评估抗体对热带念珠菌生物膜影响的体外测定

取一个含有真菌热带念珠菌的微孔板。

细胞分泌 Sap2，这是一种蛋白水解酶，可切割一种称为 Msb2 的跨膜糖蛋白，去除其抑制结构域。

这会诱导真菌粘附在底部并长成酵母和丝状形式的微菌落。细胞分泌可溶性成分和生物聚合物，启动生物膜形成。

将含有 Sap2 特异性抗体的血清样品添加到选定的孔中，并在黑暗中孵育。

抗体与 Sap2 结合并中和其活性，阻碍细胞活力和生物膜成熟。

在未经处理的孔中，生物膜成熟成细胞和细胞外基质的致密网络。

吸出液体，清洗生物膜，然后风干板。加入显色底物，并在黑暗中孵育。

活细胞利用膜结合氧化还原酶将底物还原为有色产物。

转移有色上清液并读取吸光度。

血清处理孔中的吸光度较低表明抗体介导的生物膜抑制。

无菌RPMI1640 MOPS 培养基中制备热灭活血清样品的连续稀释液。将 100 微升选定的血清稀释液添加到 96 孔微量滴定板的每个孔中。

在第 10 列中，仅添加仅真菌阳性对照的 RPMI1640-MOPS 培养基。向第 11 列中的所有孔中加入 1 至 50 稀释的血清，作为无真菌加血清阴性对照。用盖子和铝箔盖住板后，将板在37摄氏度下孵育24小时。

第二天，使用多通道移液器小心地吸出血清后，轻轻敲击倒置的板以去除任何残留的血清。重复PBS洗涤3次，并在生物安全柜内在室温下风干板30分钟，以干燥任何多余的PBS。

然后，将 25 毫克 XTT 溶解在 50 毫升过滤灭菌的乳酸林格氏液中。将 10 毫升分装在单独的管中。用铝箔盖住，在零下80摄氏度下存放。接下来，将 8.6 毫克甲萘醌溶解在 5 毫升丙酮中，将 50 微升分配到 100 个单独的微管中后，将等分试样储存在零下 80 摄氏度。

取XTT10毫升，加入甲萘醌1微升，得到1微摩尔工作液。在96孔微量滴定板的每孔中加入100微升XTT甲萘醌溶液。接下来，用盖子和铝箔盖住板后，将板在黑暗中在37摄氏度下孵育两个小时。最后，将每个孔中的 80 微升有色上清液转移到新鲜的 96 孔板中，并在 490 纳米处读取板。