一种体外可视化肥大细胞分泌颗粒胞吐作用的技术

取一个含有肥大细胞的带腔盖玻片——肥大细胞是一种免疫细胞，其分泌颗粒（SGs）中含有炎性介质。

加入IgE抗体以及pH敏感型荧光报告分子，并进行孵育。

抗体与肥大细胞上的 Fc 受体结合。报告分子被内化 通过 胞饮作用，由此形成的内体与分泌颗粒融合。

移除培养基。加入含有多个IgE结合表位的抗原；将载玻片置于荧光显微镜下，并施加所需的激发波长。

SGs 的酸性 pH 值会淬灭报告分子的荧光。

抗原与细胞表面的IgE受体复合物结合，使其发生交联。

抗原介导的受体聚集触发应激颗粒向质膜迁移。

质膜和分泌颗粒膜上的SNARE蛋白介导膜融合以及分泌颗粒内容物的释放，该过程称为胞吐作用。

培养基的较高pH值导致应激颗粒（SG）碱化，从而诱导报告分子恢复荧光。

新形成的分泌颗粒与已融合到膜上的分泌颗粒发生融合。第二个分泌颗粒的碱化介导了荧光恢复，证实了化合物的胞吐作用。

取10微升细胞悬液加入含有新鲜FITC-葡聚糖补充培养基的腔室盖玻片中，将RBL细胞培养过夜。首先，根据文本方案配制终末Tyrode缓冲液。然后，用新鲜配制的缓冲液配制20倍浓度的分泌刺激剂试剂。

将氯化铵粉末溶解于Tyrode缓冲液中，配制400毫摩尔的氯化铵溶液。接着，吸除腔室盖玻片中的培养基，并替换为300微升预热的Tyrode缓冲液。重复洗涤过程两次后，向腔室中补充300微升Tyrode缓冲液。

接下来，将带腔室的盖玻片放入显微镜的培养箱腔室内，并确保腔室稳定。打开荧光光源，选择合适的荧光滤光片。当视野中央的感兴趣区域处于聚焦状态后，关闭光源。

然后，打开488纳米激光器，并在约500至550纳米范围内收集发射光。接着，校准图像采集之间的时间间隔。将扫描方向设置为“双向”。不进行平均处理。打开针孔，并将分辨率为512×512。

接下来，根据特定细胞类型或分泌刺激剂的要求，对细胞进行适当时长的成像。然后，向腔室中加入16 µL分泌刺激剂溶液，并继续拍摄。最后，为确认FITC-葡聚糖存在于分泌颗粒中及其定位情况，轻轻向腔室中加入16 µL氯化铵溶液。