使用分泌型胚胎碱性磷酸酶报告基因测定法定量生物活性 I 型干扰素

0 views • 3:11 min • July 8th, 2025

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为了量化测试样品中的生物活性I型干扰素,例如干扰素-α和干扰素-β,取一个含有工程报告细胞的多孔板。这些细胞在干扰素-α和β诱导启动子的控制下表达分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。

添加含有未知 I 型干扰素浓度的测试样品。将一系列人 I 型干扰素浓度移液到其他孔中,这些孔充当标准对照。孵化。

测试孔中的 I 型干扰素与特定的细胞表面受体结合,激活 Janus 激酶。这些蛋白激酶磷酸化转录信号转导子和转录激活剂 STAT、蛋白质,它们二聚化并与特定的干扰素调节因子形成复合物。

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细胞核后,复合物与干扰素-α和β诱导启动子中的特定DNA序列结合,激活SEAP基因转录并产生SEAP酶,这些酶被分泌到培养基中。

含有SEAP的培养基转移到具有SEAP特异性底物的多孔板孔中。SEAP 水解粉红色底物,产生紫蓝色产品。

使用酶标仪测量产品在测试孔和标准孔中的吸光度,指示 SEAP 水平和 I 型干扰素浓度。

根据绘制的标准I型干扰素曲线,确定测试样品中的生物活性I型干扰素浓度。

要使用 HEK-Blue 干扰素 α/β 报告细胞测量生物活性 I 型干扰素,首先,在 96 孔平底板中以每孔 50,000 个细胞的密度将报告细胞接种至最终体积为 180 微升。然后,将 20 微升刚刚收获的共培养上清液一式两份添加到每个孔中。包括一组内标对照,并将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 18 至 22 小时。

为了确定从报告细胞释放的碱性磷酸酶的水平,将180微升QUANTI-Blue溶液添加到新的平底板的每个孔中。然后,向每个孔中加入20微升诱导的HEK-蓝色干扰素-α/β细胞上清液,并在37摄氏度下孵育板,直到在标准干扰素对照孔中出现颜色。

QUANTI-Blue溶液在酶存在下从粉红色变为紫蓝色。最后,使用分光光度计评估620至655纳米处分泌的碱性磷酸酶水平,并通过干扰素标准曲线的线性部分外推确定I型干扰素的浓度。

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Last updated: 4 July 2026