一种可视化肥大细胞中分泌颗粒胞吐作用的体外技术

以含有肥大细胞的腔室盖玻璃为例，肥大细胞是含有炎症介质的分泌颗粒免疫细胞，或 SG。

加入 IgE 抗体和 pH 敏感荧光报告基因，然后孵育。

抗体与肥大细胞上的Fc受体结合。报告基因通过胞饮作用内化，由此产生的内体与 SG 融合。

取出介质。添加含有多个IgE结合表位的抗原;将载玻片置于荧光显微镜下，并施加所需的激发波长。

SGs的酸性pH值会猝灭报告荧光。

抗原与细胞表面的 IgE 受体复合物结合，将它们交联起来。

抗原介导的受体聚集触发 SG 向质膜迁移。

血浆和 SG 膜上的 SNARE 蛋白介导膜融合和 SG 货物的排出，称为胞吐作用。

介质的较高pH值导致SG碱化，诱导报告基因恢复荧光。

传入的SG与膜熔合的SG熔合。第二个SG的碱化介导荧光恢复，确认复合胞吐作用。

10 微升细胞悬液加入装有新鲜 FITC-葡聚糖补充培养基的腔室盖玻片中，并培养 RBL 细胞过夜。首先，根据文本协议制备最终的 Tyrode 缓冲溶液。然后，在新鲜制备的缓冲液中制备 20 倍促分泌剂试剂。

氯化铵粉末溶解在 Tyrode 的缓冲液中，制成 400 毫摩尔的氯化铵溶液。接下来，从带腔室的盖玻璃中吸出培养基，并用 300 微升预热的 Tyrode 缓冲液代替。重复洗涤过程两次后，用 300 微升 Tyrode 缓冲液补充腔室。

接下来，将带腔室的盖玻片放入显微镜的培养箱室中，并确保腔室稳定。打开荧光光源，选择合适的荧光滤光片。一旦感兴趣区域在视野中间聚焦，关闭光源。

然后，打开 488 纳米激光器，发射范围约为 500 至 550 纳米。接下来，校准图像采集之间的时间间隔。将扫描方向设置为"双向"。不允许平均。打开针孔，并将分辨率设置为 512 x 512。

接下来，针对特定细胞类型或促分泌剂，在适当的持续时间内对细胞进行成像。然后，将促分泌剂溶液中的 16 微升添加到腔室中并继续拍摄。最后，为了确认FITC-葡聚糖在分泌颗粒中的存在和定位，轻轻地向腔室中加入16微升氯化铵溶液。