Name: 同步干涉反射和全内反射荧光显微镜，用于动态微管和相关蛋白质的成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 学习同步干涉反射与全内反射荧光显微镜技术，用于动态微管及荧光标记微管相关蛋白的无标记高帧率成像。该方法操作简便，光学组件需求低，适用于细胞生物学研究。

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我们感谢Thierry Emonet实验室共享洁净室设备。感谢Yin-Wei Kuo制备本研究中使用的纯化eGFP-驱动蛋白。Y.T.感谢亚历山大·冯·洪堡基金会通过费奥多·林嫩研究奖学金提供的支持。&#160;本工作获得美国国立卫生研究院资助R01 GM139337（资助J.H.）的支持。

1. 流动腔室的制备
注意：微流控流动室将通过将聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道粘附到已清洁并功能化的盖玻片上而构建。微通道将在主模具中浇铸成型。
<ol>
	<li>PDMS 通道的制备
	<ol>
		<li>准备经过清洗和/或功能化的盖玻片，其表面化学性质应与所进行的成像实验相匹配。 
		注意：对于驱动蛋白运动性实验，使用经皮兰努哈（piranha）清洁并硅烷化的盖玻片。这些是&#160;如 Gell 等所述方法制备1&#160;或者，更简单的方法是将盖玻片在异丙醇中超声处理，随后在甲醇中超声处理，每次20分钟，重复3次。</li>
		<li>制备主模具时，将单面固定胶带裁成所需流道尺寸的条状。将胶带条粘附于直径10 cm的培养皿底部，各条带并排排列，条带之间至少保留1 cm间距。 
		注意：如果需要精确的通道尺寸，可以使用光刻技术在硅晶圆上制作模具。14.</li>
		<li>制备PDMS聚合物时，按1:10的质量比混合固化剂与基础弹性体，搅拌2分钟。 
		注意：可通过调整此混合比例来调节聚合物的硬度。基础剂与固化剂的比例越高，所得聚合物越柔软。</li>
		<li>在真空室中脱气，直至所有气泡消失。</li>
		<li>将混合物倾倒至主模具中，形成约0.5 cm厚的层，注意避免产生气泡。</li>
		<li>在预热至70 °C的烘箱中烘烤混合物40分钟。 
		注意：如果PDMS块较厚，可能需要更长的固化时间（&#62;1 厘米）。每隔 5 分钟继续加热一次，直至完全固化。</li>
		<li>裁剪出聚合物的结构区域。使用PDMS打孔器在通道两端打孔。 
		注意：本方案中孔径设定为0.75 mm，可根据所需流速进行调整。PDMS通道可在干燥环境中长期保存，但使用前应进行清洁。</li>
		<li>清洁PDMS块的结构面。使用封口膜去除大颗粒污染物，依次用异丙醇和甲醇冲洗，重复冲洗3次，再用超纯水冲洗，最后用气流吹干表面。</li>
		<li>使用氧气或空气等离子体对PDMS进行等离子清洗。 
		注意：本方案中使用18 W空气等离子体。</li>
		<li>将经过等离子清洗的PDMS置于适当清洁的盖玻片上，于80 °C加热板上加热15分钟。 
		注意：可在PDMS块的侧面涂覆环氧树脂，以增强其与盖玻片的粘附性。</li>
		<li>插入合适尺寸的低密度聚乙烯（LDPE）管至孔中。将出口管连接至0.5 mL注射器。 
		注意：在本方案中，内径为 0.023 英寸的导管通过外径为 0.025 英寸的金属接头与 PDMS 连接。</li>
		<li>将进样管浸入溶液中，用注射器吸取所需体积的溶液，使溶液流入微通道。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 光学装置
<ol>
	<li>显微镜的改造（图1）
	<ol>
		<li>对TIRF显微镜进行改造以实现IRM成像13。将显微镜滤光轮中使用的50/50（反射率（R）/透射率（T））分光镜更换为10/90（R/T）分光镜。</li>
		<li>在相机与显微镜之间插入一个图像分光器。</li>
		<li>在图像分光器的滤光立方体中插入一个10/90（R/T）分光镜。在反射光路前放置一个600 nm长通滤光片，在透射光路前放置适当的荧光发射滤光片。 
		注：可使用不同R/T比例的分光镜来调节所收集的IRM和TIRF发射光的光强比例。</li>
		<li>根据制造商的说明对图像分光器进行校准，使TIRF和IRM信号在相机芯片上实现空间分离。 
		&#8203;注：由于典型荧光染料的TIRF信号远弱于微管的IRM信号，若两种信号重叠则TIRF信号将无法被检测，因此必须实现信号的空间分离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 成像动态微管和单个驱动蛋白分子
<ol>
	<li>表面功能化与钝化
	<ol>
		<li>将BRB80缓冲液（80 mM Na-PIPES，1 mM EGTA，1 mM MgCl2，用NaOH滴定至pH 7.8）注入反应室。</li>
		<li>将生物素抗体溶液用BRB80稀释至0.025 mg/mL后注入，并在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>用BRB80洗涤通道。</li>
		<li>注入F-127溶液（1% Pluronic F-127 (w/v) 溶于BRB80中，过夜溶解），孵育至少20分钟以实现表面钝化。 
		注：若使用易清洁盖玻片代替硅烷化盖玻片，则在室温下使用含2 mg/mL酪蛋白的BRB80溶液钝化，时间&#62;20分钟。</li>
		<li>用BRB80洗涤通道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像前准备
	<ol>
		<li>如需温度控制，请使用物镜加热器并将温度设定至所需值。 
		注：本实验方案中所有实验均在28 °C下进行。</li>
		<li>将样品置于显微镜载物台上，并打开落射照明光源（&#62;600 nm）以进行干涉反射显微镜（IRM）成像。 
		注：本实验方案中使用白色LED光源配合600 nm长通滤光片。</li>
		<li>将显微镜聚焦于样品表面，寻找靠近PDMS-溶液界面的正确焦平面。 
		注：在IRM成像中，通道内的水相区域应明显比PDMS聚合物区域更亮。</li>
		<li>选择通道中心附近的视野。</li>
		<li>在BRB80中配制0.1 µm荧光微球溶液（密度：109&#160;个微球/mL，相当于本实验所用微球的200倍稀释）。</li>
		<li>注入至少一个通道体积的微球溶液。</li>
		<li>通过IRM监测反应过程，观察微球逐渐&#34;沉降&#34;到表面。当达到所需微球密度时，用BRB80洗去多余微球。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生长生物素标记的鸟苷-5'-α,β-亚甲基二磷酸（GMPCPP）稳定微管种子
	<ol>
		<li>在0.6 mL离心管中，配制50 μL溶液，其中含1 mM GMPCPP、1 mM MgCl2和2 μM生物素化微管蛋白（标记化学计量比为5–10%），溶剂为BRB80。 
		注：通过将高密度生物素化微管蛋白与未标记的牛源微管蛋白按适当比例混合，可获得正确的标记化学计量比。</li>
		<li>先将溶液在冰上孵育5分钟，随后在37 °C孵育12.5分钟。 
		注：通过调节聚合时间可控制种子长度。</li>
		<li>加入100 μL室温BRB80以终止聚合反应。</li>
		<li>在室温下将溶液以126,000 × g离心5分钟（使用超速离心机）。用移液器弃去上清液，以去除未聚合的微管蛋白。 
		注：本实验方案中使用气动式超速离心机。</li>
		<li>向沉淀中加入200 μL室温BRB80，用移液器轻柔但彻底地重悬沉淀。建议使用剪去尖端的200 μL移液枪头，以减少对微管的剪切损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生长动态鸟苷二磷酸（GDP）-微管蛋白&#34;延伸段&#34; 
	注：种子将被固定在流动通道的抗生物素表面。动态的GTP/GDP&#34;延伸段&#34;将从固定种子的末端生长。
	<ol>
		<li>将种子用BRB80稀释20倍，然后注入反应室。</li>
		<li>通过IRM监测反应过程，等待种子逐渐&#34;沉降&#34;并结合到表面。当达到所需种子密度时，用BRB80洗去多余种子。</li>
		<li>配制微管延伸混合液：含12 μM未标记微管蛋白、1 mM GTP和5 mM二硫苏糖醇（DTT）的BRB80缓冲液。</li>
		<li>注入至少一个通道体积的延伸混合液，并确保反应温度为28 °C。</li>
		<li>等待微管延伸段随时间从种子上生长。 
		注：通常在不到20分钟内即可达到稳态长度。</li>
		<li>使用动态微管进行成像。如步骤3.5中对驱动蛋白-1所述，可在微管上添加并观察荧光标记的微管相关蛋白（MAPs）。 
		注：由于微管被固定在表面，可通过全内反射荧光显微镜（TIRF）轻松观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>驱动蛋白运动性检测 
	注：本步骤描述了一种在缩短的微管上观察运动性绿色荧光蛋白（GFP）标记的驱动蛋白-1的实验方案。一种与eGFP融合的截短型大鼠驱动蛋白-1（rKin430-eGFP）的构建体已如先前文献所述进行表达与纯化15,16。
	<ol>
		<li>配制运动缓冲液：含1 mM ATP和0.2 mg/mL酪蛋白的BRB80缓冲液。</li>
		<li>将驱动蛋白-eGFP用运动缓冲液稀释至10 nM。</li>
		<li>配制2倍浓度的氧气清除系统以防止氧化性光漂白（含80 mM葡萄糖、80 mg/mL葡萄糖氧化酶、32 mg/mL过氧化氢酶、0.2 mg/mL酪蛋白和20 mM DTT），并补充2 mM ATP。</li>
		<li>将10份氧气清除液、9份BRB80和1份10 nM驱动蛋白-eGFP混合，最终驱动蛋白浓度为0.5 nM。 
		注：总体积应至少为通道体积的1.5倍。</li>
		<li>在显微镜软件中设置成像参数。 
		注：本实验方案中，视频以10帧/秒采集，曝光时间为100 ms，激光强度约为0.05 kW/cm2。</li>
		<li>开始成像，并将驱动蛋白溶液注入反应室。</li>
		<li>测量完成后，录制一段短时间（约5秒）的视频，期间缓慢地以环形或横向移动载物台。将该视频的中值投影作为背景图像，并从原始数据中扣除该背景。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 图像处理与分析
注意：图像处理使用 NIH ImageJ2（imagej.nih.gov/ij/）完成。开发了一个宏来自动分割和对齐 TIRF 与 IRM 通道。该宏需要安装 GaussFit_OnSpot 插件（可在 ImageJ 插件仓库中获取）。
<ol>
	<li>在 ImageJ 中，通过点击 图像 | 图像堆栈 | Z 轴投影，从背景记录中创建中值投影。</li>
	<li>通过点击 处理 | 图像计算器，将中值背景投影从原始图像数据中减去。 
	注意：&#160;请确保勾选“32 位（浮点）结果&#34;选项。</li>
	<li>对于图像配准，选择靠近目标微管的一组微珠，并利用它们对 TIRF 和 IRM 图像进行对齐。</li>
	<li>对于该组中的每个微珠，使用多点选择工具标记其在 TIRF 通道中的大致位置，然后标记其在 IRM 通道中的对应位置。 
	注意：例如，如果有两个微珠（1 和 2），则多点选择将按以下顺序包含四个点：(1) TIRF 中的微珠 1，(2) IRM 中的微珠 1，(3) TIRF 中的微珠 2，(4) IRM 中的微珠 2。</li>
	<li>运行提供的 ImageJ 宏（ImageSplitterRegistration.ijm）。 
	注意：该宏自动执行以下步骤：i) 通过高斯拟合估算每个微珠的中心位置；ii) 对每个微珠，计算其在 TIRF 通道与 IRM 通道中中心位置之间的位移矢量；iii) 对所有微珠的位移矢量取平均值；iv) 将 TIRF 和 IRM 通道拆分为独立的图像；v) 根据步骤 iii 中计算出的平均位移矢量对 TIRF 图像进行平移；vi) 将 TIRF 和 IRM 图像叠加为一个多通道 .tiff 文件。</li>
</ol>

<ol><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Kuo, Y. -W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spastin+is+a+dual-function+enzyme+that+severs+microtubules+and+promotes+their+regrowth+to+increase+the+number+and+mass+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).</li>
<li>Hinrichs, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+diffuses+along+the+microtubule+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tau protein diffuses along the microtubule lattice.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).</li>
<li>Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herding+of+proteins+by+the+ends+of+shrinking+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%3A%22%5BJournal%5D)">Herding of proteins by the ends of shrinking polymers.</a> arXiv:. , (2021).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+dynamics+of+breakage+of+fluorescent+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules.</a> Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).</li>
<li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Taylor, R. W., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+RW+%22Interferometric+scattering+%28iSCAT%29+microscopy+and+related+techniques.+in+Label-free+super-resolution+microscopy%22">Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy</a>. Astratov, V. , Springer. Cham. 25-65 (2019).</li>
<li>Young, G., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy).</a> Annual Review of Physical Chemistry. 70 (1), 301-322 (2019).</li>
<li>Koch, M. D., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+and+bending+analysis+of+microtubules+by+ROCS+microscopy+and+optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).</li>
<li>Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+single+microtubule+dynamics+using+spatial+light+interference+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy.</a> ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).</li>
<li>Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+high-speed+wide-field+imaging+of+single+microtubules+using+interference+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy.</a> Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).</li>
<li>Mahamdeh, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+interference+reflection+microscopy+for+label-free%2C+high-speed+imaging+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520(2019).</li>
<li>Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfabrication in biology and medicine.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 1, 401-425 (1999).</li>
<li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).</li>
<li>Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fractional+steps+in+cargo+movement+by+the+collective+operation+of+kinesin-1+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).</li>
<li>Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+microtubules+and+associated+proteins+by+Simultaneous+Interference-Reflection+and+Total-Internal-Reflection-Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy.</a> arXiv. , (2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

研究微管相关蛋白（MAPs）对微管动态的调控通常需要同时对微管和MAPs进行成像。为此，通常采用TIRF等荧光显微镜技术。然而，这些方法受限于荧光成像的缺点，包括光漂白、光损伤以及需要荧光标记。无标记方法（如IRM）适用于微管的可视化，但无法对单个荧光分子进行成像。本方案结合了无标记的IRM成像与TIRF显微镜技术，以实现对动态微管和MAPs的同步成像。
IRM 实验装置采用发光二极管（LED）作为照明光源，并使用滤光片筛选出波长 &gt;600 nm 的光；而 TIRF 实验装置则使用 488 nm 激光器。我们使用了一种低成本的平板分光镜，将照明光反射至样品表面，同时将收集到的信号透射至探测器（图 1）。选用反射率为 10%、透射率为 90% 的分光镜，以最大程度减少单分子信号的损失。照明光强度损失 90% 的问题可通过提高照明激光器和 LED 的输出功率来补偿。
使用一个90/10（反射/透射）分束器和两个光谱滤光片（IRM使用600 nm长通滤光片，TIRF使用535/50 nm带通滤光片）实现信号的光谱分离。通过图像分光组件，将光谱分离后的IRM和TIRF信号投射到单个相机芯片的两个半区。采用90/10分束器会损失90%的IRM信号，但可通过增强LED照明光源的强度来补偿。此处也可使用二向色镜，以更高效地分离IRM和TIRF信号。实验中包含的荧光微珠可用于精确对齐TIRF与IRM图像，并作为物镜聚焦的参考依据。
本方案中最关键的光学元件是高数值孔径（NA）物镜。这不仅对于实现全内反射至关重要，而且有助于最大化收集效率和图像对比度。所获得图像的质量还取决于玻璃表面的清洁度，以及获取清晰背景图像以校正非均匀照明并去除静态特征的能力。对于反射式干涉显微成像（IRM），我们建议使用长波长照明（&gt;600 nm），以尽量减少对微管和蛋白质的光损伤。如果使用白色LED光源，这一点尤为重要，此时应加入长通滤光片以去除任何紫外光。
本方案可实现对动态微管的无标记、高速成像，同时对荧光标记的微管相关蛋白（MAPs）进行高分辨率可视化17。与通过滤光轮切换交替采集微管和MAPs图像的技术相比，该装置能够实现更高的帧率，因为它不依赖于滤光轮的物理旋转。与双色全内反射荧光（TIRF）成像技术相比，该方法所需的光学系统更为简单，并避免了对微管进行荧光标记的需要。该装置的主要局限性源于MAPs的TIRF成像：帧率受限于荧光染料的曝光时间，且荧光染料的光漂白仍可能发生。尽管如此，本方案在现有技术基础上有所改进，仅在必要时使用TIRF（即仅用于可视化MAPs而非微管），并在TIRF的限制范围内实现了尽可能高的成像速度。只有当微管和MAPs均通过干涉测量技术进行可视化时，才可能实现进一步的提升，但这需要使用金属纳米颗粒标记MAPs，而该方法本身存在局限性和实验挑战。
为了展示该技术的能力，我们通过干涉反射显微镜（IRM）和全内反射荧光显微镜（TIRF）同时观察了两种快速动态过程：微管的缩短以及荧光标记的驱动蛋白分子的行走。该技术此前已被用于观察痉挛蛋白（spastin）在缩短微管上的快速扩散5。除了应用于微管相关蛋白（MAPs）和微管之外，本实验方案还可用于在单分子水平上同时观察任何足够大、可通过IRM成像的生物大分子结构（如细胞膜或肌动蛋白丝）与荧光标记分子的相互作用。

全内反射荧光（TIRF）显微镜常用于单个荧光分子的可视化观察。与落射荧光成像相比，TIRF具有更优的背景抑制能力，可实现对单个荧光分子的高分辨率定位与追踪。因此，TIRF是观察荧光标记的微管相关蛋白的首选方法，并常用于微管的成像1,2。
为了研究微管相关蛋白（MAPs）对微管动力学的调控，通常需要同时对微管和MAPs进行成像。目前大多数实现该目的的方法成本高昂或存在技术缺陷。例如，双色全内反射荧光（TIRF）显微镜需要两台激发激光器和两台相机。除了设备成本较高外，使用独立相机还会带来帧同步和图像配准的问题。若采用旋转滤光立方体在连续帧之间物理切换激发激光器，则可避免对多台相机的需求3。在这种装置中，可使用单个相机芯片，使微管和MAPs的图像在帧之间交替出现。然而，该技术受限于滤光片切换速度，通常将帧率限制在每秒0.5帧以下3（fps）。如此低的帧率不足以解析快速动态过程，例如微管以最高达500 nm/s的速度发生缩短、驱动蛋白以约800 nm/s的速度行进，或MAPs扩散系数超过0.3 μm2/s的扩散行为4。当需要在每个通道中追踪两个运动目标之间的相对位置时，这一限制尤为突出，例如追踪MAP相对于运动中微管末端的位置变化5。
除了这些光学限制外，双色全内反射荧光显微镜（TIRF）还需要使用发射光谱足够分离的不同荧光染料对微管相关蛋白（MAPs）和微管进行标记。微管蛋白的荧光标记可能改变微管的动力学行为6，而荧光染料的光漂白问题则限制了成像速度7。由于上述问题，已发展出无需标记的成像技术来观察微管。这些技术包括干涉散射显微镜（iSCAT）8,9、旋转相干散射显微镜（ROCS）10、空间光干涉显微镜（SLIM）11以及干涉反射显微镜（IRM）12,13。这些方法能够实现快速、无标记的微管成像，避免了荧光成像的缺点，但无法用于单个微管相关蛋白（MAPs）的可视化。
在这些无标记技术中，反射干涉显微术（IRM）因其低成本以及对仪器要求较低而尤为突出。我们近期已发表了一项将IRM与商用全内反射荧光（TIRF）显微镜相结合的实验方案，可实现微管和荧光标记的微管相关蛋白（MAPs）在交替帧中的成像3,13。本文提出了一种改进该装置的实验方案，可在单个相机芯片上同时采集TIRF和IRM图像。该方案在激发光路中加入了一个低成本的光束分束器，从而可同时使用TIRF激光器和IRM的LED光源照射样品。通过改装的商用图像分束器将TIRF和IRM信号按光谱分离，并投射到同一相机芯片的两个半区。此外，我们还采用了微流控系统，可在成像过程中快速更换试剂。本方案详细描述了如何利用该装置对动态微管及其相关蛋白进行成像。通过首次可视化展示驱动蛋白-1（kinesin-1）在缩短微管上行走的过程，验证了该装置的性能，成像帧速率达到10 s-1。

<table><tbody><tr><td>10/90 (R/T) 分束器</td><td>Thorlabs</td><td>BSN10R</td><td>用于激发光路中的平面分束器</td></tr><tr><td>90/10 (R/T) 分束器</td><td>Thorlabs</td><td>BSX10R</td><td>用于图像分光器中的平面分束器</td></tr><tr><td>抗生物素抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3640</td><td>用于功能化表面以结合生物素化的微管</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FLAAS</td><td>用于配制运动缓冲液</td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>Newport</td><td>HPM535-50</td><td>硬膜带通滤光片，用于图像分光器中以成像GFP信号</td></tr><tr><td>生物素化微管蛋白</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333P-A</td><td>用于将微管成核点结合到流动通道表面</td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8654</td><td>用于阻断非特异性相互作用</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td>用于配制氧清除剂溶液</td></tr><tr><td>干燥室</td><td>Southern Labware</td><td>55207</td><td>干燥器用于脱气树脂</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>用于配制氧清除剂溶液</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>用于配制BRB80缓冲液</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>用于配制氧清除剂溶液</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7016</td><td>用于配制氧清除剂溶液</td></tr><tr><td>GMPCPP核苷酸</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td>用于稳定微管的聚合</td></tr><tr><td>图像分光器</td><td>Teledyne-Photometrics Imaging</td><td>OptoSplit II</td><td>图像分光器用于空间分离图像。购买时需确认与显微镜的兼容性</td></tr><tr><td>ImageJ2</td><td>NIH</td><td></td><td>用于图像分析</td></tr><tr><td>驱动蛋白</td><td></td><td></td><td>实验室自制（参见文中参考文献）</td></tr><tr><td>LDPE管</td><td>Thomas Scientific</td><td>9565S22</td><td>无毒低密度聚乙烯微孔管，用于液体转移</td></tr><tr><td>LED光源</td><td>Lumencor</td><td>Lumencor sola light engine</td><td>用于IRM成像</td></tr><tr><td>长通滤光片</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0600</td><td>硬膜长通滤光片。一片用作激发滤光片，另一片用于图像分光器中成像IRM信号</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td>用于配制BRB80缓冲液</td></tr><tr><td>显微镜物镜加热器</td><td>okolab</td><td>H401-T-DUAL-BL</td><td>通过加热物镜以保持样品温度恒定</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td>实验中使用的倒置显微镜</td></tr><tr><td>Na-PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2949</td><td>用于配制BRB80缓冲液</td></tr><tr><td>Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil 物镜</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>成像物镜的数值孔径为1.49</td></tr><tr><td>PDMS及固化剂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Sylgard 184 (24236-10)</td><td>用于构建流动通道</td></tr><tr><td>PDMS打孔器</td><td>World Precision Instruments LLC</td><td>504529</td><td>用于在PDMS上打孔</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>DPC-32G</td><td>空气等离子用于去除PDMS表面的有机污染物</td></tr><tr><td>泊洛沙姆407（商品名Pluronic F-127）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>用于通道表面钝化，以最小化非特异性结合</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td>用于配制BRB80缓冲液</td></tr><tr><td>稳定微管</td><td></td><td></td><td>实验室自制（参见文中参考文献）</td></tr><tr><td>台式超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>340400</td><td>用于离心沉淀微管成核点</td></tr><tr><td>TetraSpeck微球</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td>用作图像对齐的参考标准</td></tr><tr><td>Zyla 4.2相机</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2</td><td>科学级CMOS相机，参数如下：2048 × 2048像素（6.5 &amp;mu;m像素尺寸），量子效率72%，16位动态范围</td></tr></tbody></table>

同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

已有多种技术被用于直接观察细胞骨架纤维及其相关蛋白。全内反射荧光（TIRF）显微镜具有较高的信噪比，但存在荧光蛋白光漂白和光损伤的问题。无标记技术，如干涉反射显微镜（IRM）和干涉散射显微镜（iSCAT），可避免光漂白问题，但难以清晰地观察单个分子。本文介绍了一种将IRM与商用TIRF显微镜结合的实验方案，用于体外同时成像微管相关蛋白（MAPs）和动态微管。该方案可实现对MAPs与动态微管相互作用的高速观察。与现有的双色TIRF系统相比，本方法无需对微管进行标记，也无需额外的光学组件（如第二激发激光器），从而实现了优化。两个通道的图像均在同一相机芯片上采集，避免了图像配准和帧同步问题。本系统通过可视化单个驱动蛋白分子在动态微管上的运动过程进行了验证。

光学装置示意图如图1所示。IRM照明光和TIRF激发光通过一个10/90（R/T）分束器（BS1）被引导至物镜（100倍，NA：1.49）的后光阑。发射信号穿过同一分束器（BS1），经由镜子（M1）反射至图像分束器。图像分束器的组件（如图1中虚线框内所示）通过一个90/10（R/T）分束器（BS2）以及相应的光谱滤光片将IRM和TIRF信号分离。最终，分离后的图像被投射到相机芯片上以供成像。图像分束器的光路调节使得TIRF和IRM信号分别投射在芯片的两个半区。
在正确对准的显微镜中，相机图像应显示一个半分的图像，如图2所示。表面固定的微管应在IRM通道13中清晰可见，而荧光驱动蛋白应在TIRF通道中可见。
用于对齐和配准两个通道的微珠在TIRF图像中呈现为亮斑，在IRM图像中则呈现为暗斑。尽管微珠在原始数据中可见，但背景扣除显著提高了对比度（图2）。用于减法的背景图像是通过移动载物台记录的视频的时间中值图像。如实验方案所述，图像对齐是通过选择靠近感兴趣区域的一组微珠，并运行提供的宏（imageSplitterRegistration.ijm）来实现的。该宏将点拟合为高斯函数，并通过最小化各通道拟合中心点之间的平均距离来对齐图像。这一过程在图2中有所体现，图中显示了荧光微珠的良好对齐情况（TIRF通道中为绿色，IRM通道中为黑色）。
最后，通过观察单个驱动蛋白分子向微管的缩短端移动，展示了该同步成像系统的功能。图3 显示了标记eGFP的驱动蛋白分子（绿色）在缩短的微管（灰色）上移动的时空图。同时还展示了生成该时空图所用录像的一系列截图。
<img alt="用于微管运动研究的全内反射荧光显微镜装置；光学示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：同时进行干涉反射显微成像（IRM）与全内反射荧光成像（TIRF）观察驱动蛋白运动的光学装置示意图。 来自LED光源的落射照明光通过孔径光阑后，到达10/90（R/T）分光镜（BS1）。该分光镜将红色IRM照明光和488 nm TIRF激发光部分反射至物镜，以照射样品。来自样品的信号由同一物镜收集，并导向图像分束组件，在此通过90/10（R/T）分光镜（BS2）在空间上分离IRM和TIRF图像。信号在到达相机芯片前经过光谱滤光。缩写：IRM = 干涉反射显微术；TIRF = 全内反射荧光；LED = 发光二极管；ITIRF = TIRF照明；IGFP = GFP荧光；Iinc = IRM照明；Iref = 玻璃/水界面散射光；Iscat = 微管散射光；IIRM = IRM信号（Iref 与 Iscat 的干涉）；R/T = 反射/透射；LP600：长通滤光片（600 nm）；DM = 二向色镜；BS1 和 BS2 = 分光镜1和2；M1、M2、M3、M4 = 反射镜；BP535/50 = 带通滤光片（535/50 nm）；GFP = 绿色荧光蛋白；GMPCPP = 脱氧鸟苷5'-α,β-亚甲基二磷酸；GDP = 鸟苷二磷酸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="TIRF-IRM 相机成像过程，从原始图像到对齐图像，聚焦于背景扣除和显微镜分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：背景扣除与图像对齐。 TIRF（左半部分）和 IRM（右半部分）图像同时出现在同一相机芯片的两个半区上（相机图像）。通过时间中值背景扣除可增强微珠的对比度（背景扣除后图像），微珠在 IRM 图像中呈暗色，而在 TIRF 图像中呈亮色。基于选定微珠（白色矩形）的位置，通过平移实现 IRM 与 TIRF 图像的对齐（右侧）。比例尺 = 10 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微图像示意图；通过荧光显微镜随时间分析细胞运动。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：微管收缩过程中驱动蛋白运动的显微轨迹图与图像快照。 显微轨迹图（左侧）显示 eGFP-驱动蛋白-1（绿色）向微管的正端（深灰色）移动。右侧为相应时间序列的图像快照。白色箭头指示单个驱动蛋白-1 分子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
ImageSplitterRegistration 文件： <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/ImageSplitterRegistration.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们介绍一种实验方案，可同时实现干涉反射显微镜与全内反射荧光显微镜，用于动态微管及荧光标记的微管相关蛋白的同步成像。

已有多种技术被用于细胞骨架纤维及其相关蛋白的直接可视化。

该方法的意义在于，它能够以高帧率同时对无标记的微管和荧光标记的蛋白质进行成像。该技术的主要优势在于其实现简便，且对光学组件的要求极低。此外，该方法避免了对微管进行氟-4标记的需要。首先，按1:10的质量比将固化剂与基础弹性体混合，制备PDMS聚合物。混合两分钟，然后将混合物置于真空腔中脱气，直至所有气泡消失。随后，将混合物倾倒至主模具上，形成约0.5厘米厚的层，注意避免产生气泡，并将混合物放入预热至70摄氏度的烘箱中加热40分钟。然后，切下聚合物的结构区域，并使用PDMS打孔器在通道两端打孔。接着，清洗PDMS块的结构面。随后，依次用异丙醇和甲醇各冲洗三次，再用超纯水冲洗，最后吹干表面。接下来，使用氧气或空气等离子体对PDMS进行等离子清洗，并将清洗后的PDMS置于适当清洁的盖玻片上。在80摄氏度的加热板上加热15分钟。将合适尺寸的低密度聚乙烯管插入孔中，并将出口管连接至0.5毫升的注射器。然后，将进样管浸入溶液中，用注射器吸取所需体积的溶液，使溶液流入微通道。将样品置于显微镜载物台上，打开落射式照明光源以进行反射干涉显微成像。调节显微镜焦平面时，应在PDMS与溶液界面附近寻找合适的焦平面，并选择靠近通道中心的视野进行观察。接下来，用 BRB80 配制 0.1 微摩尔的荧光微球溶液，并至少注入一个微流控通道体积的微球溶液。通过 IRM 或 TIRF 监测反应过程。当微球达到理想密度时，用 BRB80 洗去多余的微球。将稀释后的种子流入反应室，并通过IRM监测反应过程。当种子密度达到预期时，用BRB80洗去多余成分。接着，配制微管延伸混合液，其中包含12微摩尔未标记微管蛋白、1毫摩尔GTP、5毫摩尔DTT的BRB80缓冲液。然后，在确保反应温度为 28 摄氏度的条件下，流入至少一个通道体积的延伸反应混合液。首先，在显微镜软件中设置成像参数。开始成像，并将驱动蛋白溶液流入样品腔室。然后，观察标记有GFP的驱动蛋白1所结合的微管去解聚现象。测量完成后，录制一段短视频，期间缓慢地以圆形或横向移动载物台。该视频的中值投影将用作背景图像，并从原始测量数据中减去。在 ImageJ 中，通过单击“Image”从背景记录创建中值投影。然后，选择“Stacks”选项，再单击“Z Project”。接下来，通过单击“Process”，然后选择“Image Calculator”选项，将中值背景投影从原始图像数据中减去，同时确保勾选 32 位浮点结果选项。进行图像配准时，选择靠近目标微管的一组微珠，并利用它们对TIRF和IRM图像进行对齐。对于该组中的每个微珠，使用多点选择工具在TIRF通道中标记其大致位置，然后在IRM通道中标记相应的位置。随后，运行提供的ImageJ宏程序。微珠在右侧的IRM通道中呈现为暗斑，而在左侧的TIRF通道中呈现为亮斑。通过定位部分微珠，校准程序可正确地将两个通道图像叠加。采用本方案还获得了EGFP标记的驱动蛋白分子向微管缩短端行走的显微动态图像（kymograph）。进行此操作时，选择高数值孔径的物镜非常重要，以实现全内反射，并最大限度地提高信号收集效率和图像对比度。该方法可用于对单个荧光分子进行高分辨率成像，同时观察那些尺寸足够大、可通过干涉反射显微技术（IRM）可视化的超分子结构，例如细胞膜或肌动蛋白丝。本实验方案还提供了一种易于调整的流程，可实现干涉反射显微（IRM）、全内反射荧光显微（TIRF）和落射荧光显微的任意组合同步成像。

simultaneous-interference-reflection-total-internal-reflection

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

同步干涉反射和全内反射荧光显微镜，用于动态微管和相关蛋白质的成像

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

全内反射荧光（TIRF）显微镜是一种强大的技术，可用于高对比度和高时间分辨率地观察靠近细胞表面的结构。我们展示了如何利用TIRF研究细胞壁包被的细菌和真菌细胞皮层中的蛋白质动态。...

使用全内反射荧光显微镜观察微生物皮层结构与动态

本视频介绍了TIRF技术，这是一种基于全内反射显微镜的方法，用于观察肌动蛋白和微管聚合的动态过程。该方法能够实现对肌动蛋白与微管偶联动态的高分辨率实时成像，对于理解细胞间相互作用至关重要。...

利用TIRF显微镜观察肌动蛋白与微管耦联动力学

在本视频中，我们介绍了干涉反射显微镜（IRM）技术，用于在适当缓冲液存在下，对盖玻片表面生长的微管进行可视化观察。当入射光照射时，盖玻片-缓冲液界面和缓冲液-微管界面均会反射光线，这些反射光相互叠加形成干涉图样，从而能够在明亮背景上以高对比度图像清晰显示微管结构。...

无需标记的微管动力学干涉反射显微成像

来源：Winkle, C. C., et al．利用联合方法定义质膜递送在轴突分支和神经元形态发生中的作用．J. Vis. Exp.

全内反射荧光显微镜用于胞吐事件的可视化

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

本方案旨在指导如何在标准荧光显微镜上实施干涉反射显微技术，用于体外表面实验中对微管进行无标记、高对比度、高速成像。...

无标记、高速微管成像的干涉反射显微镜技术实现

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

本方案旨在通过可视化动态微丝和微管提供操作指南 体外 全内反射荧光（TIRF）显微镜检测...

可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

学习同步干涉反射与全内反射荧光显微镜技术，用于动态微管及荧光标记微管相关蛋白的无标记高帧率成像。该方法操作简便，光学组件需求低，适用于细胞生物学研究。

同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

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