取出洁净的盖玻片。用氮气吹干，并在洁净的培养皿中储存。用100微升包被液对盖玻片进行包被，于70摄氏度孵育至少18小时，或孵育至使用前。将12条双面背胶胶带裁剪至24毫米长度。取下胶带背衬的一侧，将胶带固定在洁净成像腔室的六条凹槽旁边。取下第二层胶带背衬，暴露每条腔室凹槽处胶带的粘性面，并将腔室粘性面向上放置于洁净的表面上。按1:1比例在小型称量皿中混合环氧树脂与固化剂溶液，使用P1000枪头在每条成像腔室凹槽末端的胶带条之间滴加一滴混合好的环氧树脂。然后，将腔室（带胶带或环氧树脂的一面朝上）放置在干净的表面上。从70摄氏度的培养箱中取出一块包被的盖玻片，用双蒸水冲洗盖玻片的包被面和未包被面各六次。用过滤的氮气吹干，然后将盖玻片有包被的一面朝向胶带，固定到成像腔室上。使用 P200 或 P1000 移液器吸头对用胶带固定的玻璃界面施加压力，以确保胶带与盖玻片之间形成良好的密封。将组装好的灌流腔室在室温下孵育至少 5 至 10 分钟，使环氧树脂充分固化，完全密封腔室孔后方可使用。灌流腔室在组装后 12 至 18 小时内失效。使用灌流泵，通过在灌流腔室中依次交换预处理溶液，先灌注50微升1% BSA以预处理成像腔室。移除 lure lock 接头储液池中的过量缓冲液。随后，灌注50微升0.005毫克/毫升的链霉亲和素，并在室温下孵育1至2分钟。从储液池中移除多余的缓冲液。加入50微升1% BSA以阻断非特异性结合，并孵育10至30秒。从储液池中移除多余的缓冲液。接下来，加入50微升预热的1x TIRF缓冲液，随后加入50微升用1x TIRF缓冲液稀释的稳定化且50%生物素化的微管种子。在成像第一个生化反应前，将载物台或物镜加热装置设定为35至37摄氏度，并维持30分钟。然后，将图像采集间隔设置为每5秒一次，持续15至20分钟。接下来，首先调节聚合反应以启动肌动蛋白丝的组装，然后将488和647激光的曝光时间设置为50至100毫秒，功率设置为5%至10%。在647纳米波长下采集图像，并进行适当调整。随后，在第二个预处理的灌注孔中调节聚合反应，以启动微管的组装。在488纳米波长下观察，并进行适当调整。使用前不超过15分钟，将3微升10微摩尔的488标记微管蛋白与7.2微升100微摩尔的荧光未标记微管蛋白等分试样混合。然后，将3微升稀释的生物素化相关肌动蛋白与适当体积的荧光未标记和荧光标记肌动蛋白混合，使最终混合物中总肌动蛋白浓度为12.5微摩尔，荧光标记比例为10%至30%。在成像前不超过15分钟，将2微升12.5微摩尔的肌动蛋白混合储备液与微管蛋白储备混合液混合，制备细胞骨架反应混合液。置于冰上保存，直至使用。通过组合所有其他实验组分和蛋白质（包括2倍TIRF缓冲液、抗淬灭剂、核苷酸、缓冲液以及辅助蛋白）来制备蛋白反应混合液。将细胞骨架混合液和蛋白质反应混合液分别在37摄氏度孵育30至60秒。通过将蛋白质反应混合液加入细胞骨架混合液中并混匀来启动反应。向灌流室中加入50微升反应混合液，其中含有1x TIRF缓冲液，并补充15微摩尔游离微管蛋白、1毫摩尔GTP、0.5微摩尔肌动蛋白单体以及适量的缓冲液对照。使用显微镜软件记录延时电影，每5秒采集一次，持续15至20分钟。对新的灌注孔进行预处理，并用目标调控蛋白及缓冲液对照替换缓冲液体积。进行图像采集，以评估调控蛋白在新生肌动蛋白微管功能中的作用。这些图像展示了微管和肌动蛋白丝动态的示例测量结果。微管蛋白通道的平均时间投影可有效显示用于生成线扫描图（Kymograph）的总微管长度。黑色虚线对应于动态微管的两个示例线扫描图。每张Kymograph图展示了微管的生长和解聚阶段。此处显示了两个时间推移图像拼接示例，描绘了单个肌动蛋白丝正在进行活跃聚合的情况。肌动蛋白丝的伸长速率通过单位微摩尔肌动蛋白下其长度随时间变化曲线的斜率来计算。因此，在比较通常于1微摩尔肌动蛋白浓度下测定的反应速率时，必须对0.5微摩尔肌动蛋白反应应用两倍的校正因子。此处展示了来自五根纤维的示例。图中显示了在无或有250纳摩尔Tau存在条件下聚合的肌动蛋白纤维中动态微管的全内反射荧光（TIRF）图像。蓝色虚线和箭头标示了每种条件下用于生成线扫描图的划线位置。可在每个区域设定的时间点对肌动蛋白区域中微管的重叠情况进行评分。细胞骨架蛋白，特别是肌动蛋白、微管及其调控因子，对冻融循环非常敏感。为了确保一致性和成功，应使用高纯度且妥善保存的蛋白质。

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为了研究T细胞免疫突触中丝状肌动蛋白的流动速度和方向性，将活细胞超分辨率成像与全内反射荧光技术相结合，并利用时空图像相关光谱法进行定量分析。...

基于结构化照明显微镜数据的时空图像相关光谱法量化T细胞中的皮层肌动蛋白流

将介绍一种先进的显微镜，该显微镜能够对分离的质膜及其周围的细胞内体积进行快速且高分辨率的成像。将转盘共聚焦显微技术与全内反射荧光显微技术集成于同一系统，可实现高达每3.5秒获取一幅图像堆栈的高速活细胞成像实验。...

利用先进的转盘-全内反射荧光显微镜技术可视化细胞中的黏附形成

本方案旨在指导如何在标准荧光显微镜上实施干涉反射显微技术，用于体外表面实验中对微管进行无标记、高对比度、高速成像。...

无标记、高速微管成像的干涉反射显微镜技术实现

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

我们介绍一种实验方案，可同时实现干涉反射显微镜与全内反射荧光显微镜，用于动态微管及荧光标记的微管相关蛋白的同步成像。...

同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

我们介绍了简单的肌动蛋白丝微流控实验方案，结合荧光显微镜技术，可实时准确监测单个肌动蛋白丝，并依次将其暴露于不同的蛋白质溶液中。...

利用微流控技术与荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝及其束状结构的组装动力学

本文介绍了可调控的三维共缠结肌动蛋白丝与微管复合网络的构建与表征方法。该复合材料在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下发生主动重构和弹道运动，并可通过调节肌动蛋白、微管、马达蛋白和被动交联分子的相对浓度进行调控。...

重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

了解如何使用全内反射荧光显微镜在体外同时可视化肌动蛋白和微管的动态耦合过程。该方法可评估调控蛋白对细胞骨架动力学的影响，为合成细胞研究提供重要技术基础。

可视化肌动蛋白与微管耦合动力学体外通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

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可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

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