一种用于评估抗体作用的体外检测方法 Candida tropicalis 生物膜

取一个含有真菌 Candida tropicalis 的微孔板。

细胞分泌一种蛋白水解酶Sap2，该酶可切割一种称为Msb2的跨膜糖蛋白，去除其抑制性结构域。

这会诱导真菌附着在底部，并生长形成酵母形态和丝状形态的微菌落。细胞分泌可溶性组分和生物聚合物，启动生物膜的形成。

向选定的孔中加入含有 Sap2 特异性抗体的血清样本，并在避光条件下孵育。

这些抗体与 Sap2 结合并中和其活性，从而阻碍细胞存活和生物膜的成熟。

在未处理的孔中，生物膜成熟为由细胞和细胞外基质构成的致密网络。

吸去液体，清洗生物膜，并将培养板风干。加入显色底物，在避光条件下孵育。

具有活性的细胞利用膜结合的氧化还原酶将底物还原为有色产物。

转移有色上清液并测定吸光度。

血清处理孔中吸光度降低表明抗体介导的生物膜抑制作用。

用无菌 RPMI1640 MOPS 培养基对热灭活的血清样本进行系列稀释。向 96 孔微量培养板的每个孔中加入 100 微升选定稀释度的血清。

在第10列中，仅加入RPMI1640-MOPS培养基作为真菌单独生长的阳性对照。在第11列的所有孔中加入1:50稀释的血清，作为无真菌但含血清的阴性对照。用盖子和铝箔包裹培养板后，在37°C下孵育24小时。

第二天，使用多通道移液器小心吸去血清后，轻敲倒置的培养板以去除任何残留的血清。用 PBS 洗涤三次，然后在生物安全柜内室温下将培养板静置干燥 30 分钟，以去除残留的 PBS。

然后，将25毫克XTT溶解于50毫升经滤膜除菌的乳酸林格液中。分装至多个独立试管中，每管10毫升。用铝箔包裹，于-80°C保存。接着，将8.6毫克甲萘醌溶解于5毫升丙酮中，分装至100个独立的微量离心管中，每管50微升，并将分装样品于-80°C保存。

取10毫升XTT，加入1微升甲萘醌，配制成1微摩尔的工作液。每孔加入100微升XTT-甲萘醌溶液至96孔微孔板中。接着，用盖子和铝箔包裹微孔板，于37摄氏度避光孵育2小时。最后，将每孔中的80微升显色上清液转移至新的96孔板中，在490纳米波长下读取吸光度。